博士（水 産科学） サノヾロイ
学 位 論 文 題 名
ウ イ チ ュ ウ ラ ダ
Biochemical study on denaturation mode of myosin and
actin in frozen fillet of catfish Clar 幽SJ 刀 aCr 〇 C9p カa 丿uSX
（ナマズ凍結フイレ中でのミオシンおよびアクチン変性様式に関する生化学的研究）
Introduction
学位論文内容の要旨
As protein resource, fish have been playing a very important role traditionally for peoples in Asian countries. Aquacultures of marine fish and culture freshwater fish have been very important in these areas. In Thailand, there are various fish have been cultured in inland traditionally for a domestic and local consumption. Hybrid catfish (Clarias macrocephalus x Clarias gariepinus), rather than domestic one is the most abundantly cultured. Economically the fish culture is important because frozen fillet and frozen mince are exported to Western countries especially to United State of America. However, there is little information on the properties of muscle protein, myosin, especially on its biochemical functions and stability. The information on the stability and denaturation of myosin of the fish would be valuable in the quality evaluation of the filet. Tilapia is another important fish species cultured in Thailand, and properties of its myosin is well characterized, especially its stability. In the dissertation myofibrils were mainly used as a model material for studying the properties of catfish myosin.
After investigation on the thermal denaturation of catf:ish myosin, myosin denaturation furing the frozen storage was also studied. Moreover, myofibrils were replaced by meat itself for obtaining the information on myosin denaturation in frozen fillet.
Materials and Methods
Hybrid catfish (Clarias macrocephalus x Clarias gariepinus), Hybrid tilapia ( Oreochromis niloticus x Oreochromis mossambicus) and American catfish ( Clarias gariepinus) were the samples for this work. A majority of the research was conducted with myofibrils suspended in 0.1 M NaCl, pH 7.5 because the material is considered as a model material of meat, and because the preparation of myofibrils is easy to prepare. Heating and frozen storage at various temperatures are the method to induce denaturation. Meat itself was also used as the last stage of the research. Myosin denaturation was monitored by employing established severalindices, Ca2+‑ATPase inactivation, loss of salt‑solubility, aggregate formation as studied by ammonium sulfate fractionation, and myosin head (S‑l) and tail (rod) denaturation mode as studied by chymotryptic digestion.
Results and Discussions Chapter1
Thermal stability of catfish myosin in isolated form and in myofibrils (stabilized form by F‑actin binding) was indistinguishable from corresponding preparations of tilapia. This is reasonable because catfish and tilapia are cultured under the same conditions especially high water temperature (25‑ 29aC throughout a year). It was also found that both myosin preparations are equally stabilized by F‑actin. However, chymotryptic digestion revealed different denaturation pattern between two species of fish myofibrils. A quick denaturation of rod than S‑l was the pattern of catfish, while the pattern of tilapia myofibrils was opposite. It was concluded that catfish myosin in myofibrils was characterized by a quick denaturation of tail region.
Chapter2
To understand the different patterns obtained, myofibrils were heated by changing the conditions. The conditions were arranged by considering myosin filament structure because the rod denaturation detected by chymotyrptic digestion was detecting myosin filament structural change. The most effective and easy factor that can change filament structure was pH, namely myosin forms rigid and strong filament at acidic conditions, and oppositely forms fragile and weak filaments at alkaline pH. As expected, pH change for heating significantly affected rod denaturation without affecting on S‑l denaturation. Consequently, S‑l and rod denaturation pattern was pH dependent in addition to fish species dependent. Comparing the patterns as affected by pH, catfish myofibrils required lower pH by l unit to have a similar pattern given for tilapia myofibrils. Thus, fragile filament structure for catfish myosin filament was proved. The conclusion was confirmed by the chymotryptic digestion of the unheated myofibrils at varied pH. Cleavage at HMM/LMM junction became obvious at pH 8 for catfish but the site was weLl protected for tilapia.
Chapter3
Structural difference of myosin tail was compared with isolated rod and its inner subfragments (Subfragment‑2, S‑2, and light meromyosin, LMM). Unfolding profiles of rod upon raising temperature for two were very similar to each other. LMM from two species of fish showed the single unfolding peak at the same temperature. Meanwhile, S‑2 preparations from both two fishes gave two unfolding peaks. The peak found at low temperature was the same as found with LMM, additionally another unfolding peak was found at much higher temperature.
It was demonstrated that S‑2 region consisted of two regions with a slight different stability.
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Chapter4
Myosin and actin denaturation during the frozen storage of myofibrils were compared between catfish and tilapia. Myosin denaturation rate in myofibrils was found to be storage temperature dependent, the lower the temperature the slower the denaturation. Salt‑solubility was kept high for both species. A very slow denaturation of rod portion relative to S‑l portion was the common pattern obtained. These were completely different from the patterns obtained in heating myofibrils. A surprising finding was that actin denatures very quickly for both preparations. The rate was greater than that for myosin.
Myosin and actin denaturation in frozen stored meat was finally investigated. For analyzing myosin and actin denaturation, meat had to be converted into quantitative material. The procedures to convert frozen Surimiinto homogenate were successfully applied for the purpose.
As established by the study with myofi̲brils, ATPase inactivation proceeded slowly when stored at lower temperature such as ‑400C than at ‑lOoC. However, ATPase inactivation in meat was very slow compared with one in myofibrils. Moreover, no actin denaturation was detected at any storage temperatures. These two showed that myofibrils cannot be used as a model material for meat, especially prediction.of myosin denaturation extent in meat from the study with myofibrils is impossible. From the results obtained, the most sensitive index to detect myosin denaturation was ATPase inactivation, which was not the fastest in thermal denaturation process.
Actin denaturation was not detected in the heated myofibrils, which was the same as found with heated meat. Myofibrils can be used as model material for thermal denaturation.
Quality evaluation of frozen fillet has been an important subject from scientifically and economically. There are several established indices to access the quality such as drip content, color of dark meat, texture, and bad smell. An attempt was made to establish the method to evaluate the quality by studying myosin denaturation with frozen fillet. The proposed procedures to evaluate the quality of frozen meat are the preparation of homogenate from the meat and its Ca‑ATPase measurement. Combination of other well established indices and ATPase activity measurement is strongly recommended. Fundamental experiments are always important for the information on the prediction of shelf‑life of fish fillet. The present results clearly showed that its quality of frozen fillet can be kept high when stored at ‑200C. Trimming catfish meat to shape the fillet produces small pieces of meat. The meat can be stored frozen for the production of value‑added meat‑based‑products such as fish ball, fish sausage, fish hams fish burgers and extruded products.
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学位論文審査の要旨
学 位 論 文 題 名
Biochemical study on denaturation mode of myosin and
actin in frozen fillet of catfish Clanas macrocephalus コ く Clarias gare 倒口uS
（ナマズ凍結フイレ中でのミオシンおよびアクチン変性様式に関する生化学的研究）
ア ジア の 国 々 で は伝 統 的 に 魚 肉 はタ ン パ ク 質 源と し て 古 く から 重 要 な 地 位を占 めてき た。 さらに 安定 な 供 給 の ため の 養 殖 も 贐ん で あ り 、 大陸 内 部 で は ナマ ズ や テ ィ ラ ピア な ど の淡 水魚養 殖が重 要とさ れて き た 。 現 在の タ イ 国 で は、 そ の 成 長 が速 い こ と 、 肉質 が 好 ま し い ニと 、 魚 肉の 幽収率 が高い などか ら、
品 種 改 良 がさ れ た 炎 雑 種が 中 心 と し て養 殖 さ れ て いる 。 本 論 文 で は国 内 消 費ば かりで なく、 凍結フ ィレ に 加 工 さ れ米 国 な ど に 輸出 さ れ て い るナ マ ズ に 注 目し た 。 こ の よ うに 重 要 魚種 ではあ るが、 魚肉の 主要 成 分 で あ る魚 肉 タ ン パ ク質 に 関 す る 研究 報 告 が ほ とん ど な い 。 そ こで 、 研 究成 果があ る程度 蓄積さ れて い て 、 同 じよ う に 重 要 魚種 で あ る 養 殖テ ィ ラ ピ ア を対 照 に し な が ら、 ナ マ ズの ミオシ ンの特 性、特 に変 性 特 性 を 明ら か に し よ うと し た 。 最 終的 に は 、 凍 結フ ア レ 中 の ミ オシ ン お よび アクチ ン変性 の解析 から 品 質 評 価 の方 法 を 提 案 する ニ と を 目 的と し た 。
調 製 し た ナ マ ズ ミ オ シ ン のATPase失 活 の 比 較 か らテ ィ ラ ピ ア から の も の と 同じ 熱 安 定 性 を示 す こ と を 見 出 し た。 ま た 、 魚 肉中 の 状 況 に 想定 さ れ る ア クチ ン結 合に よる安 定化も100倍 程度で 同じ であっ た。
し か し 、 筋肉 の モ デ ル 試料 で あ る 筋 原線 維 を 加 熱 した と き の ミ オ シン 変 性 の解 析から 、ナマ ズでは ミオ シ ン 尾 部 での 変 性 が テ ィラ ピ ア に 比 べ顕 著 で あ る こと を 見 出 し た 。ニ の 原 因が ナマズ ミオシ ンの形 成す る フ ィ ラ メン ト が 脆 弱 であ る ニ と を 、フ ア ラ メ ン 卜の 条 件 を 変 え て加 熱 す る実 験（溶 解試料 、pHを 変え た 試 料 ） など か ら 明 ら かに し た 。 ナ マズ ミ オ シ ン 尾部 を 単 離 し て その 原 因 を探 ろうと したが 、安定 性は 同 じ で 両 者に 差 は 認 め られ な か っ た 。
加 熱変 性 の 結 果 に基 づ き 、 凍結 貯蔵 中の変 性を筋 原線維 をモデ ルに 貯蔵温 度を変 えて行 った 。する と、
・ ミ オ シ ン変性 様式は 加熱とfま 大きく 異なり 、し かも、 ティラ ビアと の違 いも検 卅され ないよ うに変 化し
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樹
彦 史
範
宏 仁
久 祐
尚
伯 野
合 澤
佐 今
川 埜
授 授
授 授
教
教 教
教 准
査 査
査 査
主 副
副 副
た。 す な わ ち 、 両者 で ミ オ シ ン尾 部 の 変 性 が頭 部 に 比 べ 非常 に 緩 や か に 進行 し 、 ナ マ ズで 認 めら れた 急 激な 尾 部 の 変 性 は認 め ら れ な くな っ た 。 さ らに 、 加 熱 で は認 め ら れ な い 現象 と し て ア クチ ン の著 しい 変 性が 進 行 す る 事 実を 見 出 し た 。筋 原 線 維 は 筋肉 中 の 構 造 を維 持 し て い る ため 、 そ の モ デル と して 広く 使 用さ れ 、 多 く の 成果 が 蓄 積 さ れて い る 。 そ こで 、 こ の 筋 原線 維 で 得 ら れ た凍 結 変 性 に 関す る 成果 が魚 肉 の凍 結 に そ の ま ま適 応 さ れ る のか に っ い て 検討 し た 。 魚 肉中 の ミ オ シ ン ン、 ア ク チ ン 変性 を 検出 する 確 立さ れ た 方 法 が なか っ た の で 、変 性 ミ オ シ ンを も す べ て 回収 で き る よ う 魚肉 を 均 一 に ホモ ジ ナイ ズし た 懸 濁 液 を そ の まま 用 い る 試 料の 調 製 法 を 確立 し た 。 最 も 変性 が 進 行 し やす い ， 10℃ で 魚 肉 を 貯蔵 し て も 、ATPase失 活 は6か 月 に か け て 緩 や か に 進 行 し 、2週 間 で 大 き な 変 性 が 検 出 さ れ た 筋 原 線 維 と異 な った 。 そ れ よ り 低温 で の 貯 蔵 では そ の 半 年 間で ほ と ん ど 変性 が 認 め ら れ なか っ た 。 こ れは ナ マズ でも テ イラ ピ ア で も 同 じで あ り 、‑ 20℃ 以 下で 貯 蔵 す れ ば、 少 な く と も 半年 程 度 は ミ オシ ン 変 性 な しに貯 蔵で きる こ と を 明 ら かに し た 。 こ の結 果 は 現 実 的に 用 い ら れ てい る フ ア レ の 貯蔵 条 件 と 矛 盾せ ず 、そ の理 由 を科 学 的 に 証 明 した こ と に な る。 さ ら に 、 変性 が 検 山 さ れた − 10℃で の 魚肉お よび筋 原線維 の変 性を比 較す る と 、 フ ア レで は ア ク チ ン変 性 が 全 く 起こ ら な ぃ 相 違点 が 見 出 さ れ た。 す な わ ち 、筋 原 線維 を凍 結 変性 の モ デ ル と して 用 い て に は限 界 が あ る こと を 示 し た 。し か し 、 塩 溶 解性 が 筋 原 線 維で も ほと んど 認 めら れ な い こ と は魚 肉 の 凍 結 でも 同 じ で あ り、 そ の 理 由 はミ オ シ ン 尾 部 の変 性 が 進 行 しな い から であ る こと を 明 ら か に した 。 筋 原 線 維と 魚 肉 で 大 きな 違 い が あ るこ と が 示 さ れ たの で 、 加 熱 の場 合 にも 心配 と なっ た 。 そ こ で 、魚 肉 そ の も のと 筋 原 線 維 を同 じ 条 件 で 加熱 し 、 ミ オ シ ン、 ア ク チ ン 変性 の 様了 を確 認 し た 。ATPase失 活 速 度 に 両 者 で 大 き な 違 い は認 め ら れ な かっ た の で 、 凍結 と は 異 な っ た。 し か し 、 魚 肉で 加 熱 し た 場 合は 、 ナ マ ズ 筋原 線 維 で 特 徴的 に 兌 出 さ れた 急 激 な ミ オ シン 尾 部 の 変 性は 起 こら ず、 魚 肉で は ミ オ シ ン 尾部 は 加 熱 で も安 定 に 保 た れて い る と 推 定し た 。 ま た 、 ティ ラ ピ ア 肉 の加 熱 も同 じで あ り、 筋 原 線 維 で 両者 の 変 性 様 式の 違 い は 消 失し た 。 な お 、加 熱 で は 筋 原 線維 で も ミ オ シン 変 性が 起き る 範囲 で は 全 く ア クチ ン 変 性 が 認め ら れ な か った の で 、 筋 原線 維 巾 の ア ク チン が 特 徴 的 に不 安 定に なる と 考え ら れ た 。 最 終的 に フ ィ レ を用 い た 加 熱 ・凍 結 実 験 か ら、 古 く か ら 用 いら れ て い る ミオ シ ン変 性指 標 で あ るATPase失 活 が 最 も 先 に 低 下 し 、 魚 肉 の品 質 評 価 に は感 度 の 良 い 品質 評 価 の 指 標 であ る と 結 論 し た。
こ れ ら の 研究 成 果 は 、 アジ ア で 重 要 な 資源 で あ る 淡 水魚 、 特 に ナ マズ 肉 の 凍 結 保蔵 、 品 質 維持 のため に大 き な 貢 献 を する ニ と が 期 待さ れ る 。 よ って 、 審査 員亠 同は申 請者が 博士 （水産 科学） の学位 を授 与 され る 資 格 が あ るも の と 判 定 した 。
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