アスコルビン酸と関連化合物の抗菌作用と作用部位の推定

Kobe Shoin Women’s University Repository

Title

アスコルビン酸と関連化合物の抗菌作用と作用部位の推定

Antibacterial Action of Ascorbic acid and the Related

Compounds and Estimation of the Site of Bactericidal

Reaction in Bacterial Cells

Author(s)

俵谷 孝彦（Takahiko Tawaratani）

Citation

生活科学論叢（Review of Living Science）

，

No.20：79-88

Issue Date

1988

Resource Type

Bulletin Paper / 紀要論文

Resource Version

URL

Right

ア ス コル ビ ン酸 と関連 化 合 物 の

抗 菌 作 用 と作 用 部 位 の推 定

Antibacterial

Action

of Ascorbic

acid

and

the

Related

Compounds

and

Estimation

of

the

Site

of Bactericidal

Reaction

in Bacterial

Cells

俵

谷

孝

彦

Abstract

L -Ascorbic

acid combinated

with cupric sulfate showed the bacteriostatic

action to

Escherichia coll. K-12, but this action was reduced with increase of casamino acid

concentra-tion in media.

The bactericidal

action of such agents was also observed and oxygen was

necessary for the appearance

of its action.

Higher temperature

and higher concentrations

of such agents showed the more effectiveness.

D -iso-Ascorbic

acid and sodium iso-ascorbic

acid were the same activities

as L -ascorbic

acid did, but L -ascorbyl-6-palmitate

and L

-ascorbyl-6-stearate

_{showed the slight activities . L -Ascorbyl-2, 6-dipalmitate did not show}

the bactericidal

activity.

These results indicated that some acyl groups in ascorbic acid

protected

bacteria

from the killing action of ascorbic acid with Cu ( II ) and the reducing

activity of ascorbic acid was the primarily important

factor for the bactericidal

action.

The bactericidal

reaction might not occur in the cytoplasm because different sensitivities

were not observed among the strains defective in DNA repair enzymes and wild types of

these strains.

The fatty acid compositions

in the plasma membranes

of E. coli grown at

different

temperatures

and the sensitivities

of such bacteria

suggested

that the killing

reaction occurred on the plasma membrane

or this neighborhood.

緒

言

問 題 とな る。そ こ で安 全 性 に 比 較 的 問 題 が 少 な い と思 わ れ る天 然 材 料 中 の抗 菌 物 質 、例 え ば脂 肪

 ラ

酸 や そ の エ ス テル な どが 注 目 さ れ る よ う に な っ た 。この 観 点 か ら著 者 は シ ス テ イ ン、 ア ス コル ビ

ン酸 脂 肪 酸 エ ス テ ル2-4)の抗 菌 作 用 、 モ ノ グ リセ リ ドとエ タ ノー ル の 細 菌 胞 子 に対 す る効 果 岡 に

つ い て検 討 を行 い、また ア ス コル ビ ン酸 の 殺 菌 特 性7)につ い て も検 討 を行 い 、い ず れ の場 合 に も顕

著 な効 果 の あ る こ と を報 告 した 。

の ア ス コ ル ビ ン 酸 に よ る 抗 菌 作 用 は1945年MyrvilkとValkに よ っ て 報 告 さ れ た 。 そ の 後 ア ス の

コル ビ ン酸 に よ る殺 菌 にはCu(11)やH202の

共 存 が 増 強 効 果 を示 し、Cu(1)の

生 成 が 重 要 で あ

10)_7) る と示 唆 さ れ た 。 し か し ア ス コ ル ビ ン 酸 の 殺 菌 作 用 特 性 に つ い て の 検 討 は 殆 ど な く、前 報 に お い て 予 備 的 な 結 果 を 報 告 し た 。 そ こ で 本 報 で は 殺 菌 作 用 特 性 の よ り詳 細 な 検 討 を 加 え る と共 に 、 殺 菌 作 用 機 構 の 予 備 的 検 討 と し て 殺 菌 作 用 部 位 の 推 定 を行 っ た 。 実 験 材 料 お よ び 方 法 供 試 菌 大 阪 大 学 工 学 部 醸 酵 工 学 科 所 有 の 細 菌 を 用 い た 。 主 に&6加 沈 肋6漉K12 0UT8401を 用 い た が 、 抗 菌 ス ペ ク トラ ム の 検 討 に は グ ラ ム 陽 性 細 菌 と し て 〃 伽oooα 脇1〃'6粥 ATCC4698、S礎6勿 αZ協 侃 を 、グ ラ ム 陰 性 細 菌 と し てSα1〃zo麗 伽 ち励 勿zπ7勿〃3DB21、1(励 ∫`θ伽 ρη甜 〃20痂α60UT8017、P3θ π40〃20η{鱈6θγ㎎ 勿osαATCC17653、S6γ 勉 勲 〃zα766s68ηsを 、 細 菌 胞 子 と し てBαoゼ 〃粥 ε幼 配 おvar.短g670UT4380を 用 い た 。

ま た 作 用 部 位 の 推 定 に はE.60〃K12系 のW3110(wildtype)、P3478(W3110の 変 異 株 、ρoゐ4)、 AB1157(thi-)、AB1886(〃 筋4.)、AB2465(紹oン4)を 使 用 し た 。 培 地 お よ び 菌 懸 濁 液 の 調 製 静 菌 効 果 の 検 討 に はE60あ を 用 い 、10mlのNutrientbroth [Nutrientbroth(Difco)0.8%(w/v)、NaC1(富 田 製 薬 、 局 方)0.5%(w/v)、 ま た はM9培 地[Na2HPO4(和 光 純 薬 、 特 級)1.5%(w/v)、KH2PO4(和 光 純 薬 、 特 級)0.3%(w/v)、 NH4Cl(半 井 化 学 、 特 級)0.1%(w/v)、NaC10.5%(w/v)、Glucose(和 光 純 薬)0.4%(w/v)、 MgSO4・7H20(半 井 化 学 、 特 級)0.025%(w/v)]に 一 白金 耳 植 菌 し 、37℃ でNutrientbroth で は18時 間 、M9培 地 で は20時 間 振 と う 培 養 し た 。 こ の 前 培 養 液 を150mlの 各 培 地 にNutrient brothに は1%、M9培 地 に は2%植 菌 し、37℃ でOD66。 がo.2に な る ま で 振 と う培 養 し て 、 供 試 菌 液 と し た 。 殺 菌 効 果 の 検 討 に は 定 常 期 細 胞 と対 数 期 細 胞 を 使 用 し た 。 定 常 期 細 胞 の 場 合 、10mlNutrient brothに 細 菌 を一 白 金 耳 植 菌 し37℃ で18時 間 培 養 し た 後 、メ ン ブ ラ ン フ ィ ル タ ー(HAO.45μm,ミ リポ ア)を 用 い て ろ 過 集 菌 し5倍 量 の 無 菌 蒸 留 水 で 洗 浄 、 無 菌 蒸 留 水10m1に 懸 濁 し て 供 試 し た 。 対 数 期 細 胞 の 場 合 、 上 述 の よ う に18時 間 培 養 し た 菌 液 を40mlNutrientbrothに0.5%植 菌 し 、 37℃ でOD66。 が0,1に な る ま で 培 養 し た 。こ の 培 養 液10mlを 定 常 期 細 胞 の 場 合 と 同 様 に ろ 過 集 菌 、 洗 浄 、 無 菌 蒸 留 水10m1に 再 懸 濁 し て 供 試 し た 。15℃ 培 養 の 定 常 期 細 胞 は 、37℃ でOD66。 が0.1に 一80一

達 す る ま で 培 養 し た 後15℃ に 移 し て46時 間 振 と う培 養 し、 上 述 の ご と く ろ 過 集 菌 、 洗 浄 、 再 懸 濁 し て 供 試 し た 。 殺 菌 効 果 検 出 用 培 地 と し て 細 菌 栄 養 細 胞 に はNutrientbrothを 、細 菌 胞 子 に はNutrientagar (Nutrientbrothに1.2%(w/v)粉 末 寒 天(半 井 化 学 、1級)を 添 加)を 用 い た 。 静 菌 効 果 の 測 定 オ ー ト ク レ ー プ で 滅 菌 し た1.25倍 濃 度 の 培 地4mlに 、菌 懸 濁 液5m1、20倍 濃 度 の ア ス コ ル ビ ン 酸(日 本 ロ ッ シ ュ 、 局 方)水 溶 液0,5mlを 添 加 し 、37℃ で の 増 殖 経 過 をBioScan・ ner(OT-BS-12、 大 岳 製 作 所)で 自動 測 定(OD65。)し た 。 た だ しM9培 地 の 場 合 は カ ザ ミ ノ 酸 を 最 終 的 に 所 定 濃 度 と な る よ う に 添 加 し た も の を 用 い た 。 な お ア ス コ ル ビ ン 酸 とCuSO、 は メ ン ブ ラ ン フ ィ ル タ ー で ろ 過 除 菌 し て 供 試 し た 。 殺 菌 効 果 の 測 定 滅 菌 し た50ml容 三 角 フ ラ ス コ に0.1375MNa一 リ ン 酸 緩 衝 液(pH7.0)4ml、 11倍 濃 度 のCuSO4・5H20水 溶 液0.5ml、ll倍 濃 度 の 菌 懸 濁 液0.5m1を 混 ぜ 、5分 間 所 定 温 度 で 保 温 後 、 ア ス コ ル ビ ン 酸 水 溶 液 を 添 加 し て 、 所 定 の 温 度 、 振 と う数 、 時 間 で 殺 菌 処 理 を 行 っ た 。 そ の 処 理 液0.1mlをNutrientbrothに 添 加 しBioScannerで 増 殖 経 過 を 測 定 し 、OD65。=0.1で の

コ ン トロー ル(未 殺 菌 処 理)か

らの増 殖 遅 れ 時 間 τを求 め 、 前 報 と同 様 に殺 菌 効 果 を算 出 した」)

菌 脂 肪 酸 組 成 の 測 定 菌 培 養 液 を 遠 心 分 離(6000rpm、10分)し て 集 菌 し 、 蒸 留 水 で2回 洗 浄 し た の ち 凍 結 乾 燥 し た 。 乾 燥 菌 体30∼50mgに4mlの ク ロ ロ ホ ル ム:メ タ ノ ー ル(2:1)を 加 え 、 30℃ で 抽 出 し た の ち メ ン ブ ラ ン フ ィ ル タ ー(FGLPO.2μm、 ミ リポ ア)で 菌 体 を 除 去 し 脂 質 抽 出 液 を 得 た 。 こ の 抽 出 液 に0.74%KCI水 溶 液 を1/4量 加 え 、 水 溶 性 画 分 を 除 い て 精 製 し 、 ロ ー タ リー エ バ ボ レ ー タ で 濃 縮 乾 固 し て リ ン 脂 質 区 分 を 得 た 。 こ の1.7∼3.Omgに 無 水5%塩 酸 メ タ ノ ー ル4mlを 加 え80∼100℃ で2時 間 還 流 し て 加 水 分 解 す る と 同 時 に 脂 肪 酸 を メ チ ル 化 し た 。 そ の 後 2mlの 蒸 留 水 を 加 え 、10mlの 石 油 工 一 テ ル で3回 抽 出 し、 無 水 硫 酸 ナ ト リウ ム:炭 酸 ナ ト リ ウ ム (4:1)で 脱 水 中 和 後 、 濃 縮 乾 固 し て0.1m1ヘ キ サ ン に 溶 解 し 、 ガ ス ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー [HITACHIl63,3mm×1mガ ラ ス カ ラ ム,2%SiliconeOV-1,ChromosorbW-HP,カ ラ ム 温 度(140℃ →160℃,2℃/min),イ ン ジ ェ ク シ ョ ン 温 度250℃,N2(30ml/min)]に 供 し た 。 結 果 お よ び 考 察 静 菌 効 果 培 地 に ア ス コ ル ビ ン 酸 とCu(H)を 添 加 し た 場 合 、Fig.1に 示 し た よ う に 培 養 初 期 に OD6,。 の 低 下 が 見 ら れ た 後 増 殖 が 起 こ っ た 。 そ こ で 静 菌 効 果 の 指 標 と し てODが 低 下 し最 初 の ODに 戻 る ま で の 時 間 を 復 帰 時 間(τrev)を 用 い た 。M9培 地 に お け るCu(H)1μg/m1と の 併 用 時 で の ア ス コ ル ビ ン 酸 の 静 菌 効 果 をFig,2に 示 し た 。line1に 示 し た よ う に30μg/m1の ア ス コ ル ビ ン 酸 で は 効 果 を み とめ な か っ た が 、200μg/mlで _{は27時 間 以 上 増 殖 を 認 め ず 、 明 瞭 な 濃 度} 依 存 性 を 認 め た 。 一 方 カ ザ ミ ノ 酸 を 加 え る と(1ine2,0.Ol%;1ine3,0.03%;line4,0.1%)、 添 加 濃 度 に 依 存 し て ア ス コ ル ビ ン 酸 の 静 菌 効 果 は 低 下 し 、line4に 示 す よ う に0.1%カ ザ ミ ノ 酸 存 在

鵠 8 0Zrev-__> 0.↑ 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一________ 1ncubationtime Fig。1.Timecourseofl)acteriostaticactionofascorbicacidplusCu(H). 30 1ine21ine31ine4 20

ε

壷

NlO oo10 30501003001000300010000 Ascorbicacid(μg'ml) Hg.2.Concentrationdependencyoabactriostaticactivityofascorbicacid inM9mediumcontainingcasaminoacidtoE60膨K120UT8401. 1ine1,0%casaminoacid;line2,0.01%casaminoacid;line3,0.03% casaminoacid;1ine4,0.1%casaminoacid. Conditions:37℃;40rpm;CuSO4・5H201μg/ml. -82一

下 で は 約700μg/mlの ア ス コ ル ビ ン 酸 で も全 く静 菌 効 果 を 認 め な か っ た 。 従 っ て 培 地 中 の 蛋 白 質 (プ ペ プ チ ド等)に よ っ て 静 菌 効 果 は 弱 くな る が 、 ア ス コ ル ビ ン 酸 の 濃 度 効 果 は い ず れ のIineも 平 行 で あ る こ とか ら 薬 剤 の 濃 度 指 数 は 同 じ で あ る と推 定 さ れ る 。 そ こ で さ ら に 蛋 白 質(ペ プ チ ド や ア ミ ノ 酸)濃 度 が 最 も高 いNutrientbroth(2500μg/mlア ス コ ル ビ ン 酸 で はpHが 約4.0に 低 下 す る の でpHを7.0に 調 製)で は2500μg/mlア ス コ ル ビ ン 酸 で も全 く静 菌 効 果 は 出 現 し な か っ た 。従 っ て カ ザ ミ ノ 酸 や ペ プ チ ド は ア ス コ ル ビ ン 酸 の 抗 菌 作 用 を 低 下 さ せ る こ とが 確 認 さ れ た 。 殺 菌 作 用 特 性 殺 菌 効 果 の 指 標 と し てBioScannerで 測 定 し たOD65。=0.1で の コ ン トロ ー ル か ら遅 れ 時 間(τ)をG1。(細 胞 数 が1/10に な っ た 場 合 の τ値)で 割 っ た 値 τ/G、。を 用 い た 。 こ の ユコ 値 はlog(N。/N)に 相 当 す る も の で あ る 。 な お 、N。 とNは そ れ ぞ れ コ ン ト ロ ー ル の 生 菌 数 と殺 菌 処 理 後 の 生 菌 数 を 示 す 。 ま た 抗 菌 ス ペ ク トラ ム の 検 討 を 除 い て はEoo1ゴK120UT8401を 供 試 菌 と し た 。 6×105cells/mlの 対 数 期 細 胞 を0.1Mリ ン 酸 緩 衝 液(pH7.0)、170rpmで5分 間 振 と う 、 30℃ の 条 件 で 、 ア ス コ ル ビ ン 酵+Cu(H)で 処 理 し た 時 、 ア ス コ ル ビ ン 酸2500μg/mlの 場 合0.2 μg/mlCu(H)以 下 で 殺 菌 効 果 は な く、0.6μg/mlCu(H)で は 完 全 な 殺 菌 効 果 は 認 め た 。 ま た 500μg/mlア ス コ ル ビ ン 酸 で は0.4μg/mlCu(II)で は 殺 菌 効 果 は な く、0.8μg/mlCu(11)で ほ ぽ 完 全 な 殺 菌 効 果 を 認 め 、1.0μg/mlCu(H)と し て も も は や 殺 菌 効 果 の 増 大 は な か っ た 。 殺 菌 時 の 温 度 の 影 響 に つ い て20∼45℃ の 範 囲 で5℃ 刻 み で 検 討 し た 結 果(温 度 以 外 は 濃 度 の 実 験 と 同 じ 条 件)、500μg/mlア ス コ ル ビ ン 酸 で0.8μg/mlCu(H)の 場 合 は30℃ で ほ ぼ 完 全 な 殺 菌 効 果 を 、 ま た0.6μg/mlCu(皿)の 場 合35℃ で 完 全 な 殺 菌 を 認 め た 。 さ ら に 、0.3μg/mlCu(H) で は 顕 著 な 殺 菌 効 果 を 示 さ な か っ た が 、40℃ で ほ ぼ 完 全 な 、45℃ で 完 全 な 殺 菌 効 果 を得 、 通 常 の 薬 剤 殺 菌 と 同 様 高 温 度 ほ ど 殺 菌 効 果 の 高 く な る こ と を 認 め 、 ま た 余 り望 ま し く な いCu(11)の 添 加 量 を か な り低 減 す る こ と が 可 能 と な っ た 。 以 上 の 結 果 ア ス コ ル ビ ン 酸 とCu(H)の 反 応 す る こ と が 殺 菌 効 果 の 発 現 に は 必 須 の 条 件 と 考 え ら れ た 。 殺 菌 時 に お け る02の 存 在 が 殺 菌 効 果 発 現 に 重 要 な 因 子 で あ る こ とがFig.3よ り明 ら か で あ る 。 即 ち 、6×105cells/m1の 対 数 期 細 胞 を0.IMリ ン 酸 緩 衝 液(pH7.0)、30℃ 、5分 間 、 ア ス コ ル ビ ン 酸+Cu(H)で _{振 と う数 を 変 え て 処 理 し た 結 果 、 空 気 中 で は振 と う数 の 増 大 に伴 い殺 菌} 効 果 が 増 大 し た が 、N2ガ ス 通 気 下 で 振 と う して も そ の 効 果 は 全 く 出 現 し な か っ た 。(Fig.3) 次 に0.1Mリ ン 酸 緩 衝 液(pH7.O)、30℃ 、170rpm、5分 間 、 ア ス コ ル ビ ン 酸2500と500 μg/ml、Cu(H)0。8μg/mlの 条 件 で 殺 菌 効 果 に 及 ぼ す 処 理 菌 濃 度 の 影 響 を 検 討 し た 。そ の 結 果107 cells/m1以 下 で は そ れ ぞ れ の 条 件 で 一 定 し た 殺 菌 効 果 を認 め た が 、108cells/mlで は か な り効 果 は 低 減 し た 。 ま た 対 数 期 細 胞 に 比 べ 定 常 期 細 胞 は 一 般 の 殺 菌 剤 に 対 す る の と同 様 抵 抗 性 が 高 か っ た が 、菌 濃 度 に よ る殺 菌 効 果 の 変 動 は 全 く対 数 期 細 胞 の 場 合 と 同 様 で あ っ た 。 し か し不 完 全 殺 菌 で あ り な が ら107cells/m1以 下 で 殺 菌 効 果 に 違 い が な い の は 、 ア ス コ ル ビ ン 酸+Cu(H)+02の 系 一83一

5 4 Z お3 Z o

,92

1

-0050100 150200 Shakhgrate(rpm) Fig.3.Effectofshakingrateonbactericidalactivityofascorbicacidplus Cu(H)inO.1Mphosphatebuffer(pH7.0)toE.60」 ゴK120UT8401grown logarithmically. Conditios:30℃;CuSO4・5H20,0,8μg/m1;cellcon.6×105/ml. Symbols:inair,○,ascorbicacid2500μg/ml;●,ascorbicacid 500μg/ml;inN2gas,口,ascorbicacid2500μg/ml;■,ascorbicacid500 μ9/ml.

蕎4

z3 9 -」2 105106107108 CellCOnc,(cellslm`) Fig.4.Effectofcellconcentrationonbactericidalactivityofascorbicacidplus Cu(11)inO.IMphosphatebuffer(pH7.0)toE.60蕗K120UT8401. Conditions:30℃,170rpm,5min;CuSO4・5H200.8g/m1, Symbols;stationaryphasecells,●,ascorbicacid2500μ9/ml;0,ascor・ bicacid500μg/ml;log.phasecells,塵,ascorbicacid2500μg/ml;口, ascorbicacid500μg/m1. -84一

で 生 じ るで あ ろ う殺 菌 活 性 を示 す物 質 量 が 単 位 菌 体 当 た り同 じで あ る こ と を示 し、殺 菌 機 構 を考

え る うえ で 考 慮 しな け れ ば な らな い 。(Fig.4)

わ

抗 菌 ス ペ ク トラム

前 報 に お い てE601ゴ

、Sあ 励 物 γ

伽〃3、Pα ε㎎ 伽Sσ 、S吻 勿100066粥

砺zε循 に対 しア ス コ ル ビ ン酸+Cu(H)+02で

殺 菌 効 果 が ほ ぼ 等 しい こ とを示 した が 、今 回 は さ

ら に数 種 の 細 菌 を追 加 して 殺 菌 効 果 を検 討 した。供 試 菌 に は 定 常 期 細 胞 を用 い た 。菌 種 に よ りか

な りの 感 受 性 の 違 い が あ り、グ ラ ム 陰 性 菌 に 比べ グ ラム 陽性 菌 の 方 が 抵 抗 性 の高 い 傾 向 が うか が

わ れ た。一

一般 に 言 わ れ る グ ラ ム 陰 性 菌 の 方 が 抵 抗 性 が 高 い こ と と逆 の 結 果 で あ り、細 胞 壁 等 の 違

い を考 え る と殺 菌 作 用 物 質種 や 部 位 を推 定 す る うえ で 重 要 な示 唆 で あ る と思 わ れ る。 な お

αos-'γ

捌 吻 ￠ わ伽 伽%〃zの

芽 胞1まア ス コル ビ ン酸 の 酸 化 物 に感 受1生が あ る との 報 告 が あ る カぐ)今 回

lBα6沼粥 ∫%∂磁 ∫var.π 忽群 の 芽 胞 で は 全 く殺 菌 効 果 を 認 め な か っ た 。 Table1.Bactericidalspectrum.

Mi…bes(孟)τ/G1・

E.oo1'OUT84014.433.19 ∫ あψ雇 〃z〃7伽卯￠DB215.633.98 S〃zα 猶66s66〃∫7.835.21 Pα6㎎ 伽osαATCC176534.932.78 K,ρ πθ吻20〃 勿θOUT80174,923.51 〃.伽 陀%εATCC46983.630 _.69 S,1z4彪 α4.501.42 Conditions:ascorbicacid2500μg/mlplusCuSO4・5H200.8μg/mlin O.1Mphosphatebuffer(pH7,0),30℃,170rpm,5min,stationaryphase ce118×105cells/ml. ア ス コ ル ビ ン 酸 関 連 化 合 物 の 殺 菌 活 性 ア ス コ ル ビ ン 酸 関 連 化 合 物 の 抗 菌 性 に つ い て は こ れ ま でiso-ascorbicacidが0加 如 伽 π鋭 に 対 す る 亜 硝 酸 の 作 用 を 増 強 す る と い う報 告12-14}が あ る の み で あ る 。 そ こ で 今 回 は ア ス コ ル ビ ン 酸 と 等 モ ル 濃 度 の 数 種 の 化 合 物 に つ い て 」E`o泥K12 (対数 期 細 胞)を 用 い てCu(11)と の 併 用 に よ る殺 菌 作 用 を 検 討 し た 。D-iso-ascorbicacidや Sodi㎜iso-ascorbicacidは ア ス コ ル ビ ン 酸 と 同 様 完 全 な 殺 菌 作 用 を 示 し た が 、L-ascorbyl-6 -palmitate(東 京 化 成_{、 特 級)及 びL-ascorby1-6-stearate(東 京 化 成 、 特 級)で は か な り効 果} は 低 下 し た が 、L-ascorbyl-2,6-dipalmitate(東 京 化 成 、特 級)で は 全 く殺 菌 効 果 が 見 ら れ な か っ た(Table2)。 こ の 結 果 、 エ ス テ ル 化 合 物 で は 殺 菌 力 が 低 下 す る が 、6位 の 脂 肪 酸 エ ス テ ル の 還    ヨロ の

兀 力 は ア ス コル ビ ン酸 と同 等 で あ る こ と

か らCu(皿)の

還 元 は ア ス コル ビ ン 酸 と同 様 に 起 こ

る と考 え られ る。従 っ て 、02が 関 与 す る反 応 あ る い は 反 応 生 成 物 お そ ら くあ る種 の ラ ジ カル が ア

ー85一

Tahle2.Bactericidalactivitiesofascorbicacidanaloguesto.E. ω'ゴ1(120σ78401.

C・mp・und4講)(τhr)・/G・

Ascorbicacid500>15>10 D-iso-Ascorbicacid500>15>10 Sodi㎜iso-Ascorbate613>15>10 L-Ascorby1-6-palmitate11772.571.77 L-Ascorby-6-stearate12561.521.05 レAscorby1-2,6-dipalmitate185400 Conditions:CuSO4・5H201.0μg/mlinO.1Mphosphatebuffer(pH7.0),30℃,170rpm, 5min,10garithmicphasecell6×105cells/m1. ル キ ル 基 に 捕 捉 さ れ る こ と で 殺 菌 力 が 低 下 し た も の と 思 わ れ る 。 ま た ア ス コ ル ビ ン 酸 が 還 元 性 を 示 す2、3位 の 水 酸 基 の う ち2位 に 脂 肪 酸 が 結 合 し たL-ascorbyl-2,6-dipalmitateで は 当 然 ア ス コ ル ビ ン 酸 よ り も 還 元 力 が 著 し く低 下 す る と 考 え ら れ 、 さ ら に ラ ジ カ ル 捕 捉 力 も 高 く な る と 思 わ れ る の で 殺 菌 効 力 が 消 失 し た と 思 わ れ る 。 な お 各 薬 剤 は 全 て10%N,N一 ジ メ チ ル ホ ル ム ア ミ ド に 懸 濁 し て 用 い た 。 殺 菌 作 用 部 位 の 推 定 ア ス コ ル ビ ン 酸+Cu(H)+02の 反 応 系 で02-,・OH,H202な ど の 生 成 す ユハ る こ と が 、pH3.5の 条 件 下 で 報 告 さ れ て い る 。 ま た ア ス コ ル ビ ン 酸 関 連 化 合 物 の 結 果 で も あ る 種 の ラ ジ カ ル の 関 与 が 推 定 さ れ た 。 こ の よ う な 各 種 ラ ジ カ ル の 中 性 域 で の 生 成 や 殺 菌 有 効 分 子 種 の Table3.SensitivitiesofDNA-repairdeficientmutantsofE. 601∫toascorbicacidplusCu(H).

Strain・

瞬)τ/G・

・

E.601∫K120UT84015.323.67 AB11578.995.72 AB18866.233.71 AB24635.783.14 W31106.535.27 P3478>12>8.2 Conditions;ascorbicacid2500μg/mlplusCuSO4・5H200.8μg/mlin O.1Mphosphatebuffer(pH7.0),30℃,170rpm,5min,stationaryphase cell8×105cells/ml. -86一

確 定 は 次 報 で 示 す が 、 今 回 は 三 者 反 応 系 の 殺 菌 作 用 部 位 に つ い て 若 干 の 知 見 を得 た 。

上 に 述 べ た 各 種 ラ ジ カ ル は い ず れ もDNAに 損 傷 を 与 え て 殺 菌 効 果 を 示 す こ と が 知 ら れ て い る 。そ こ でE60〃K12系 列 の 各 種DNA修 復 酵 素 欠 損 変 異 株 の 感 受 性 の 差 異 を 検 討 し た 。(Table 3)E6読W3110のpo1A欠 損 株 で あ るEoo〃P3478は 感 受 性 が 増 大 し た が 、EooJゴABll57 のuvrA欠 損 株 のABI886、recA欠 損 株 のAB2463は 親 株 よ り も 抵 抗 性 を 示 し た 。po1A欠 損 株 が 最 も高 い 感 受 性 を 示 し た こ と はDNAが 作 用 部 位 と も 考 え ら れ る が 、uvrAやrecA欠 損 株 の 結 果 は そ れ を 否 定 し て い る 。従 っ て 今 回 の 殺 菌 系 に お い て は ラ ジ カ ル 類 は 細 胞 質 内 で は 発 生 し て い な い と思 わ れ 、 細 胞 膜 を 含 む 細 胞 表 層 に 作 用 し て い る と考 え ら れ る 。 そ こ で 培 養 温 度 に よ っ て 細 胞 膜 の 不 飽 和 脂 肪 酸 と 飽 和 脂 肪 酸 の 比 率 が 変 化 す る こ と を 利 用 し Table4.Ef〔ectofgrowthtemperatureofthesensitivityofE 60」ゴK120UT8401toascorbicacidplusCu(H). C・・wtht・mp・(℃)(孟)・/G1・ 371.581.09 153.362.32 Conditions:ascorbicacid500μg/mlplusCuSO4・5H200.8μg/mlin O.IMphosphatebuffer(pH7.0),30℃,170rpm,5min,stationaryphase

 

celllxlOcells/mL Table5.FattyacidcompositionsofEoo1∫K120UT8401grownat15and37℃, Growthtemp.Fattyacid(%w/woftotal)Ratio (℃)14:016:016:117:0c18:018:1(S/U) 37(Lo9.)6,543.029.42.01.216,71.05 37(Soationary)3,450.618.68.90.616.61.24 15(Stationary)3.033.633.52.00.625.50.61 て 、 脂 肪 酸 組 成 と ア ス コ ル ビ ン 酸+Cu(H)+02に 対 す る 感 受 性 と の 関 係 を 検 討 し た 。Nutrient brothで 培 養 し たE601ゼK12の 定 常 期 細 胞(37℃ お よ び15℃ 培 養)を1×106cells/m1に 調 製

し 、Table4に 記 し た 条 件 で 殺 菌 処 理 し た 結 果 、 表 に 明 ら か な よ う に15℃ 培 養 菌 の 方 が2倍 強 の 感 受 性 を 示 し た 。そ こ で 両 細 胞 お よ び37℃ 培 養 の 対 数 期 細 胞 の3者 の 膜 脂 肪 酸 組 成 を 測 定 し た 結 果 、 不 飽 和 脂 肪 酸 の 割 合 は15℃ 培 養 定 常 期 細 胞>37℃ 培 養 対 数 期 細 胞>37℃ 培 養 定 常 期 細 胞 の 順 と な っ た 。 こ の こ とか ら飽 和 度 の 高 い ほ う が 耐 性 を 示 し た も の と 推 定 さ れ 、 ま た 対 数 期 細 胞 と 定

常 期 細 胞 の 耐 性 の 違 い の 一 因 が 飽 和 度 の 違 い に あ る も の と 考 え ら れ る 。 こ の こ と は ア ス コ ル ビ ン 酸+Cu(11)+02で 発 生 す る ラ ジ カ ル 類 が 細 胞 膜 の 脂 肪 酸 特 に 不 飽 和 脂 肪 酸 に 作 用 し て 殺 菌 効 果 と し て 発 現 す る も の と 考 え ら れ た 。 ま たDNA修 復 酵 素 欠 損 株 の 結 果 よ り 細 胞 質 内 で 作 用 出 来 な い と 思 わ れ 、 ラ ジ カ ル 類 は 細 胞 膜 に 作 用 し て 消 失 し て(捕 捉 さ れ て)し ま う も の と 思 わ れ た 。 な お ラ ジ カ ル の 発 生 や 作 用 分 子 種 お よ び 作 用 機 構 に つ い て は 次 回 に 報 告 す る 。 文 献 1)俵 谷 孝 彦:生 活 科 学 論 叢,19,47(1987). 2)Nur,E,Tawaratani,T.,Takano,M.andShibasaki,1.;∠4槻.Rの.動 ム召γηαムC2π ムCooヵ θ飢

1ヒθ&1)8zヘ ノレfゴo劉oZ》づoよ 」E"9L,7,229(1984).

3)俵 谷 孝 彦,藤 井 圭 介,芝 崎 勲:防 菌 防 徴 学 会 第11回 年 次 大 会 要 旨 集,P.83(1984). 4)俵 谷 孝 彦,枝 木 秀 行,芝 崎 勲 二防 菌 防 徴 学 会 第12回 年 次 大 会 要 旨 集,P.87(1985). 5)俵 谷 孝 彦,山 本 和 司,芝 崎 勲:防 菌 防 徽 誌,15,491(1987). 6)俵 谷 孝 彦,山 本 和 司,芝 崎 勲:防 菌 防 徴 誌,14,551(1986). 7)俵 谷 孝 彦,芝 崎 勲:防 菌 防 徽 誌,13,11(1985). 8)Myrvk,0,N.andValk,W.A.:∫B〃6擁o乙,68,622(1954).

9)Ericsson,Y、,上undbeck,H.:ノ ヒ 如1セ 醜oよ 〃 参`70擁oムSo伽 紘,37,507(1955). 10)Zimmerman,L.:∫Bβ6彪 擁o乙,91,1537(1966).

11)Eller,C.,Edwards,F.F.andWynee,E.S.:A餌m6励 ゼoム,16,349(1968).

12)Tompkin,R,B.,Christiansen,1.N.andShaparis,、 氏B.:∫.Fbo4Sα 敷,43,1368(1978),

13)Tompkin,R.B,,Christiansen,L.N.andShaparis,A.B.:.4ρ μE初 勿 π.〃 客`π海oJ.,35,

59(1978). 14)Tompkin,R.B.,Christiansen,L,N.andShaparis,A.B.:∫Foo4S砿,44,1147(1979), 15)今 井 登 紀 子,荒 川 信 彦,稲 垣 長 典:家 政 学 雑 誌,25,1(1974). 16)Cort,V.M.:∫ ∠4物 飢C勉 吻.Soo,51,321(1974). 17)Gutteridge,J.M.C.andWilkins,S.:EEBSLθ'ム,137,327(1982). -88一