神経シナプスにおけるエンドサイトーシス機能タンパク質‐膜リン脂質 相互作用機序の人工脂質膜を用いた解析法―岡山大学医学賞（新見賞）を受賞して―

神 経 シナプスにお ける

エ ン ドサ イ トー シス 機 能 タ ンパ ク質-膜

リ ン脂 質

相 互 作 用 機 序 の 人 工 脂 質 膜 を用 い た解 析 法

―

岡山大 学 医学 賞(新 見賞)を 受賞 して ―

絹

田

正

裕

岡山大学大学院医歯学総合研究科

脳神経制御学

キ ー ワ ー ド; endocytosis,synaptic vesicle,liposome,dynamic light scattering,phospholipids

は じ め に 神 経 細 胞 は,1つ の細 胞 体 に放 射 状 に の び た樹 状 突 起 と軸 索 か ら な る特 徴 的 な構 造 を有 して い る.神 経 細 胞 で は,樹 状 突 起 で 受 け 取 っ た刺 激 は 電気 刺 激 と して 軸 索 中 を伝 導 す る.神 経 細 胞 か ら神 経 細 胞 へ,あ る い は筋 細 胞 な どの効 果 器 へ の 刺 激 伝 達 は 軸索 末 端 に あ る シ ナ プ ス を介 して次 の よ う な機 構 で行 な わ れ る.前 シ ナ プ ス に は神 経 伝 達 物 質 を含 ん だ多 数 の シ ナ プス 小 胞 が あ り,電 気 刺 激 が 前 シ ナ プ ス に到 達 す る と電 位 依 存 性Ca2+チ ャ ンネ ル が 開 口 して細 胞 内Ca2+濃 度 が 上 昇 し,シ ナ プス 小 胞 が細 胞 膜 と融 合(エ キ ソサ イ トー シ ス)し て 小 胞 中 の神 経伝 達 物 質 が シナ プス 間隙 に放 出 され る.細 胞 膜 に融 合 した シ ナ プ ス小 胞 の膜 は,主 に ク ラ ス リ ン 依 存 性 エ ン ドサ イ トー シ ス に よ っ て 回 収 さ れ て 新 し い 小 胞 に な り,そ の 小 胞 中 に神 経 伝 達 物 質 が 充 填 さ れ て 再 び シ ナ プ ス 小 胞 と な る.シ ナ プ ス 機 能 を 維 持 す る た め に は,こ の エ ン ドサ イ トー シ ス に よ る シ ナ プ ス 小 胞 膜 回 収 機 構 が 正 常 に は た ら く こ とが 重 要 で あ る と考 え ら れ る. ク ラ ス リ ン依 存 性 エ ン ドサ イ トー シ ス は,図1に 示 す よ う に4つ の 過 程 に よ り行 わ れ て い る.被 覆 ピ ッ ト の 形 成 に は 被 覆 構 成 タ ン パ ク 質(clathrin,AP-2,

AP180な ど のcoat components)と ク ラ ス リ ン被 覆 周

辺 に存 在 す る タ ンパ ク質 群

(dynamin,

amphiphysin, synaptoJanin, epsin, endophilin, cargoな ど の accessory

factors)

が 関 与 し,そ れ ら は タ ン パ ク 質 ― タ ンパ ク 質 問,あ る い は タ ン パ ク 質 ― 細 胞 膜 間 で 複 雑 に 相 互 作 用1)し て い る. こ の 複 雑 な エ ン ドサ イ トー シ ス の 分 子 作 用 機 序 を 解 明 す る た め に は,単 純 化 し た 無 細 胞 実 験 系 や 培 養 細 胞 実 験 系 が 有 用 で あ る と考 え ら れ る.タ ンパ ク 質-タ ン 論 文 請 求 先:〒700-8558岡 山 市 鹿 田 町2-5-1 電 話: 086-235-7125 FAX: 086-235-7126 E-mail:[email protected] ● プ ロ フ ィ ー ル ● 1980年 岡 山 大 学 大 学 院 医 学研 究 科 博 士 課 程修 了,医 学博 士.同 年 岡 山 大 学 医 学 部助 手.当 時 は酵 素 化 学 全 盛 期 で,物 質 代 謝 ・代 謝異 常症 の研 究 を行 な って い た水 原 舜 爾 教 授(生 化 学 講座,現 名誉 教 授)の 許 で 物 質構 造決 定 法 や酵 素 に つ い て学 び,ア ミノ酸 代 謝研 究 に従 事.1984年 か ら,University of California,San Diego校 医 学 部病 理 学 講 座Harvey A.ltano教 授(ノ ー ベ ル 賞 受 賞故Pauling教 授 と共 同研 究,鎌 状 赤 血 球 貧 血 症 研 究)の 許 で 組 織標 本 や ヘ モ グ ロ ビ ン につ い て学 び,溶 血 性 貧 血 の研 究 に従 事)帰 国後,ヒ ス チ ジ ン血 症(当 時 は新 生 児 マ ス ス ク リー ニ ン グ対 象)に 端 を発 して,ヒ ス チ ジ ン代 謝 産 物 で あ る ウ ロ カ ニ ン酸(ヒ ト皮膚 に 多 量含 ま れ るが 生 理 学 的 意 義 が解 明 され て い な か っ た)に 興 味 を持 ち,数 種 の 新規 代 謝 産物 とそ の 一 連 の 代 謝 経 路 を明 らか に した.ま た,皮 膚 ウ ロカ ニ ン酸 が紫 外 線 生体 防 御機 構 に関 わ る こ と を示 した(結 城 賞).2000年 か ら は,着 任 した竹 居 孝 二 教 授(脳 神 経 制 御 学)と と もに,神 経 シナ プス 小 胞 リサ イ クル 機 構,特 に エ ン ドサ イ トー シ ス機 能 タ ンパ ク質 ―膜 リン脂 質 分 子 相 互 作 用機 序 に 関 す る研 究 に従 事 して い る(岡 山 大 学 医学 賞(新 見 賞)). 現 在,岡 山 大学 大学 院 医 歯 学 総 合研 究科 講 師.

2 絹 田 正 裕 4.Uncoating Synaptojanin Hsc70 Auxilin Stoned B 3.Fission Dynamin Amphiphysin Endophilin

1.Coat nuclation and assembly AP-2 Ptdlns(4,5)P2 AP1 80 Cargo Clathrin

Synaptotagmin

2.Coated pit maturation Dynamin Amphiphysin Endophilin Epsin Actin 図1 神 経 シ ナ プ ス に お け る ク ラ ス リ ン 依 存 性 エ ン ドサ イ トー シ ス エ ン ドサ イ トー シ ス は ,1)被 覆 構 成 タ ン パ ク 質 の 細 胞 膜 へ の リ ク ル ー ト,2)被 覆 ピ ッ ト形 成,3)被 覆 ピ ッ ト切 断 に よ る 小 胞 形 成,4)被 覆 の 脱 離 の4つ の 過 程 で 行 な わ れ て い る.(文 献1よ り改 変) バ ク 質 相 互 作 用 に 関 し て は ,近 年 しだ い に明 らか に さ れ つ つ あ る が,エ ン ドサ イ トー シ ス 機 能 タ ンパ ク 質-細 胞 膜 脂 質 の 分 子 相 互 作 用 機 序 に 関 し て は 不 明 な 点 が 多 い.本 稿 で は,我 々 が 最 近 確 立 した 人 工 脂 質 膜(リ ボ ソ ー ム)を 用 い た エ ン ドサ イ トー シ ス 再 構 築 実 験 系2) お よ び こ の 実 験 系 を 応 用 し て 得 ら れ た ご く最 近 の 研 究 成 果 を い くつ か 紹 介 す る. リボ ソ ー ム か らの 小 胞 形 成 神 経 シ ナ プ ス に お け る エ ン ドサ イ トー シ ス の 分 子 機 構 をin vitroで 解 析 し よ う と の 発 想 か ら,我 々 は 脳 細 胞 質 タ ンパ ク 質 と リ ボ ソ ー ム と を 反 応 させ て 小 胞 形 成 を 行 な い,生 成 し た 小 胞 の 大 き さ(定 性)と 量(定 量) を 測 定 す る こ と を 試 み た(図2).小 胞 の 定 性 ・定 量 に は,従 来 の 電 子 顕 微 鏡 に よ る 測 定 の 他 に 光 散 乱 測 定 法 を 新 た に 導 入 し た.ま ず,そ の 測 定 原 理31に つ い て 解 説 す る. 1. 静 的 光 散 乱(SLS)法 と 動 的 光 散 乱(DLS)法 脂 質 膜 か ら のin vitro小 胞 形 成 解 析 法 と し て,電 子 顕 微 鏡 と小 胞 コ ー トタ ンパ ク 質 の 生 化 学 的 測 定 を 併 用 す る 方 法,あ る い は 静 的 光 散 乱 (static light scattering, SLS)法 を 用 い る 方 法4,5)が 知 ら れ て い る.SLS法 の 測 定 原 理 は,粒 子 の 大 き さ に よ っ て 散 乱 光 強 度 が 異 な る こ と に 基 づ い て い る.SLS法 は,散 乱 光 強 度 変 化 を 図2  リ ボ ソ ー ム を 用 い た エ ン ドサ イ トー シ ス 再 構 築 モ デ ル 人工 脂 質 膜(liposome)と 脳 細 胞 質 タ ンパ ク 質(cytosol)と を, ヌ ク レ オ チ ド存 在 下 で 反 応 さ せ て(右),シ ナ プ ス 小 胞 リサ イ ク ル の 膜 回 収 過 程(左)を _{再 構 築 す る .} 瞬 時 に 測 定 す る こ とが で き る の で,小 胞 形 成 の 経 時 的 変 化 を 観 察 す る た め に は 有 用 な 手 段 で あ る.し か し, 大 小 様 々 な 粒 子 が 混 在 す る 試 料 中 の 各 粒 子 の 大 き さ や 量 を 測 定 す る こ と は 困 難 で あ る. 一 方 ,様 々 な 粒 子 が 混 在 して い る 溶 液 中 で は,粒 子 は そ の 大 き さ に 依 存 し て ブ ラ ウ ン 運 動 を し て い る.そ の た め,入 射 光(レ ー ザ ー 光)に 対 す る ドプ ラ ー 効 果 が 異 な り,混 在 粒 子 状 態 の 違 い が 反 射 光(散 乱 光)の 「ゆ ら ぎ 」 の 違 い と し て 観 察 さ れ る.動 的 光 散 乱

(dynamic light scattering, DLS) 法 は,こ の 原 理 に 基 つ い て 「ゆ ら ぎ」 散 乱 光 を測 定 し,溶 液 中 に 混 在 して い る 様 々 な 粒 子 の 大 き さ(直 径)と 各 径 の 粒 子 が 占 め る 数 お よ び 重 量 の 度 数 分 布 を 求 め る こ と が で き る 方 法 で あ る.図3にSLS法 とDLS法 の 原 理 の 違 い を示 した. 我 々 は,こ のDLS法 をin vitro実 験 系(図2)に 適 用 し て,反 応 液 中 に 混 在 す る 残 存 大 型 リ ボ ソ ー ム と生 成 し た 小 胞 の 直 径(定 性),各 粒 子 に お け る 数 お よ び 重 量 の 度 数 分 布(定 量)を 測 定 した.小 胞 形 成 の 反 応 条 件 と結 果 に つ い て 次 に 述 べ る. 2.脳 細 胞 質 タ ン パ ク 質 に よ る リ ボ ソ ー ム か ら の 小 胞 形 成

ま ず,脳 抽 出 脂 質(Folch fraction type I) /cholesterol (80:20%,w/w) の 組 成 で 大 型 単 層 リ ボ ソ ー ム _(large unilammelar liposorne, 直 径1,545±175nm) 6) を作 製 し

図3  静 的 光 散 乱 法 と動 的 光 散 乱 法 の 測 定 原理 図 静 的 光 散 舌L(SLS)法(左):大 き い 粒 子 に 比 べ て 小 さ い 粒 子 は 散 乱 光 強 度 が 弱 くな る.粒 子 径 の 経 時 的 変 化 を 測 定 す る の に 適 して い る.動 的 光 散 乱(DLS)法(右):溶 液 中 の 粒 子 は 大 き さ に応 じた ブ ラ ウ ン運 動(ギ ザ ギ ザ 線)を して い る.し た が っ て,運 動 し て い る 粒 子 に 光(入 射 光 波 長 λ0)を 当 て る と,ド プ ラ ー 効 果 に よ っ て 反 射 光 波 長(λ1,λ2)が 異 な り,散 乱 光 に`ゆ ら ぎ(fluctulation)'が 生 じる.DLS法 は,大 小 粒 子 混 在 溶 液 中 の 粒 子 径 お よ び 量 を測 定 す る の に適 し て い る.(文 献3よ り改 変) た.本 実 験 系 で は,リ ボ ソ ー ム の 出 来 如 何 が 大 き く結 果 を 左 右 す る.次 に,こ の リ ボ ソ ー ム と牛 脳 か ら 部 分 精 製 し た 細 胞 質 タ ン パ ク 質 と を 細 胞 質 緩 衝 液 中,ATP お よ びGTP存 在 下 で37℃15分 間 反 応 させ た.反 応 液 を DLS法 で 測 定 し た 結 果(図4A),大 型 単 層 リ ボ ソ ー ム (直 径1,545±175nm)か ら 小 胞(直 径57±14nm)が 形 成 さ れ,残 存 リ ボ ソ ー ム(直 径1,082±203nm)は 小 さ く な っ て い る こ と が 明 ら か に な っ た.小 胞 の 占 め る 積 算 重 量 度 数 が40%で あ っ た こ と か ら,元 の リ ボ ソ ー ム 重 量 の40%分 が 小 胞 形 成 に 使 わ れ た と定 量 さ れ た.ま た,反 応 液 をSephadex G-50ド ラ イ カ ラ ム で 処 理 して 細 胞 質 タ ン パ ク 質(顕 微 鏡 観 察 の 妨 害)を 除 去 し,電 子 顕 微 鏡 で 観 察 し た 結 果(図4B),小 胞 が 確 認 さ れ た. さ ら に,脂 質 膜 の 蛍 光 ラ ベ ル 試 薬1,6-diphenyl-1,3,5-hexatrieneを 用 い て,こ の 小 胞 が 脂 質 膜 小 胞2)で あ る こ と も確 か め ら れ た. 3.リ ボ ソ ー ム か ら の 小 胞 形 成 は ダ イ ナ ミ ン依 存 性 で あ る シ ナ プ ス 小 胞 膜 回 収 の ク ラ ス リ ン 依 存 性 エ ン ドサ イ トー シ ス で は,amphiphysinとdynamin 1(神 経 シ ナ プ ス に 存 在 す る ア イ ソ フ ォ ー ム)と の 相 互 作 用 に よ っ

A

_a

b

B

図4  脳 細 胞 質 タ ン パ ク 質 に よ る リ ボ ソ ー ム か ら の 小 胞 形 成 A:DLS測 定.B:酢 酸 ウ ラ ン で ネ ガ テ ィブ 染 色 した 電 子 顕 微 鏡 像.大 型 単 層 リ ボ ソ ー ム(a)と 脳 細 胞 質 タ ン パ ク 質 と を, ATP,GTP存 在 下 で 反 応 させ る と小 胞 形 成(b)が お こ る.(文 献2よ り改 変) て,ク ラ ス リ ン 被 覆 ピ ッ ト の 切 断(fission過 程)が 起 こ る と 考 え ら れ て い る. 図5に 示 す よ う に,dynamin1は 分 子 量100kDaの タ ン パ ク 質 で,N末 端 側 にGTPase活 性domainを _{有 し ,} 被 覆 ピ ッ ト頸 部 に 重 合 し て ピ ッ ト切 断 を 引 き 起 こ す5, 7,8)と 考 え ら れ て い る_{.そ の 作 用 機 序 に つ い て は 未 だ} 明 ら か で は な い が,GTPase作 用 に よ っ てdynaminの コ ン フ ォ メ ー シ ョ ン 変 化 が お こ るmechanoenzyme説4, 7,9)と ,GTP結 合dynaminが 未 知 のdownstream effectorを 活 性 化 す る と い う 説10,11)が あ る.Dynalmin

はGTPase活 性domainの 他 に も,細 胞 膜

のphospha-tidylinositol 4,5-bisphosphate

[PtdIns(4,5)P2]

と結 合 す るpleckstrin homology (PH)domain やGTPase

活性

4 絹 田 正 裕

図5 Dvnamin 1 お よ びamphiphysin 1 のdomain構 造

調 節domain (GRD), C末 端 側 に はamphiphysin の Srchomology 3(SH3) domain と結 合 す る_{proline rich}

domain (PRD) の 存 在 が 知 られ て い る.

一 方_{,amphiphysinは ク ラ ス リ ン 依 存 性 エ ン ドサ イ}

トー シ ス に お い て リ ン カ ー タ ン パ ク 質121と し て 機 能 し て い る.脳 シ ナ プ ス で はamphiphysin 1及 び2の ホ モ あ る い は ヘ テ ロ 二 量 体 で 存 在 し て い る.Amphiphysin のN末 端 側 に はBAR

(BIN/amphiphysin/Rvs)

domain

が あ り,二 量 体 形 成 に 関 与 し て い る.最 近,BAR domainの 結 晶 構 造 解 析 が な さ れ,こ のdomainが ク ラ

ス リ ン 被 覆 ピ ッ ト頚 部 脂 質 膜 二 重 層 の"curvature sensor"と し て 機 能 す る こ と が 報 告13)さ れ た.中 央 部

に1よproline-rich (PR) reglon やAP-2/clathrin と結 合 す るdolmainが 存 在 し,C末 端 側 に は dynamin 1や Synaptojanin 1のPRD と結 合 す るSH3 domain が あ る.ま た,SH3 domain とPR region のamphiphysin

分 子 内 結 合 が 作 用 発 現 の 調 節 を し て い る と の 報 告14)も あ る.

Dynamin 1 とarnphiphysin をin vitro で 反応 させ る と,両 者 は 共 重 合 し て リ ン グ状 構 造 物 を 形 成 す る.こ の 構 造 物 は,被 覆 ピ ッ ト頸 部 に 形 成 さ れ る 重 合 構 造 物 と 類 似 御 し て い る.ま た, amphiphysin 1の SH3 domainを シ ナ プ ス に マ イ ク ロ イ ン ジ ェ ク シ ョ ン し て, dynaminl とamphiphysin 1 の 結 合 が 起 こ ら な い よ う に す る と,シ ナ プ ス 小 胞 形 成 が 阻 害15)さ れ る こ とか ら も,fission過 程 に お け る dynamin-amphiphysin 相 互 作 用 の 重 要 性 が 示 さ れ て い る. 大 型 単 層 リ ボ ソ ー ム か ら の 小 胞 形 成 反 応 にdynamin 1が 必 要 か ど う か を 調 べ る た め に,免 疫 沈 降 法 で dynamin 1を 除 い た 脳 細 胞 質 タ ン パ ク 質 と 未 処 理 の 細 胞 質 タ ンパ ク 質 と を 用 い て 小 胞 形 成 能 を 比 較 し た.そ の 結 果,除 去 した 細 胞 質 タ ンパ ク 質 で は,小 胞 形 成 が 著 し く減 少 し コ ン トロ ー ル の20%と な っ た. さ ら に,GTPが 小 胞 形 成 反 応 に 必 要 か ど う か を 調 べ る た め に,ヌ ク レ オ チ ド を 加 え な い で 反 応 を 行 な っ た 結 果,小 胞 形 成 は ほ と ん ど 起 こ ら な か っ た.こ れ ら の こ と か ら,本 実 験 系 に よ る 小 胞 形 成 反 応 はGTP(お よ びATP)を 要 求 す る ダ イ ナ ミ ン依 存 性2)の も の で あ る と考 え ら れ る. 4.小 胞 形 成 はPtdIns(4,5)P2で 増 加 す る 細 胞 膜 は 流 動 性 の あ る リ ン脂 質 二 重 層 で 構 成 さ れ て お り,細 胞 外 側 と細 胞 質 側 で は リ ン 脂 質 組 成 が 異 な っ て い る.ク ラ ス リ ン 依 存 性 エ ン ドサ イ トー シ ス に よ る シ ナ プ ス 小 胞 膜 回 収 の 初 期 過 程 で は,図2に 示 した よ う に,clathrin,AP-2,AP180と い っ た 被 覆 構 成 タ ンパ ク 質 が,直 接 あ る い は 高 度 の 制 御 を 受 け な が ら ア ク テ ィ ブ ゾ ー ン を取 り巻 く"endocytic hot spot"へ 集 ま る こ と8.16)が 知 ら れ て い る.こ の 初 期 過 程 が 時 間 的,空 間 的 に ど の よ う に して 制 御 さ れ て い る か は 未 だ 不 明 な 点 が 多 い. 初 期 過 程 に お い て,エ ン ドサ イ トー シ ス 機 能 タ ン パ ク 質 と 細 胞 質 側 リ ン脂 質,特 に 負 電 荷 を 持 つPtdIns (4,5)P2と の 相 互 作 用 が 重 要 と 考 え ら れ て い る(図1参 照).例 え ば,被 覆 構 成 タ ンパ ク 質 で あ るAP-2の 構 成 サ ブ ユ ニ ッ トα や μ2,周 辺 タ ン パ ク 質 で あ るepsinの

epsin N-terminal homology domain, dynamin のPH

domainな どがPtdlns(4,5)P2と 直 接 結 合 す る こ と1,17) が 知 ら れ て い る.す な わ ち,エ ン ドサ イ トー シ ス 機 能 タ ン パ ク 質 に 対 す る 細 胞 質 側 脂 質 膜 の 足 場 と し て PtdIns(4,5)P2が 機 能 し て い る と考 え ら れ る. 人 工 脂 質 膜 で あ る リ ボ ソ ー ム は,比 較 的 自 由 に そ の 脂 質 組 成,脂 質 濃 度 を選 択 し て 作 製 す る こ と が で き る.

脳 抽 出 脂 質 と して 得 られ る Folch fraction type I に は

phosphatidylserine(PS)が 重 量 比 で 約40∼50%含 ま れ て い る.細 胞 質 側 の 膜 リ ン 脂 質 組 成 を模 し てcholesterol/ PS/phosphatidylethanolamine (20:40: 34∼40%, w/w)に イ ノ シ トー ル リ ン脂 質 で あ るPtdIns(4,5)P2を 0∼6%加 え て 大 型 単 層 リ ボ ソ ー ム を 作 製 し,上 述 の 実 験 系 で 反 応 さ せ てDLS法 で 小 胞 形 成 を 測 定 し た 結 果 (図6),PtdIns(4,5)P2の 添 加 量 に 相 応 して 小 胞 形 成 量 の 増 加 が 観 察 さ れ た.し か しな が ら,PtdIns(4,5)P2 の 代 謝 産 物 で あ るPtdIns(4)PやPtdInsを 添 加 し て も小 胞 生 成 量 は 変 化 し な か っ た. こ れ ら の こ と か ら,本 実 験 系 は エ ン ドサ イ トー シ ス に お け る 脂 質 の 作 用 を 知 る 手 段 に も適 し て い る と考 え

図6  イ ノシ トー ル リン脂 質 に よる小胞 形成 量変 化

phosphatidylinositol 4,5/bisphosphate [PtdIns(4,5)P2]を添加

し た リ ボ ソ ー ム を用 い る と小 胞 形 成 量 は 増 加 す る が, phospha-tidylinositol 4-phosphate [PtdIns(4)P]やphosphatidylinositol

(PtdIns)の 添 加 で は 形 成 量 変 化 は み られ な い.(文 献2よ り改 変) ら れ る. リボ ソ ー ム を用 い た イノ シ トール リン脂 質 代 謝研 究 ク ラ ス リ ン 依 存 性 エ ン ドサ イ トー シ ス に お い て,細 胞 質 側 膜 リ ン脂 質 と し て 数%存 在 す るPtdIns(4,5)P2 は 機 能 タ ン パ ク 質 集 積 の 足 場 と し て 重 要 で あ る が,そ の 役 割 を 終 え た 後 の 被 覆 離 脱 段 階 で は む し ろ 分 解 さ れ る 必 要 が あ る と考 え ら れ る.し た が っ て,シ ナ プ ス 小 胞 膜 のexo-endocytotic cycling で は, PtdIns (4,5)P2の

合 成 と 分 解 が 綿 密 に 制 御 さ れ て い る 可 能 性 が あ る. PtdIns(4,5)P2の 分 解 は,シ ナ プ ス に存 在 す るsynap-tojanin 1に よ っ て 行 な わ れ る. 実 際,

synaptojanin 1

遺 伝 子 の ノ ッ ク ア ウ トマ ウ ス で はPtdIns(4,5)P2レ ベ ル の 増 加 が み ら れ,シ ナ プ ス に お け る ク ラ ス リ ン被 覆 小 胞 の 蓄 積 を 起 こ す こ と が 報 告18)さ れ て い る. リ ボ ソ ー ム を 用 い る 実 験 系 の も う 一 つ の 利 点 は,脂 質 の 抽 出 ・分 析 が 容 易 な こ と で あ り,エ ン ドサ イ トー シ ス に お け る リ ン脂 質 代 謝 の 研 究 に も 適 し て い る と考 え ら れ る.リ ボ ソ ー ム を用 い て 我 々 が 行 な っ たPtdIns (4,5)P2代 謝 の 研 究 成 果 を 次 に 紹 介 す る. 1.リ ン 脂 質 の 抽 出 ・分 析 法 細 胞 膜 や リボ ソー ム か らの脂 質 抽 出 は chloroform/ methanol混 合 液 で 容 易 に 行 え る.リ ン脂 質 の 分 析 は,

様 々 な展 開溶 媒 を用 い て high performance thin-layer chromatography

(HPTLC)

に よ っ て 分 析 す る 方 法19) が 確 立 さ れ て い る.ま た,展 開 後 のTLC板 にRyu-MacCoss試 薬20)を 噴 霧 す る と リ ン脂 質 の み が 青 色 ス ポ ッ ト と して 観 察 さ れ る こ と か ら,他 の 脂 質 が 混 ざ っ て い る 抽 出 試 料 で も,リ ン脂 質 の み を 可 視 化 す る こ とが 可 能 で あ る. PtdIns(4,5)P2や そ の代 謝 産 物 な どの イ ノ シ トー ル リ ン脂 質 の 分 析 で は, 1%potassium oxalate/methanol で 前 処 理 した シ リ カゲ ルTLC板 を 用 い て, chloroform/ methanol/4M ammonlum

混合液 (45:35:

10,

v/v)

で 展 開 し,Ryu-MacCoss試 薬 で 可 視 化 す る こ とが 可 能2) で あ る.こ の 実 験 系 に ア イ ソ トー プ ラ ベ ル し た 脂 質, 例 え ば[3H]-や[32P]-PtdIns(4,5)P2な ど を用 い る こ と に よ っ て,測 定 感 度 を大 幅 に 改 善 す る こ と も で き る. High-performance liquid chromatography

(HPLC)

も リ ン脂 質 の 分 析 に 用 い ら れ て い る.し か し な が ら, イ ノ シ トー ル リ ン脂 質 の 分 析 に 関 し て 言 え ば,前 処 理 と し て,ア シ ル 基(脂 肪 酸 側 鎖)を 加 水 分 解 に よ っ て 切 断(deacylation)し て か らHPLCを 行 な う の が 一 般 的 で あ る.最 近,我 々 は 前 処 理 す る こ と な く, PtdIns (4,5)P2や そ の 代 謝 産 物 で あ るPtdIns(4)P, PtdIns を 同 時 にHPLCで 測 定 す る 方 法2)を 確 立 した. エ ン ドサ イ トー シ ス に お け るPtdIns(4,5)P2代 謝 の 意 義 を 知 る 目 的 で,PtdIns(4,5)P2の 分 解 と 小 胞 形 成 の 関 係 を調 べ た 結 果 を 次 に述 べ る. 2.PtdIns(4,5)P2分 解 は 小 胞 形 成 の 初 期 段 階 で も起 こ る 脳 細 胞 質 タ ンパ ク 質 と6%PtdIns(4,5)P2含 有 大 型 単 層 リ ポ ソ ー ム と を,GTPお よ びATP存 在 下 で37℃ 15分 間 反 応 させ た 後, chloroform/methanol で脂 質 を 抽 出 し,HPTLCお よ びHPLCで 脂 質 分 析 し た.そ の 結 果(図7),PtdIns(4,5)P2は 分 解 さ れ てPtdIns(4)P お よ びPtdInsが 生 成 し て い た. さ ら に,小 胞 形 成 と脂 質 代 謝 と の 関 係 を 明 ら か に す る 目的 で,[3H]-PtdIns(4,5)P2を 含 む 大 型 単 層 リ ポ ソ ー ム と脳 細 胞 質 タ ン パ ク 質 と を 反 応 さ せ て ,小 胞 形 成 量 とPtdIns(4,5)P2分 解 の 経 時 的 変 化 を 調 べ た.そ の 結 果(図8),驚 い た こ と に,小 胞 形 成 の 初 期 段 階 で PtdIns(4,5)P2の 分 解 が す で に 進 行 し て い る こ と が 明 ら か と な っ た. 以 上 の こ と か ら,DLS法 と脂 質 分 析 法 を併 用 す る こ

6 絹 田 正 裕

A

B

C

図7  HPLCに よ るPtdIns(4,5)P2分 解 の 測 定 A:イ ノ シ トー ル リ ン 脂 質 標 準 品.B:反 応 前 の リ ボ ソ ー ム.C:反 応 後 の 脂 質 抽 出 試 料.脳 細 胞 質 タ ンパ ク 質 と6%PtdIns(4,5)P2含 有 リ ボ ソ ー ム を,ATPお よ びGTP存 在 下 で 反 応 さ せ た 後 に 脂 質 抽 出 し,HPLCを 行 な っ た.分 析 条 件:カ ラ ム,Tosoh TSKgel Silica-60(4.6×250mm);溶 出 液,hexane/2-propanol/85% phosphate(850:145:5,v/v/v);流 速,1ml/min.(文 献2よ り 改 変) と に よ っ て,小 胞 形 成 と膜 脂 質代 謝 の 関連 を知 る ツ ー ル と して も本 実 験 系 は有 用 で あ る と考 え る. 本 実験 系 の応 用 最 後 に,エ ン ドサ イ トー シス 機能 タ ンパ ク質 一細 胞 膜 リン脂 質相 互 作 用 解 析 の 一 貫 と して本 実験 系 を応 用 した ご く最 近 の 研 究 成 果 を紹 介 す る.詳 細 につ い て は 各 論 文 を参 照 され た い.

A

B

C

図8  小 胞 形 成 とPtdIns(4,5)P2分 解 の経 時 的 比 較 脳 細 胞 質 タ ンパ ク 質 と[3H]PtdIns(4,5)P2含 有 リ ボ ソ ー ム と を 各 時 間 反 応 さ せ た 後 に脂 質 抽 出 試 料 を作 製 し,HPTLCで 定 性 (A)し,BAS2000で 定 量(B)し た.C:各 反 応 時 間 に お け る 小 胞 形 成 量 をDLS法 で 測 定 し た.PtdIns(4,5)P2分 解 が 小 胞 形 成 の 初 期 段 階 で も起 こ っ て い る.(文 献2よ り改 変) 1.  精 製 タ ン パ ク 質 に よ る 小 胞 形 成 能 の 解 析 神 経 シ ナ プ ス 刺 激 に よ っ て,dynamin1お よ びamphi-physinは 脱 リ ン 酸 化21,22)さ れ る こ と か ら,こ れ ら の タ ン パ ク 質 は リ ン 酸 化 一 脱 リ ン 酸 化 に よ っ て 機 能 制 御 さ れ て い る と 考 え ら れ て い る.最 近,シ ナ プ ス に 高 発 現 し て い るcyclin-dependent kinase 5/p35に よ っ て dynamin 1お よ びamphiphysin1は リ ン 酸 化23)さ れ, calcineurin依 存 的 に 脱 リ ン 酸 化 さ れ る こ と で,細 胞 膜

へ の リ ク ル ー トメ ン トが 制 御 さ れ る こ と23)を 明 ら か に し た.こ の 研 究 に 本 実 験 系 を 適 用 して,脱 リ ン酸 化 型 タ ン パ ク 質 は リ ボ ソ ー ム か ら の 小 胞 形 成 能 を 有 す る が,リ ン 酸 化 型 タ ン パ ク 質 で は 著 し く小 胞 形 成 能 が 低 下 す る こ と23)をDLS法 お よ び 電 子 顕 微 鏡 観 察 で 明 ら か に し た. 本 実 験 系 をamphiphysin 1ノ ッ ク ア ウ トマ ウ ス か ら 部 分 精 製 し た 脳 細 胞 質 タ ンパ ク 質 に も適 用 し,ノ ッ ク ア ウ トマ ウ ス か ら 得 た 脳 細 胞 質 タ ン パ ク 質 で は 大 型 単 層 リ ボ ソ ー ム か ら の 小 胞 形 成 は 起 き な い が,amphi-physin 1を 反 応 液 に 添 加 す る と小 胞 形 成 が 回 復 す る24) こ と を 明 ら か に した.ま た,大 型 単 層 リ ボ ソ ー ム と 精 製dynaminと をGTP存 在 下 で 反 応 さ せ る と,リ ポ ソ ー ム 膜 の フ ラ グ メ ン テ ー シ ョ ン が 起 こ り ,そ こ に精 製 amphiphysin 1を 共 存 さ せ る と,dynamin GTPase活 性 の 上 昇 に と も な っ て 小 胞 形 成 が 促 進 さ れ る24)こ と を 明 ら か に し た.さ ら に,リ ボ ソ ー ム の 大 き さ に よ っ て dynamin GTPase活 性 に 対 す るamphiphysin 1の 効 果 が 異 な る24)こ と を 示 し た. こ れ ら の 実 験 で は,少 量 の タ ン パ ク 質 で 小 胞 形 成 を 行 な い,DLS法 を 用 い て 重 量 で は な く数 度 数 分 布 で 定 量 す る よ う に 改 善 し た.し か し,十 分 量 の 精 製 タ ン パ ク 質 が 得 ら れ る 時 に は 積 算 重 量 度 数 分 布 で 定 量 す る こ と を薦 め る. 2.リ ボ ソ ー ム を 用 い たPtdIns(4,5)P2の 合 成 解 析 神 経 シ ナ プ ス 小 胞 の リ サ イ ク ル シ ス テ ム にPtdIns (4,5)P2の 代 謝 が 重 要 で あ る こ と は す で に 述 べ た. PtdIns(4,5)P2の 生 合 成 はPtdInsか らPtdIns(4)Pを 経 て 行 な わ れ,PtdIns 4-kinaseお よ びPtdIns(4)P5-kinaseが 作 用 す る.脳 神 経 シ ナ プ ス に は,PtdIns(4)P 5-kinase type Iγ が 局 在 し て い る こ と が 報 告25)さ れ て い る.

我 々 は,ADP-ribosylation factor 6(Arf6)が Ptdlns(4)P 5-kinase Iγ に 直 接 作 用 して 酵 素 活 性 を 高 め,PtdIns(4,5)P2合 成 が 促 進26)さ れ る こ と を 明 ら か に し た.こ の 研 究 で は,[γ-32P]-ATP存 在 下 で, PtdIns(4)P含 有 リ ボ ソ ー ム と脳 細 胞 質 タ ンパ ク 質,お よ びArf6(野 生 型,活 性 型,非 活 性 型)と を 反 応 さ せ て 脂 質 抽 出 ・分 析 を 行 な っ た. 結 語 リ ボ ソ ー ム を 用 い た 無 細 胞 実 験 系 は,エ ン ドサ イ ト ー シ ス 機 能 タ ン パ ク 質-膜 リ ン 脂 質 分 子 相 互 作 用 機構 を研 究 す る た め に有 用 で あ る. 謝 辞 本研 究 は,岡 山大 学 大学 院医歯 学 総合 研 究科 脳 神 経制 御 学講 座,細 胞 生 理学 講座,米 国エ ール大 学Pietro De Camilli教 授並 び にゲ ッチ ンゲ ン大 学Volker Haucke教 授 らの グ ルー プ との共 同研 究 でお こな った もの で あ り深 謝 し ます.本 研 究 は,主 に文 部科 学省 科 学研 究費補 助金 に よって行 な われた. 文 献

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