金沢医科大学 機能再建外科学 石川県河北郡内灘町大学1-1 平成19年２月13日受理 諸 言 栄養素，特に糖質が経口的に摂取された場合，血糖刺激のみの 場合に比してインスリン分泌がより増強されることが知られて おり，インクレチン効果と呼ばれる。例えば，ブドウ糖を経口 的に負荷し，同等の血糖曲線が得られるよう経静脈的に負荷し た場合と比較すると，前者でより多くのインスリンが分泌され る (1)。この効果は，主として2種類の消化管由来ホルモン，グ ルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド (glucose-dependent insulinotropic polypeptide: GIP) とグルカゴン様ペプチ ド-1 (glucagon-like peptide-1: GLP-1) によるものであることが明 らかにされている。両者はともに，膵β細胞に対してブドウ糖 濃度依存性にインスリン分泌を促進し，分泌後は体内に遍在す るdipeptydil peptidase-4 (DPP-4) により速やかに分解される (2)。 近年，2型糖尿病患者の爆発的な増加が世界的な問題とされ ている。この2型糖尿病の治療薬としてDPP-4阻害薬やGLP-1受 容体作動薬が広く使用されているが，これらの薬剤開発のきっ かけは，2型糖尿病患者でインクレチン効果が減弱していると の知見に基づいている。従来その原因として，GIPは分泌が保 たれているもののβ細胞への作用が低下しており，GLP-1はβ 細胞への作用は比較的保たれているものの分泌が低下している ことにあるとされてきた (3, 4)。しかし最近，糖尿病患者にお けるGLP-1分泌低下については否定的な見解も多い (5)。 オリジナルなインクレチン効果の評価方法としては，先に述 べたような血糖曲線を等しくする経口および経静脈ブドウ糖負 荷試験が用いられている (isoglycemic法)(1, 6)。この方法を実 施するには2日間を要し，手技的にも困難であることから，その 代用として高血糖グルコースクランプ下での経口糖負荷試験が 利用されるようになってきた (7-15)。クランプ法を用いること で血液循環を介してβ細胞に到達するブドウ糖濃度は一定とな り，インクレチン効果によるインスリン分泌をブドウ糖刺激に よるものから区別することが可能となる。しかし，これらの2つ の異なる方法を用いて得られる結果は必ずしも一致しない (1, 9, 16-20)。Isoglycemic法では被験者毎に個別の血糖曲線が定ま るのに対し，クランプ法では全例を通して強制的に一定の血糖 値が負荷される。すなわち，両評価法ではブドウ糖刺激による
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型糖尿病でのインクレチン効果減弱は膵β細胞グルコース応答性の
低下を反映する：高血糖グルコースクランプ下経口糖負荷での成績から
伊 藤 弘 樹，中 川 淳，古 家 大 祐
要 約：【目的】2型糖尿病においてインクレチン(incr)効果が減弱しているかどうか，高血糖グルコースクラ
ンプ下に経口糖負荷試験を用い，負荷後インスリン (IRI)増加量の絶対値および総分泌量に対する相対比の2つ
の指標に基づき検証する。加えてこれら指標によるincr効果の規定因子を探索する。【対象と方法】2型糖尿病
男性患者6名，非糖尿病対照男性6名に高血糖クランプを行った (目標血糖11.1 mmol/Lまたは空腹時血糖＋5.6
mmol/Lの高い方)。グルコース注入開始60分後に経口マルトース負荷 (0.5 g/kg) を行い，210分まで5-10分間
隔でIRI，Cペプチド，total GIP，total GLP-1を測定した。【結果】血糖は糖尿病，対照各々 12.8, 11.2 mmol/Lにク
ランプされた。統計学的に外れ値となる著明なIRI高値の糖尿病1例を認め，群間比較では糖尿病群より除外し
た。IRI分泌は高血糖のみで直線的に増加を続けるため，経口負荷前濃度推移より推定基準値を設定，そこから
の増加でincr効果を評価した。IRI増加量の曲線下面積(AUC)絶対値は糖尿病群で有意に低かったが [7.2 vs.
23.5 分×nmol/L (0-45分)]，総分泌量AUCに対する相対比では有意差を認めなかった (48.2 vs. 60.4%)。単および
重回帰分析で，増加量AUC絶対値は経口負荷前IRI増加量と，相対比はGIP増加量と有意相関が認められた。【結
論】2型糖尿病でのincr効果減弱はβ細胞グルコース応答性低下の反映に過ぎず，incr効果に糖尿病特異的な障
害は存在しない。
キーワード： インクレチン効果，高血糖グルコースクランプ，グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド (GIP)， グルカゴン様ペプチド-1 (GLP-1)，2型糖尿病 金沢医科大学大学院医学研究科内分泌代謝制御学 石川県河北郡内灘町大学1-1 平成29年 1 月30日受理インスリン分泌量の意義が異なっている。したがって，仮にイ ンクレチン効果によるインスリン分泌増加が絶対値として等し くとも，インクレチン効果をインスリンの総分泌量に対する増 加量の相対比として定義すると結果が異なるのかも知れない。 本研究においては，高血糖グルコースクランプ下経口糖負荷 によるインクレチン効果評価法を，インクレチン効果としてイ ンスリン増加量の絶対値と，総分泌量に対する相対比の二つの 定義を用いて検証すること，さらにその結果を用いて，2型糖尿 病患者において本当にインクレチン効果が減弱しているか否か を明らかにし，減弱しているならばその規定因子は何かを探索 することを目的とした。 実 験 方 法 1．対象 2型糖尿病男性患者6名，年齢を一致させた非糖尿病対照男性 6名を対象とした (表1)。糖尿病患者は全例，75 g経口ブドウ糖 負荷試験 (OGTT) とHbA1cに基づき2年以内に診断を受けてお り，抗糖尿病薬物療法なしに良好な血糖コントロールを示して いた。ボランティアとして募集した対照者は2型糖尿病家族歴 を有さず，HbA1c 5.4%未満であること，またはHbA1c 5.4-5.9% の場合にはOGTTが正常であることで非糖尿病と判断した。糖 尿病患者，対照者それぞれに高血圧および脂質異常症治療中1 名，脂質異常症治療中1名が含まれていたが，他の疾患を有する ものはいなかった。被験者は全員，3ヶ月以上にわたり一定の 体重を維持していた。研究は金沢医科大学倫理委員会の承認を 受け (No. 187)，参加者全員より書面でのインフォームドコンセ ントを得た。 2．高血糖グルコースクランプ 一夜絶食後，人工膵臓 (モデルSTG-22，日機装，東京) を用い て高血糖グルコースクランプを実施した。血糖モニター用，血 液サンプル採取用，グルコース注入用の静脈留置カテーテル (BD InsyteTM, 20G×30 mm, Becton Dickinson Medical，Singapore)
を，それぞれ左前腕，右手背，右上腕橈側皮静脈に留置した。動 脈化静脈血を採取するため，両前腕は持続的に約45℃に加温し た。空腹時採血の後，20%グルコース静脈内注入を開始した。 13分間のプライミング期間に引き続き，目標血糖値に到達しそ れを維持するため，人工膵臓によりグルコース注入率 (glucose infusion rate: GIR) が調節された (21)。クランプ目標血糖値は
11. 1 mmol/Lまたは空腹時血糖＋5.6 mmol/Lのいずれか高い値 とした。グルコース注入開始60分後，被験者はマルトース 0.5 g/kg (20%溶液) を経口摂取，210分まで5-10分間隔で採血を行っ た。採取血液は乾燥採血管および氷冷したEDTA・2Na含有採血 管へ移し，4℃で1,900×g，10分間遠心し，分離した血清および 血漿を-40℃で保存した。 3．測定項目 人工膵臓（グルコースオキシダーゼ法による血糖値を1分毎に 表示する）により測定された連続した血糖値5回分の幾何平均を 血糖値として利用した。人工膵臓は1分毎にGIRを自動的に調 節するため，GIRとして5回のGIR記録の算術平均を用いた。イ ンスリンとCペプチドの血清中濃度は化学発光酵素免疫測定法 (それぞれLumipulse® PrestoTMインスリン, Lumipulse® PrestoTM
C-ペプチド，富士レビオ(株)，東京）で測定した。EDTA血漿か
ら は 抽 出 操 作 な し で 酵 素 結 合 免 疫 吸 着 法 (enzyme-linked immunosorbent assay: ELISA) によりtotalインクレチンを測定 した。Total GIPおよびtotal GLP-1の測定は，それぞれHuman GIP (Total) ELISA KIT (Millipore, St. Charles, MO, USA)，EDITM
Total GLP- 1 ELISA Kit (Epitope Diagnostics, San Diego, CA,
USA) を用い1検体2重測定で行った。それぞれのアッセイ内/ アッセイ間変動係数は1.9-7.4/9.4%，11.6-13.4/14.8%であった。 4．解析 今回の検討でも予備実験で確認したが，高血糖クランプ中， インスリンおよびCペプチド濃度は直線的に増加を続けること は，以前より報告されている (20, 22)。この増加を考慮してイ ンスリンとCペプチドの基礎値が“動的に変化する”よう，実験 毎にグルコース注入開始後50-65分のデータより最小2乗法を用 いて外挿した推定基準値を算出し，実測値と推定基準値の差を インスリン・Cペプチドの増加量とした。また，経口負荷後か らインスリン・Cペプチドの増加開始までの時間が被験者毎に 異なっていたため，インスリンが推定基準値より初めて10％以 上を超えた時点をインクレチン効果による増加反応の開始とみ なし，その5分前を相対時間#0分として時間経過を同期，補正 した。Total GIPとtotal GLP-1レベルに関しては，55分と60分の 平均値を基礎値とした。 データは，平均±標準偏差として表示した。糖尿病患者と対 照者2群間での比較は，F検定で等分散であれば対応のないt検 定を，異分散ならMann-Whitney U検定を用いた。グループ毎 の時系列は反復測定分散分析で検定した。インクレチン効果と その規定因子候補との関係は単変量線形回帰分析にて解析後， 重回帰分析を行った。p値0.05未満を有意差ありとした。 結 果 1．グルコースクランプ状況と血中インスリン・Cペプチド濃度 空腹時血糖は糖尿病患者で非糖尿病対照者に比し有意に高 かった (表1，図1A)。血糖値はグルコース注入開始後60分以内 にクランプされたが，目標値が空腹時血糖に応じて設定されて いたため，クランプ血糖値は糖尿病群で高値であった。マル トース経口負荷後60分間にわたり，糖尿病群でのみ目標値より 0. 6- 2. 3 (中央値1.5) mmol/Lの血糖上昇が認められた (時間-群 交互作用p＜0.0001)。 GIRは実験全体を通じて対照群で糖尿病群に比して高値で あった (図1B)。マルトース投与前，対照群GIRは糖尿病群の1.5-2 倍必要であり，マルトース投与後徐々に増加したのに対し，糖 尿病群ではマルトース投与後最初の60分間で低下，その後さら に30分以上かけて低下前レベルに復した (時間-群交互作用p＜
性別 (男/女) 年齢 (歳) BMI 糖尿病歴 (年) [中央値(範囲)] 降圧薬使用者 脂質改善薬使用者 HbA1c (%) 空腹時血糖 (mmol/L) 空腹時インスリン (pmol/L) HOMA-IR HOMA-β
ARB, アンジオテンシンII受容体拮抗薬; CCB, カルシウム拮抗薬; 統計処理は2群が等分散の場合は対応のない t 検定，
異分散の場合はMann-Whitney U検定 (†) を用いた 6 / 0 54.6±10.1 25.9±2.9 2 (0.3 – 2) 1 (ARB + CCB) 2 (スタチン) 6.5±0.30 6.95±0.82 54.0±29.1 2.42±1.42 47.2±25.0 糖尿病患者 6 / 0 53.1±7.3 22.5±1.2 － 1 (ARB + CCB) 2 (スタチン) 5.5±0.08 5.26±0.40 39.0±22.4 1.36±0.90 60.6±20.9 非糖尿病対照者 0.77 0.024 0.0036† 0.001 0.34 0.15 0.34 p値 表1．対象者背景 図1．糖尿病患者(●)および非糖尿病対照者(○)における高血糖グルコースクランプ下経口糖負荷試験時の血糖(A)，グルコース注入率(GIR; B)，インスリン(IRI; C)，Cペプチド(CPR; D)の推移 各群6名の被験者よりなるが，C，Dでは例外的な糖尿病患者1名（本文結果参照）が糖尿病群より除外され，シンボルのない実線で表示され ている。また，高血糖クランプ自体で上昇するインスリン，Cペプチド濃度の増加を考慮した外挿法による推定基準値（本文実験方法4． 解析参照）の平均が，糖尿病群および対照群，それぞれ点線および破線の直線で示されている。
0.0001)。この事実は，対照群では消化管からのグルコース吸収 を処理してなお余りある血糖降下機構が作動したのに対し，糖 尿病群では吸収されたグルコースが目標血糖値維持に寄与し， 一定時間，外部からの注入が不要になったことを意味している。 空腹時インスリン濃度は両群間に差を認めなかった (表1，図 1C)。グルコース注入開始60分後，インスリンレベルは空腹時 の数倍に増加した。糖尿病患者中1例で，60分および経口負荷 後のインスリン濃度が著しく高く，Grubbs-Smirnov棄却検定に より外れ値と判断される症例が存在した (図1C, D，図2，図4A, B，シンボルのない実線；図3，図4C-F，図5，◆または◇)。今後， 糖尿病・対照2群間での比較においては，この例外的な糖尿病症 例を糖尿病群より排除した。経口マルトース負荷後，インスリ ンは推定基準値 (図1点線および破線の直線) を超えて増加し た。糖尿病群でのインスリン反応は対照群に比して有意に低値 であった (時間-群交互作用p＝0.0045)。Cペプチド濃度につい ても，インスリンと同レベルの有意差を示す同様のパターンが 認められた (図1D)。 2． 時間経過補正後のグルコースクランプ状況と血中インスリ ン・C ペプチド増加量 高血糖クランプ自体による濃度上昇を考慮した推定基準値か らのインスリン・Cペプチド増加量を求めた後，経口負荷によ るインスリン反応開始時間で同期させた時間経過補正を行っ た。血糖 (図2A) およびGIR (図2B) に実質的な変化はなかった が，糖尿病群における経口マルトース負荷後のGIR低下は時間 経過補正前に比してより急峻であり，0に近い状態が約30分に わたり持続していた。 時間経過補正後，インスリン (図2C) およびCペプチド (図 2D) 増加量は，対照群で相対時間#25分に急峻なピークを示し， その後も増加が維持された。一方，糖尿病群での上昇は緩やか でピークも低く，#120分には推定基準値レベルにまで低下し た。糖尿病患者のインスリン分泌の特徴として経口糖負荷時の インスリン初期分泌の低下が知られており，日常臨床において もOGTTの30分値を用いたインスリン分泌指数が広く利用され ている。このような，限定された時間経過中でのみ観察され得 図2．糖尿病患者(●)および非糖尿病対照者(○)における時間経過補正後の高血糖クランプ下経口糖負荷試験時の血糖(A)，グルコース注 入率(GIR; B)，インスリン増加量(ΔIRI; C)，Cペプチド増加量(ΔCPR; D)の推移 経口糖負荷に反応したインスリンの有意な上昇時点を基準に時間経過を補正した（本文実験方法4．解析参照）。増加量は外挿法による推 定基準値からの増加を示す。例外的な糖尿病患者1名はシンボルのない実線で表示されている。
図3．曲線下面積(AUC)に基づくインスリン(IRI; A, B, E, F)およびCペプチド(CPR; C, D, G, H)反応の糖尿病患者・非糖尿病対象者間での比較 A-Dでは増加量AUCの絶対値を，E-Hでは増加量AUCの総分泌量AUCに対する相対比を示す。A, C, E, Gはインクレチン効果発現の前期 45分間，B, D, F, Hは後期75分間。例外的な糖尿病患者1名は群間比較より除き，◆または◇で表示してある。群間比較は2群が等分散の 場合は対応のないt検定，異分散の場合はMann-Whitney U検定 (†) を用いた。
図4．糖尿病患者(●)および非糖尿病対照者(○)における経口糖負荷後のtotal GIP(A, C, D)およびtotal GLP-1(B, E, F)反応
A, Bでは時間経過補正後の経口糖負荷前値からの増加量の推移を，C-Fでは増加量AUCの2群間の比較を示す。C, Eは前期45分間，D, F
る特徴をも確実に検出するため，対照群のインスリンが一つの 山をなし，糖尿病群におけるGIR抑制期間（消化管からのグル コース吸収時間に相当）とも一致する#45分までをインクレチン 効果発現時間の前期，その後の75分間を後期として以下の検討 を行うこととした。
3． 増加量 AUC 絶対値および増加量 AUC/ 総分泌量 AUC 相対 比による経口糖負荷後インスリン・C ペプチド反応の比較 インクレチン効果の指標として，インスリン (図3A, B, E, F) およびCペプチド (図3C, D, G, H) の推定基準値からの増加量に つき曲線下面積 (AUC) を求め，糖尿病・対照両群間で比較し た。増加量AUCを用いたインクレチン効果の定義として，増加 量AUC絶対値自体 (図3A-D)，および総分泌量AUCに対する相 対比 (図3E-H)，2通りを考えた。また，インクレチン効果発現 時間の前期 (図3A, C, E, G)，後期 (図3B, D, F, H) に2分して検 討した。反応前期では，絶対値でみると糖尿病群低値の明らか な有意差が認められるのに対し，相対比でみると両群間の差は 消失した。反応後期でも同様の傾向が認められた。 4．高血糖クランプ下経口糖負荷後のGIP・GLP-1 反応 空腹時total GIP濃度は糖尿病患者/対照者で8.9±3.2/9.1±3.6 pmol/L，グルコース注入により6.1±1.6/5.8±2.3 pmol/Lへと有 意に低下した (時間p＝0.0005)。空腹時total GLP-1濃度は5.9± 3.7 (3.1-12.1, 中央値4.6)/7.4±6.5 (2.8-17.2, 中央値3.7) pmol/L， グルコース注入後も4.9±2.3 (3.2-6.3, 中央値3.3)/7.4±6.2 (1.9-16.9, 中央値4.8) pmol/Lと有意な変化は認められなかった。 経口マルトース負荷後のtotal GIP (図4A, C, D) およびtotal
GLP-1 (図4B, E, F) については，前値からの増加量を用いて検討 した。増加量の時間経過補正後の推移では (図4A, B)，GIPで両 群間に差を認めなかった。GLP-1では時間経過に伴う変動が糖 尿病群でのみ認められ，対照群でのGLP-1反応は検出できな かった(時間-群交互作用p＜0.0001; 糖尿病群/対照群での時間 p＜0.0001/p＝0.13)。増加量AUCでは (図4C-F) GIP・GLP-1と もに，インクレチン反応前期・後期を通して両群間での有意差 は認められなかった。
図5．経口糖負荷後(前期45分間)インスリン増加量に対するtotal GIP反応(A, D)，total GLP-1反応(B, E)，および経口糖負荷前インスリン増 加量(ΔIRI; C, F)の相関
経口負荷後インスリン増加量として，A-Cでは増加量AUCの絶対値を，D-Fでは総分泌量AUCに対する相対比を用いている。●，糖尿病 患者；◆，例外的な糖尿病患者；○，非糖尿病対照者。全被験者を通しての有意相関を点線で示す。
5．インクレチン効果とその規定因子候補間での回帰分析 インクレチン効果を規定する因子を検討するため，表1に挙 げた各種項目，GIP・GLP-1増加量AUC，および経口負荷前イン スリン分泌を独立変数として単変量線形回帰分析を行った。簡 便のため前期45分間での成績のみを図5に示すが，後期75分間 においてもほぼ同様の成績が得られた。経口負荷後インスリン 増加量AUC絶対値に対しては，糖尿病患者・対照者全被験者を 通じてGIP増加量とグルコース注入開始後60分の経口負荷前イ ンスリン増加量が有意な相関を示し，特に後者の相関は極めて 強かった（経口負荷前インスリン分泌として60分インスリン絶 対値，Cペプチド絶対値・増加量も有意相関を示したが，インス リン増加量の相関係数が最も高かった）。全被験者より例外的 な糖尿病症例1例を除くと，GIP増加量との有意相関は消失した が，経口負荷前インスリン増加量とはなお強い相関が認められ た (r＝0.71, p＝0.014)。一方，インスリン増加量AUC相対比に 対しては，GIP増加量のみが有意に相関（例外的糖尿病症例を除 いてもr＝0.72, p＝0.012），負荷前インスリン増加量との相関は 認められなかった。表1各種項目との相関は，絶対値・相対比と もに認められなかった。 以上の単回帰の成績を参考として，重回帰分析を行った (表 2)。インスリン増加量AUC絶対値を従属変数とした場合，全被 験者および例外的症例を含めた糖尿病群内でGIP増加量と経口 負荷前インスリン増加量とが有意な独立変数として採択された （全被験者では例外的症例を除くと負荷前インスリンのみ；p＝ 0. 0072）。相対比を従属変数とすると，単回帰同様，負荷前イン スリン増加量との相関は認められず，例外的症例を含めた糖尿 病群内でGIPおよびGLP-1増加量が有意な独立変数として採択 された［全被験者で例外的症例を除くとモデル4は有意 (p＝ 0.049)，GIP増加量も採択される (p＝0.019)］。 考 察 本研究では，2型糖尿病患者と非糖尿病対照者において，高血 糖グルコースクランプ下経口糖負荷試験を用いてインクレチン 効果を評価した。インクレチン効果により分泌されるインスリ ン増加量の絶対値は糖尿病患者で顕著に低下していたが，総分 泌量に対する相対比は両群間で差がなかった。インスリン増加 量の絶対値は高血糖クランプのみによるインスリン分泌量と強 い相関を示したが，相対比ではこの相関が完全に消失した。し たがって，インスリン増加量の絶対値を指標とした場合の2型 糖尿病におけるインクレチン効果の減弱は，膵β細胞のグル AUC[ΔIRI(#0–#45)]絶対値を従属変数とした場合 モデル１ 自由度調整決定係数(p値) 回帰係数(p値); AUC[ΔGIP(#0–#45)] AUC[ΔGLP-1(#0–#45)] ΔIRI(60') モデル２ 自由度調整決定係数(p値) 回帰係数(p値); AUC[ΔGIP(#0–#45)] ΔIRI(60') AUC[ΔIRI(#0–#45)]/総分泌量AUC相対比を従属変数とした場合 モデル３ 自由度調整決定係数(p値) 回帰係数(p値); AUC[ΔGIP(#0–#45)] AUC[ΔGLP-1(#0–#45)] ΔIRI(60') モデル４ 自由度調整決定係数(p値) 回帰係数(p値); AUC[ΔGIP(#0–#45)] AUC[ΔGLP-1(#0–#45)] †, 例外的な糖尿病患者1例を除いた場合; *, 有意なp値 0.765 (0.0019)* 6.29 (0.062) -0.664 (0.98) 74.4 (0.0039)* 0.791 (0.0004)* 6.31 (0.043)* 74.5 (0.0017)* 0.205 (0.20) 0.009 (0.054) -0.0002(1.00) 0.010 (0.70) 0.279 (0.093) 0.009 (0.041) 0.004 (0.91) (n=12) 0.982 (0.011)* 8.07 (0.059) 24.3 (0.22) 72.0 (0.029)* 0.969 (0.0026)* 9.48 (0.032)* 59.3 (0.021)* 0.937 (0.038)* 0.004 (0.22) 0.086 (0.023)* 0.032 (0.12) 0.811 (0.038)* 0.008 (0.030)* 0.066 (0.040)* (n=6) 糖尿病患者 0.974 (0.10) 3.19 (0.19) 22.1 (0.094) 5.30 (0.052) 0.392 (0.30) 3.83 (0.50) 39.4 (0.17) 0.989 (0.068) 0.008 (0.12) 0.088 (0.038) 0.050 (0.089) 0.705 (0.15) 0.004 (0.62) 0.070 (0.10) (n=5)† － (0.71) 3.04 (0.73) -27.9 (0.79) 56.4 (0.41) 0.022 (0.45) 4.61 (0.40) 57.5 (0.30) 0.425 (0.32) 0.007 (0.39) -0.060 (0.49) -0.028 (0.58) 0.535 (0.15) 0.007 (0.26) -0.057 (0.44) (n=6) 全 例 対照者 表２．経口糖負荷後(前期45分間)インスリン増加量に関する重回帰分析
コース応答性低下の反映に過ぎず，増強作用としてのインクレ チン効果に糖尿病特異的な障害は存在しないと考えられた。こ の事実を実験成績そのものより導き出した研究はこれが初めて であり，糖尿病臨床におけるインクレチン関連薬の使用基準に も影響する重要な知見と考えられた。 高血糖グルコースクランプ下経口糖負荷によるインクレチン 効果の評価は，Andersenら (22) の報告以来，多くの研究者によ り利用されている (7-15, 20, 23)。今回は，高血糖クランプ自体 によるインスリン分泌増加を考慮した外挿法による推定基準値 を採用，さらに効果発現までの被験者間の時間差を消去するた め時間経過補正を導入した。インクレチン効果発現までの時間 差はおそらく胃排泄の差によるものと思われ，その延長がGIP やGLP-1の反応を減弱させるとの報告がある (7-9, 13)。今回， 胃排泄時間は測定していないが，糖尿病群で経口負荷後にGIR が一律ほぼ停止状態になったことを時間経過補正で明瞭に確認 できた事実は，糖吸収の時間差，胃排泄時間の関与を示唆する。 また，インクレチン効果によるインスリン分泌が対照者で比較 的早期に急峻なピークを示すのに対し，糖尿病患者では緩徐な 上昇しか示さないことも時間経過補正により明らかとなった。 一方，今回の糖負荷量は少量であり，糖尿病患者の血糖コント ロールは極めて良好であるにもかかわらず，糖尿病患者で血糖 値が目標値を超えるとの問題にも遭遇した。同様の現象は先行 研究においても報告されており (7, 8, 10, 15)，今回の血糖クラ ンプの不完全さが結果に重大な影響をおよぼすまでとは考えら れないが，コントロール不良の糖尿病患者を対象とする場合， 本法が利用できない可能性が指摘できる。 2型糖尿病におけるインクレチン効果の減弱はNauckら (1) によって初めて報告され，最近でも他のグループによって確認 されている (16-19)。本研究においてもインクレチン効果によ るインスリン分泌増加量は，糖尿病患者6例中5例までは非糖尿 病対照者と比して明らかな低下を示したが，1例のみ対照者を 超える著しいインスリン高反応を示す症例が存在した。この症 例はBMI (31.5)およびHOMA-IR (4.79)が最も高く，統計学的に インスリン分泌が糖尿病としては有意な外れ値であったため， 糖尿病・対照2群間の比較では糖尿病群より排除した。統計学的 な意義を考えれば，対象症例数が増えようとも本例のような例 外的症例の存在は限られているだろうが，2型糖尿病患者を一 律に把握することに対する疑問を呈するものかも知れない。 GIPおよびGLP-1については，血中消失時間の著しく短い活 性型ではなく，DPP-4による分解産物をも同時に測定するtotal GIP，total GLP-1を測定した。活性型に比しより総分泌量を反 映することを期待したが，totalでの測定を用いても対照者では 末梢血中GLP-1の有意な変動を検出することはできなかった。 十二指腸内グルコース注入実験で2 kcal/分以下の注入速度では GLP- 1が反応しないことが報告されており (24)，クランプへの 影響を抑えるために選ばれた今回の糖負荷量が，GLP-1分泌刺 激としては少なすぎたとも考えられる。さらに高血糖下では食 後のGLP-1反応が低下するとの報告もある (8, 13)。一方，糖尿 病患者においてはGLP-1の上昇が確認され，GIPについては糖 尿病・対照両群でともに前値から有意に上昇していた。いずれ にせよ，糖尿病患者におけるGLP-1分泌低下は確認されず，近 年のメタ解析 (5) の結果と一致した。 前述のように，2型糖尿病患者におけるインクレチン効果の 減弱についてはNauckら (1) をはじめとして多くの報告がある が (16-19)，これらの研究ではインクレチン効果評価法として isoglycemic法が使用され，インクレチン効果を“経口および経 静脈ブドウ糖負荷時のインスリン分泌量AUCの差の，経口負荷 時分泌量AUCに対する比率”として定義している。高血糖クラ ンプ下経口刺激による評価法を用いた研究においても，インク レチン効果は相対比として扱われるが（この場合，“経口負荷後 インスリン反応の前値からの増加量AUCの，総分泌量AUCに 対する比率”），それらの結果はNauckらとは異なるのみならず， 互いに部分的な違いを見せている。すなわち，Elahiら (20) に よれば糖尿病患者では非糖尿病者に比してインクレチン効果に 低下傾向はあるものの有意差はなく，Salehiら (9) は糖尿病患 者でインスリン反応の絶対値は有意に小さいが，相対比として のインクレチン効果は非糖尿病者と完全に等しかったとしてい る。Woerleら (14) は，高血糖クランプ下で十二指腸への栄養素 注入を行い，インスリン分泌の絶対値は糖尿病患者に比し健常 者で終始高値を示したものの，相対的なインクレチン効果はイ ンスリン分泌の第1相では糖尿病患者で大きく，第2相では等し かったと報告している。本研究ではインクレチン効果を前期・ 後期に2分，インスリンおよびCペプチド増加量AUCの絶対値 と，総分泌量AUCに対する相対比との二つの指標を用いて検証 した。増加量絶対値ではインスリン，Cペプチドともに前期・後 期を通して，糖尿病群で対照群に比して有意な減弱を認めた。 一方，相対比では両群で実質的に大きな差は認められなかっ た。この相対比による評価からは，本研究もまた，糖尿病患者 におけるインクレチン効果は減弱していないとするクランプ法 を用いた研究の一つに加えられる。増加量の基準として血糖ク ランプ自体による上昇を考慮した推定基準値を採用した点，本 研究の成績がより正確であると考える。 単回帰および重回帰分析を用いてインクレチン効果を規定す る因子を探索した。インクレチン効果の指標をインスリン増加 量AUCの絶対値とした場合，経口糖負荷前インスリン増加量に 強く規定されたが，相対比による評価では負荷前インスリンと の有意相関は認められなかった。経口負荷前インスリン濃度は 推定基準値のAUCと比例し，推定基準値AUCはインスリン総 分泌量AUCに含まれるため，相対比では計算式中に独立変数が 組み込まれることとなり，相関が消失する。経口糖負荷前イン スリン増加量は，クランプによる高血糖のみに反応したインス リン分泌でありβ細胞のグルコース応答性を反映する。した がって，β細胞機能を排除し増強作用としてのインクレチン効 果の本質を評価するには，相対比に基づく評価が適切と考えら
れる。また，糖尿病の有無でβ細胞グルコース応答性は大きく 異なることより，相対比で負荷前インスリン増加量との相関が 消失した事実は，先の糖尿病・対照両群間の比較で，絶対値で認 められた有意な低下が相対比で消失した事実と同一の現象と考 えられる。さらに，糖尿病におけるインクレチン効果の減弱が 主としてisoglycemic法を用いた研究を中心として報告されてい ることについては，評価時の血糖値が被験者毎に異なり（特に糖 尿病・非糖尿病間で大きく），血糖値に応じてβ細胞グルコース 応答性が異なってくるためであるとも考えられる。2型糖尿病 でのインクレチン効果減弱はβ細胞グルコース応答性の低下を 反映しているに過ぎないとする考えは，MeierとNauck (25) に より理論的仮説として提唱されているが，実際の成績に基づき 検証した報告はなく，本研究がなし得た重要な成果である。実 臨床においては，インクレチン関連薬の使用に際してスルホニ ル尿素薬との併用が極めて有効なことや，糖毒性解除後に効果 が著しく改善することが知られているが，今回の知見は，こう した事実に対応するものと思われる。なお，この流れからすれ ば前述の例外的糖尿病症例も必ずしも例外ではなく，著しいイ ンスリン抵抗性のためβ細胞機能の過剰亢進にもかかわらず糖 尿病を発症したと考えられる。 一方，インクレチン効果とGIP増加量とは，絶対値・相対比い ずれを用いても単回帰で有意相関が認められ，重回帰でも同様 の傾向が認められた。健常者では外因性に投与されたGIPと GLP- 1はそれぞれの生理学的濃度において同等のインスリン分 泌効果を示すと報告されているが (26)，糖尿病ではGIPによる インスリン分泌効果の障害が認められるとされる (4)。しかし 今回の成績では，糖尿病患者・対照者全例を通しての線形関係 を認めることより，両群でβ細胞のGIP感受性が異なるとは考 え難い。今回の糖尿病患者が，罹病歴の短くコントロール良好 な症例であったためかも知れない。 以上，高血糖グルコースクランプ下経口糖負荷試験を用いて インクレチン効果を評価した。インスリン分泌増加量の絶対値 および総分泌量に対する相対比の2通りの指標と，それらに対 する規定因子の検討より，2型糖尿病におけるインクレチン効 果の減弱はβ細胞グルコース応答性の低下を反映したに過ぎな いことが明らかとなった。例外的な糖尿病症例の存在も含め て，今後さらなる研究が必要だが，糖尿病症例では経口負荷後 のクランプ血糖値の維持が困難であるなど，本法によるインク レチン評価に改善の余地があることも示唆された。 利益相反の開示 著者の一人 (DK) は，製薬関連企業等から研究費 (奨学寄附 金，受託研究，共同研究) および講演料の受け入れ，コンサルタ ント契約を行っているとともに，製薬関連企業からの寄附金に よる寄附講座に所属している。 科大学糖尿病・内分泌内科学講座の諸先生方に感謝します。なお， 本研究には金沢医科大学特別奨励研究(B)(PR2012-06; 代表者HI) お よび金沢医科大学アシストKAKEN (K2011-6, K2012-6; 代表者AN) からの助成を受けた。 文 献
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