バイオセラミックス合成における全反射減衰-赤外スペクトルと多変量解析 を用いたリン酸カルシウム相転移の評価法

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総説

バイオセラミックス合成における全反射減衰-赤外スペクトルと多変量解析を用いたリン酸

カルシウム相転移の評価法

Evaluation of phase transition in bio-ceramic synthesis; attenuated total reflection - infrared spectra and multivariate analysis for calcium phosphate

東京理科大学薬学部1)_{, 徳島大学大学院薬科学教育部}2)_{, 徳島大学大学院医歯薬学研究部}3)

大塚 裕太1)_{, 伊藤 丹}2)_{, 竹内政樹}3)_{, 田中秀治}3)

Yuta OTSUKA1)_{, Akira ITO}2)_{, Masaki TAKEUCHI}3)_{, Hideji TANAKA}3) 1) _{Faculty of Pharmaceutical Sciences, Tokyo University of Sciences} 2) _{Graduate School of Pharmaceutical Sciences, Tokushima University} 3) _{Institute of Biomedical Sciences, Tokushima University}

Corresponding Author: Yuta OTSUKA

Faculty of Pharmaceutical Sciences, Tokyo University of Sciences, 2641 Yamazaki, Noda, Chiba, 278-8510, Japan

e-mail: [email protected]

Accepted for publication October 10, 2019 Abstract:

The purpose of this review is to clarify the rapid self-setting reaction of apatite cement (SSAC) consisting of tetracalcium phosphate (TeCP) and dicalcium phosphate dihydrate (DCPD) by ombining attenuated total reflection Fourier transform infrared spectroscopy (ATR-IR) and multivariate analysis. The ATR-IR spectra of the sample showed characteristic phosphoric acid peak due to crystalline transformation from TeCP and DCPD into hydroxyapatite (HAp). Multivariate analysis results indicated that HAp was formed by precipitation and re-dissolution of TeCP and DCPD in the samples. In the case of HAp crystallization with amino acids, serine and phosphoserine were adsorbed onto HAp seed crystals and inhibit their crystallization was indicated. It is concluded that the It is concluded that the electrostatic interaction between seed HAp crystal and amino acids has to be considered for developing drug delivery system.

Journal of Bio-Integration 10 (1): 2-13, 2020 1. 緒言 高齢化時代の到来とともに骨粗しょう症の患者 は増加の一途をたどり，現時点で 1300 万人と推 定されている[1]。骨粗しょう症患者は，骨強度の 低下から軽い転倒などでも骨折しやすい状態にあ り，その対策は社会的にも重要な課題となってい る。このため，骨充填剤等に用いる代替医療用バ イオセラミックの開発需要はますます高まってい る。バイオセラミックスにはジルコニア ZnO2，ア ルミナ Al2O3，シリカ系材料，アパタイトなどがあ る。アパタイトとは，M10(ZO4)6X2の組成式で表さ れる鉱物の総称である。この式の M，Z，X には 様々な元素が当てはまり，合成条件に依存した多 くのアパタイトが存在する[2]。中でも難溶性の塩 基性リン酸カルシウムであるハイドロキシアパタ イト(Ca10(PO4)6(OH)2: HAp)は生体親和性が高い 無機材料としてよく知られている。哺乳類の骨格 成分では約 60%以上の HAp が存在し，多くの元 素の貯蔵庫としての役割も併せ持つことが知られ ている。M2+_{サイトには Ca}2+_{をはじめとした二価} のカチオンである Mg2+_，Mn2+_，Pb2+_，Sr2+_など， さらに一価や三価のカチオンも置換しうる。Z サ イトまたは ZO4には Al3+_，Si4+_，CO32-_{など，X サ} イトにはハロゲン系アニオンや水酸基が入りうる。 Fig. 1 に Hap [3] と、X サイトが置換されたクロロ アパタイト(Ca10(PO4)6Cl2: ClAp) [4] の結晶構造 を示した。また，結晶構造ファイルからシミュレ ーションされた，これら 2 つのアパタイト粉末 X 線回折パターンを Fig. 2 に示す。HAp と ClAp の 回折パターンを比較すると，低角度側では 2θ =

3 10.8 における(100) のピークと 2θ = 10.8 におけ る(101) のピークの強度の違いが特徴的に示され ている。アパタイトの生体内での分解性や機械的 強度は組成比と結晶性によって決まるため，これ らを目的に応じて制御することが無機材料開発で は重要となる。我々はこれまでに，塩化物イオン を置換させたアパタイトの合成方法による結晶性 の違い[5]や亜鉛イオンや塩化物イオンを置換させ たアパタイト[6]について報告してきた。本稿では アパタイト系バイオセラミックスの合成と結晶成 長について再考し，これらの合成メカニズムや非 破壊分光分析法による合成物のキャラクタリゼー ションについて研究例を紹介する。

Fig. 1. HAp(a)[2]と ClAp(b)[3]の結晶構造

Fig. 2. シュミレーションされた Hap [2] および ClAp [3] の粉末 X 線回折パターン

4 成長の経時的評価方法

Chow [7] は tetracalcium phosphate (Ca4(PO4)2O: TeCP) と dicalcium phosphate (CaHPO4･2H2O: DCPD)をカルシウム/リンの比率 (C/P)を 1.67 に調製し，練合することによって HAp が自発的に相転移することを self-setting apatite cement (SSAC)として報告している。この SSAC は簡便で迅速に HAp を合成でき，焼結工程が必要 ないことから医薬品[8]や DNA 等[9]を含ませるこ とができる。ドラッグデリバリーシステム(DDS) 用基材としての利用が期待されている。Miyamoto ら[10]はこの反応を利用してラットの大腿筋にイ ンプラントし，この後の相転移と機械的性質と評 価をした。TeCP および DCPD の練合物の HAp へ の相転移とともに埋入 1 時間後に引張強度が増大 することを見出した。我々はこの相転移に着目し， 高時間分解能でリン酸カルシウムの相転移挙動を 評価する方法を検討した[11]。 SSAC の報告[7]に基づき TeCP と DCPD を練合 し，準安定なリン酸カルシウムから安定状態な HAp へ相転移させた。サンプルの相転移過程を全 反射減衰-赤外 (ATR-IR) 分光光度計(FT/IR-6500, Jasco Co., Tokyo, Japan)を用いて非破壊的に測定 した。Fig. 3 に練合したサンプルの赤外スペクト ルの経過時的変化を示す。時間経過とともに 1024 cm-1_{前後に赤外吸吸収ピークの増大が示された。} HAp のリン酸基 PO4ν3は 1190-976 cm-1_の間に現 れることが知られている[12]。また，2364 cm-1_に おける二酸化炭素の吸光度も時間経過と共に変動 していることが示されている。しかしながら，吸 収スペクトルはピーク同士がオーバーラップして いることから複雑で，積分計算による転移速度の 解析は難しい。そこで我々は多変量解析の 1 つで あ る主成 分分析 (principal component analysis: PCA) をアパタイトの赤外スペクトルに適応する ことによって相転移機構の詳細を評価することに した。 Fig. 3. SSAC における赤外スペクトルのインラインモニタリング このような化学データへの多変量解析法の応用は “ケモメトリックス”[13]と呼ばれている。化学デー タが行列形式であれば，各種分光スペクトル[14]， クロマトグラム[15]，分子量[16]などほとんどのデ ータに応用できる。複雑なスペクトルでも多次元 空間内で 1 点のデータで表現することができる。 主成分分析は，形の変化(ローディングス)と強度の 変化(スコア)に分けて解析することが可能となる。 赤外スペクトルへの適応においてローディングス は，組成特有のスペクトルを示し，スコアはその 組成の濃度となる。それぞれのローディングに基 づくアサインをもとに，経時的に測定したスペク

5 トルから組成の速度論的評価を行うことができる。 Fig. 4 に PC1 (Fig.4 a) および PC2 (Fig.4 b) のロ ーディングスを示す。ローディングスのアサイン から PC1 は 2364 cm-1_{における二酸化炭素濃度の} 変動，PC2 は 1024 cm-1_{にピークが示されたこと} から HAp の相転移量に基づく変動に分離された。 Fig. 5 は HAp および二酸化炭素の主成分スコアを 時間微分したプロットを示す。これらの PC1 およ び PC2 のローディングスの強度であるスコアの 時間微分値を縦軸および横軸に示すことによって 反応機構の詳細を解析できた。 Fig. 4. SSAC における赤外スペクトルの経時的変化に基づく主成分分析によって得られたローデ ィングス[11]；二酸化炭素領域(a) リン酸基領域(b) Fig. 5. SSAC における赤外スペクトルの経時的変化に基づく時間微分スコアの変化[11]

6 SSAC の相転移におけるスラリーサンプル内の 変化を Fig. 6 にまとめた。SSAC における相転移 機構は，主に 3 つのプロセスから成り立つことが 明らかとなった。初期溶解段階として，練合液を 加えることによって TeCP と DCPD が溶解し，カ ルシウムとリン酸の過飽和状態および急激な溶液 pH 変化に基づく HAp 初期析出が相転移開始から 18 分までの間に起こる。第二段階として 30 分ま でに二次結晶成長に基づく HAp が析出する。HAp の析出に伴い，サンプル中のカルシウムとリン酸 がさらに溶解しさらなる HAp 析出が起こる。第三 段階として 36 分を過ぎた頃からサンプル内の組 成変動が小さくなり，緩やかな HAp の成長に基づ く二酸化炭素の減少とリン酸の吸光度増加をもた らすことが考えられた。ペーストサンプル内の相 転移速度は pH 変動に密接に関わることが示唆さ れた。このように相転移プロセスにおける複雑な 赤外スペクトル変化を主成分分析によって解析す ることができた。赤外吸収スペクトルをもとにサ ンプル内の組成を分離し，各組成濃度を経時的に 解析することによって SSAC における相転移機構 を明らかにした。

Fig. 6. SSAC における HAp 相転移機構の概略図

3. 各種アミノ酸のハイドロキシアパタイトへの 吸着と結晶成長制御 生体内には多くのタンパク質およびアミノ酸が 存在する。特に生体骨では三重らせん状のコラー ゲンの線維に HAp が析出し，骨が編み上げ式に形 成されることから高い機械的性質を持つことが知 られている[17]。一方，骨リモデリングでは破骨細 胞が吸着面に酸を分泌して HAp を溶解させ，骨芽 細胞により I 型コラーゲンやオステオカルシン等 の骨基質タンパク質が類骨を形成し，生体液中の リンとカルシウムなどのイオンから石灰化が生じ て新生骨が形成されることが知られている。[1] ア

7 パタイト表面へのタンパク質やアミノ酸の吸着現 象については分離用カラムクロマトグラフィーの ための固定相として応用されるため多く研究され ている[18]。Gorbunoff ら[19]はインスリン，オボ ムコイド，ウシ血清アルブミン，リゾチーム等の タンパク質と HAp の相互作用メカニズムについ て調査している。各種タンパク質表面におけるア ミノ基とアパタイト結晶表面でリン酸基および水 酸基との間で静電的相互作用によって引力が作用 する。一方，解離したリン酸が溶液中のカルシウ ムイオンを挟んでカルボキシ基と静電的相互作用 によって吸着を引き起こしていることを示してい る。HAp と酸性極性側鎖アミノ酸間との相互作用 では，Kresak ら[20]がアミノ酸である Asp，Glu の HAp 粒子表面への吸着能について，Langmuir 式を 用いた等温吸着モデルに基づき報告している。 Kawasaki ら[21]は各種アミノ酸の吸着による HAp の結晶成長阻害効果は，非極性アミノ酸系溶液に はみられず，極性アミノ酸および酸性アミノ酸溶 液で現れた。塩基性アミノ酸ではイミダゾール基 を持つ His が強い成長阻害作用を示した。Tanaka ら[22]は HAp への Asp，Ala, Lys およびポリリシ ン[23]の相互作用について報告している。Asp およ び Ala は pH 変動に伴って HAp との高い親和性を 示し，Ala は HAp との親和性をほとんど示さなか った。溶液中の吸着媒の構成イオンであるカルシ ウムイオン，リン酸イオンおよび水酸化物イオン の代わりとしての溶液 pH のすべての挙動を解析 にすることによって，アパタイト溶解度積に基づ く平衡状態の変化であることを明らかにした。 SSAC によって調整された HAp は，スラリー状 態で注射剤として生体内に埋入することができる。 生体内温度である 37℃でも 1 時間程度で相転移す るため，タンパク製剤等の熱への立体構造安定性 が乏しい医薬品有効成分を熱変性せずに埋入する ことができる。生体内に埋入すると破骨細胞によ り浸食されて薬物をリリースし，超長時間の放出 制御が可能になる。Hamanishi ら[8]はグリコペプ チド系抗生物質であるバンコマイシンを SSAC に 含ませた徐放性製剤を報告しており，また Yu ら [25]はセファロスポリン系抗生物質製剤であるセ ファレキシンを医薬品有効成分とし SSAC を基材 とした DDS 応用例を報告している。SSAC を利用 した徐放性タンパク製剤の報告は多くはなく，今 後の医薬品市場におけるタンパク製剤の承認数増 加に伴って放出制御方法の開発が期待されている。 このような背景のもと， DDS の基材として SSAC を埋入し HAp に相転移させるに当たって， 生体内のアミノ酸や薬物等が静電的相互作用に基 づく吸着と結晶成長阻害を及ぼすことが考えられ た。そこで我々は，各種アミノ酸の HAp 相転移に おける結晶成長阻害について赤外スペクトルおよ び多変量解析を用いて評価した[26]。 Fig. 7 に各種アミノ酸 Asn，Ala，Ser,およびオ ルトフォスフォセリン(o-PSer)を濃度 0.1 w/v%含 ませた練合液を用いて，TeCP と DCPD の混合物 から HAp へ相転移させた時の赤外スペクトルの 経時的変化を示した。Asn および Ala を練合液と したサンプルでは HAp 特有のリン酸基振動が 1024 cm-1_{に示され 54 分間で相転移していること} から，これらアミノ酸は HAp の相転移に対して阻 害作用がないことが示唆された。o-PSer について は初期状態から HAp への変化がなく，結晶成長が 阻害されていることが示唆された。相転移変化を より定量的に推定するため，サンプル内の DCPD， TeCP および HAp の純スペクトルと成分数をより 柔 軟 に 考 慮した multivariate curve resolution – alternating least squares (MCR-ALS) 法 [27]を用 いて解析した。

8 Fig. 7. 各種アミノ酸含有練合液を用いた時の HAp 相転移における赤外スペクトルの経時的変化 Fig. 8 に成分数を 3 成分と して推定された Sources (S1，S2 and S3)を示す。各組成の赤外ス ペクトルと比較することによって S1，S2 および S3 がそれぞれ DCPD，HAp，その他の成分である と帰属することができた。この時，各種アミノ酸 は水溶液中で希薄なために Source として現れて い な い 。 こ れ ら の S2 の HAp に 対 応 す る concentration (CHAp)の経時的変化を Fig. 9 に示し

た。Asn および Ala サンプルでは KJMA 理論に基 づく典型的な結晶成長を示した。Ser では Asp サ ンプルに比べて 54 分間で 20%程度の強度となり， 結晶核の成長が阻害され誘導期が延長しているこ とが示唆された。また o-PSer における 90 分後の 赤外スペクトルは初期状態とほぼ変わらないこと から HAp が析出していないことが示唆された。

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Fig. 8. 赤外スペクトルの経時的変化に基づき MCR-ALS によって 3 成分に分離されたスペクトル(a) と原料および生成 HAp の赤外スペクトル(b) [26]

10 Fig. 10 に HAp 結晶成長における素反応と HAp 結晶核への o-PSer の吸着模式図を示した。静電的 相互作用によって HAp 結晶核表面へ o-PSer が吸 着し，素反応の速度定数である k2および k3を低下 していることが示唆された。SSAC による徐放性 製剤化が可能かどうか，タンパク製剤や医薬品を スクリーニングするために有効な評価方法である と考えられた。 Fig. 10. 各種アミノ酸の HAp 結晶各表面への吸着模式図と動力学的評価 今後さらに開発が加速することが考えられるタ ンパク，ペプチドおよび核酸医薬品等のバイオシ ミラー製剤として，1 日当たりの注射回数を減ら すことのできる SSAC が提案でき，これによって QOL の向上が期待できる。アパタイトを基材とし たタンパク製剤やペプチド製剤の放出制御や立体 構造の変性に伴う失活や等の医薬品安定性につい て品質管理や製剤開発が求められる中，非破壊的 に徐放性アパタイト製剤を評価するこれら研究が 社会への貢献につながれば幸甚である。 4. おわりに 本稿では特に HAp の赤外スペクトルと多変量 解析による非破壊的分析方法について概説し， HAp 結晶成長のモニタリングと吸着による結晶成 長阻害機構について紹介した。アパタイトセメン トをはじめとしたバイオセラミックスを基材とし て用いた，代替医療用材料や医薬品製剤への応用 が期待されている。リン酸カルシウムにおける結 晶成長の基礎的研究と HAp/薬物間の相互作用調 査についてより詳細な理解が進み，さらなる DDS 開発分野の発展と実用化を期待したい。 5. 謝辞 本稿執筆にあたって，シドニー工科大学 Besim Ben-Nissan 教授，徳島大学大学院医歯薬学分野(歯 学域)生命材料工学分野の浜田賢一教授，東京理科 大学薬学部 後藤 了教授にご指導いただきました。 心より御礼申し上げます。 6. 参考文献 1) 折茂 肇 編 骨粗鬆症の予防と治療ガイドラ イ ン 2015 年 度 版 http://www.josteo.com/ja/guideline/doc/15_1. pdf (2015). (Access; Aug. 2019)

2) Yilmaz B., Alshemary A. Z., Evis Z. Co-doped hydroxyapatites as potential materials for biomedical applications. Microchemical Journal, 144, 443-453. (2019).

11 Structural variations in natural F, OH, and Cl apatites. American Mineralogist, 74(7-8), 870-876. (1989).

4) Hendricks S. B., Jefferson M. E., Mosley V. M. The crystal structures of some natural and synthetic apatite-like substances. Zeitschrift für Kristallographie-Crystalline Materials, 81(1-6), 352-369. (1932).

5) Ito A., Otsuka Y., Takeuchi M., Tanaka, H. Mechanochemical synthe-sis of chloroapatite and its characterization by powder X-ray diffractometory and attenuated total reflection-infrared spectro-scopy. Colloid and Polymer Science, 295(10), 2011-2018. (2017).

6) Ito A., Otsuka Y., Takeuchi M., Tanaka H. Mechanochemical synthesis of chloroapatite and evaluation of its crystallinity by attenuated total reflection-infrared spectro-scopy and principal component analysis. Phosphorus Research Bulletin, 35, 16-22. (2019).

7) Chow, L. C. Development of self-setting calcium phosphate cements. Journal of the Ceramic society of Japan, 99(1154), 954-964. (1991).

8) Hamanishi C., Kitamoto K., Tanaka S., Otsuka M., Doi Y., Kitahashi T. A self‐setting TTCP‐ DCPD apatite cement for release of vancomycin. Journal of Biomedical Materials Research: An Official Journal of The Society for Biomaterials and The Japanese Society for Biomaterials, 33(3), 139-143. (1996).

9) Ito T., Koyama Y., Otsuka M. DNA complex‐ releasing system by injectable self‐setting apatite cement. The journal of gene medicine, 14(4), 251-261. (2012).

10) Miyamoto Y., Ishikawa K., Fukao H., Sawada M., Nagayama M., Kon M., Asaoka K. In vivo setting behaviour of fast-setting calcium phosphate cement. Biomaterials, 16(11), 855-860. (1995).

11) Otsuka Y., Takeuchi M., Otsuka M., Ben-Nissan B., Grossin D., Tanaka H. Effect of carbon dioxide on self-setting apatite cement formation from tetracalcium phosphate and dicalcium phosphate dihydrate; ATR-IR and chemoinformatics analysis. Colloid and Polymer Science, 293(10), 2781-2788. (2015). 12) Rehman I., Bonfield W. Characteriza-tion of

hydroxyapatite and carbonated apatite by photo acoustic FTIR spectroscopy. Journal of Materials Science: Materials in Medicine, 8(1), 1-4. (1997).

13) Workman JR J. J., Mobley P. R., Kowalski B. R., Bro R. Review of chemometrics applied to spectroscopy: 1985-95, Part I. Applied Spectroscopy Reviews, 31(1-2), 73-124. (1996).

14) Otsuka Y., Ito A., Pal S., Mitome H., Takeuchi M., Tanaka H. Prediction of differential scanning calorimetry curve of theophylline direct compression model tablet using Raman spectra. Journal of Drug Delivery Science and Technology, 49, 254-259. (2019).

15) Kumar N., Bansal A., Sarma, G. S., Rawal R. K. Chemometrics tools used in analytical chemistry: An overview. Talanta, 123, 186-199. (2014).

16) Roy P. P., Roy K. On some aspects of variable selection for partial least squares regression models. QSAR & Combinatorial Science, 27(3), 302-313. (2008).

17) 足立吟也, 南 勉 編著 無機材料科学, 化学同 人, 164-169. (2007).

18) Kawasaki T., Takahashi S., Ideta K. Hydroxyapatite high‐performance liquid chromatography: Column per-formance for proteins. European journal of biochemistry, 152(2), 361-371. (1985).

19) Gorbunoff M. J., Timasheff S. N. The interaction of proteins with hydroxyapatite: III. Mechanism. Analy-tical biochemistry, 136(2), 440-445. (1984).

20) Kresak M., Moreno E. C., Zahradnik R. T., Hay D. I. Adsorption of amino acids onto hydroxyapatite. Journal of Colloid and Interface Science, 59(2), 283-292. (1977). 21) 川崎彰人, 河野敬一, 寺田善博, 平安亮造.

Hydroxyapatite とアミノ酸の相互作用につい て. 日本補綴歯科学会雑誌, 33(3), 522-527. (1989).

22) Tanaka H., Miyajima K., Nakagaki M., Shimabayashi S. Interactions of aspartic acid, alanine and lysine with hydroxyapatite. Chemical and pharma-ceutical bulletin, 37(11), 2897-2901. (1989).

23) Tanaka H., Nuno Y., Irie S., Shimomura S. Adsorption mechanism of polylysine on hydroxyapatite and its effect on dissolution properties of hydroxyapatite. Talanta, 39(8), 893-898. (1992).

24) Hamanishi C., Kitamoto K., Tanaka S., Otsuka M., Doi Y., Kitahashi T. A self‐setting TTCP‐ DCPD apatite cement for release of vancomycin. Journal of Biomedical Materials Research: An Official Journal of The Society for Biomaterials and The Japanese Society for Biomaterials, 33(3), 139-143. (1996).

25) Yu D., Wong J., Matsuda Y., Fox J. L., Higuchi W. I., Otsuka M. Self‐setting hydroxyapatite cement: a novel skeletal drug‐delivery system for antibiotics. Journal of pharmaceutical sciences, 81(6), 529-531. (1992).

12 26) Otsuka Y., Ito A., Takeuchi M., Tanaka, H.

Effect of amino acid on calcium phosphate phase trans-formation: attenuated total reflectance-infrared spectroscopy and chemometrics. Colloid and Polymer Science, 297(1), 155-163. (2019).

27) Garrido M., Rius F. X., Larrechi M. S. Multivariate curve resolution–alternating least squares (MCR-ALS) applied to spectroscopic data from monitoring chemical reactions processes. Analytical and bio-analytical chemistry, 390(8), 2059-2066. (2008).