腎臓における副甲状腺ホルモン関連ペプチドの局在の検討

腎臓 に お け る副 甲状 腺 ホ ル モ ン

関 連 ペ プ チ ドの 局在 の 検 討

綾 邦 彦

(平 成9年6月30日 受 理)

Key words:副 甲状 腺 ホ ル モ ン 関 連 ペ プ チ ド(PTHrP),腎 臓,発 達,in situ hybridization

緒 言 腫 瘍 性 高 カ ル シ ウ ム 血 症 の 原 因 物 質 と し て 同 定 さ れ たPTH関 連 ペ プ チ ド(PTH-related peptide: PTHrP)は,PTHとN末 端13個 が 高 い 相 同 性 を 示 し,こ のN末 端 部 分 でPTH/ PTHrP受 容 体 と結 合 し細 胞 内 に 情 報 を伝 達 す る1,2,3,4,5). 血 中 カ ル シ ウム 調 節 の 主 た るPTHと 異 な り, PTHrPは 様 々 な 正 常 胎 児 ・新 生 児 組 織 に 発 現 して い る6,7,8,9,10).PTHrP遺 伝 子 過 剰 発 現 マ ウ スやPTHrP遺 伝 子 欠 損 マ ウ ス に よ る検 討 か ら PTHrPは 少 な く と も軟 骨 内 骨 化,毛 包 形 成, 乳 腺 導 管 形 成 を 自 己/傍 分 泌 的 に調 節 して い る こ とが 明 ら か と な っ て い る11,12,13,14,15). 腎 臓 に 関 し て は,様 々 な 尿 細 管 細 胞 や メ サ ン ギ ウ ム細 胞 に 対 す る 増 殖 作 用 がin vitroに お い て 示 され16,17,18),in vivoで は 虚 血 再 潅 流 に よ る mRNAの 増 加 が 報 告 され て い る16).し か し,発 達段 階 に あ る 腎 に 関 し て は あ ま り調 べ られ て い な い. そ こ で,我 々 は,PTHrP mRNAの 腎 の 発 達 段 階 に お け る量 の 変 化 と局 在 を調 べ た. 材 料 と 方 法 1. 実 験 動 物 岡 山大 学 動 物 実 験 施 設 系 統 保 存 室 に お い て 飼 育 され た胎 生 期18日 齢(性 別 不 明),0日 齢,1, 2,3,5,7週 齢 のBALB/c雄 性 マ ウ ス を 使 用 し頚 椎 脱 臼 法 を用 い て 屠 殺 し,腎 臓 を摘 出 した. 2.  RNA抽 出 Acid-Guanidium-Phenol-Chloroform抽 出 法 に てRNAを 腎 臓 か ら 抽 出 し,DEPC水 に 溶 解

し,RNA濃 度 をGene Quant RNA/DNA Calculator (Pharmacia LKBBiochrom Ltd, Science Park, Cambridge, England)で260nm

の 吸 光 度 に よ り 測 定 し た. 3.  RT-PCR

1μgの 全RNA(反 応 液12.5μl中)をoligo (dT) primerを 用 い て 逆 転 写 し(RT-PCR kit (Stratagene, La Jolla, CA)),そ のfirst strand cDNA反 応 液 中 の1μlを 使 用 し25μlの 系 に て

PCRを 行 っ た.PCRはGene amp DNA

amplification reagent kit (Perkin-Elmer, New Jersey, USA)を 使 用 し,1.5mM MgCl2,各

primer 0.4μMで 行 い,そ の 他 の 条 件 は 説 明 書 に 従 っ た.primerは 表1に 示 し たPS 1, PR 1, GS, GRを 使 用 し た.

Programmable Thermal Controller (MJ Reserch, INC. Watertown, MA)を 使 用 し,

プ ロ グ ラ ム は 以 下 の よ う に 設 定 し た.PTHrPは 94℃5分 のdenature後,63℃45秒,94℃45

秒(63℃ か ら94℃ ま で0.5℃/秒 で 上 昇)を38サ

イ ク ル 行 い,72℃7分 でextensionし た.

GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehy drogenase)は,94℃4分 のdenature後,94℃ 1分,57℃1分,72℃2分 を30サ イ ク ル 行 い, 72℃7分 でextensionし た.PTHrPは 成 熟 転 写 産 物 に 必 ず 含 ま れ る 領 域 で 生 成 物 は651-bp, GAPDHは コ ー ド領 域 で460-bpで _{あ っ た .} 生 成 物 を2%ア ガ ロ ー ス ゲ ル で 電 気 泳 動 し 133

ethidium bromideで 染 色 後,蛍 光 強 度 を マ イ ク ロ コ ン ピ ュ ー タ ー に 接 続 し たCCDカ メ ラ で 定 量 した(Densitograph, ATTO, Tokyo, Japan).

表1  プ ラ イマ ー 設 定 4.  RNAプ ロ ー ブ 上 記 と 同 様 にRT-PCRを 行 っ た.PCRは, primerと し てPS2とPR2(表1)を 使 用 し, 94℃4分 のdenature後,94℃1分,58℃1 分,72℃2分 を38サ イ ク ル 行 い,72℃7分 で extensionし た.こ のPCR産 物 をpGEM-T Vector (Promega, Madison, WI)に サ ブ ク ロ

ー ニ ン グ し た_.

断 片 化 し た プ ラ ス ミ ド を 鋳 型 と し,DIG RNA Labeling kit (Boehringer Mannheim Bio

chemica, Germany)を 使 用 し てRNAプ ロ ー ブ を 作 製 し た.セ ン ス プ ロ ー ブ を コ ン ト ロ ー ル と し て 用 い た.ジ デ オ キ シ 法 を 用 い て シ ー ク エ ン ス を 行 い,既 存 の 報 告 と 一 致 し て い る こ と を 確 認 し た19). 5.  組 織 処 理 胎 生 期16日 齢(性 別 不 明),0日 齢 のBALB/c 雄 性 マ ウ ス か ら摘 出 し た 腎 臓 を 用 時 調 整 した4% paraformaldehyde (PFA)-PBS中4℃ で30分 か ら2時 間 イ ン キ ュ ベ ー ト し,30% sucrose/PBS 中 に 沈 む ま で 浸 し,OCT compoundで 包 埋 後 液 体 窒 素 で 凍 結 し た.ク リ オ ス タ ッ トで10 micron の 厚 さ の 切 片 を 作 製 し 乾 燥 後 直 ち にIn situ hybridizationに 使 用 し た. 6. In situ hybridization 切 片 を4% PFA-PBSに15分 浸 し,1μg/ml proteinase K in PBS 37℃ で45分 処 理 し,以 後 4% PFA-PBS 10分,PBS 1分,0 .2 NHCl 10 分,PBS 1分,0.25% acetic anhydride 10分, PBS 1分,70, 80, 90, 100% ethanolに 浸 し, 乾 燥 し た.50% formamide, 10% dextran sul fate, 1×Denhardt's solution, 600mM NaCl, 10mM Tris-HCl pH 7.6, 1mM EDTA, 0.25 % SDS, 200μg/ml tRNAにDIG標 識 プ ロ ー ブ を 加 え たHybridization液 を 組 織 切 片 上 に 垂 ら し,50% formamideを 含 ん だ ペ ー パ ー タ オ ル を 底 に 敷 い た 湿 箱 内 で16時 間50℃ でhybridiza tionを 行 っ た. 5×SSC 55℃, 50% formamide-2×SSC 55℃ 30分,PBS 37℃5分,1μg/ml RNaseA 37℃30分,PBS 37℃5分,2×SSC 55℃20 分,0.2×SSC 55℃20分2回 で 洗 浄 を 行 っ た 後 マ レ イ ン 酸 バ ッ フ ア ー(0.1mol/l maleic acid

(pH 7-5) -0.15mol/l NaCl)5分 浸 し,1% blocking reagent (Boehringer Mannheim Biochemica, Germany)で60分 ブ ロ ッ キ ン グ し

た 後,1.5U/ml anti-digoxigenin-AP, Fab frag ments (Boehringer Mannheim Biochemica, Germany)で30分 抗 体 反 応 を し た.マ レ イ ン 酸

図A  出生 直 後

図B  出生直後拡大像 図C  胎 齢16日

腎盂 上 皮(P),集 合 管(C),糸 球 体(G),尿 細 管(T),S-shaped b0dy (S), nephrogenic zone (N) 図2  PTHrPmRNAの 腎 に お け る局 在

バ ッ フ ァー15分 で2回 _{洗 浄 した 後 ,BCIP/NBT} を含 ん だA. P. Substrate kit (Vector Labora tories, Burlingame, CA)で 発 色 反 応 を行 っ た.

メ チ レ ン ブ ル ー で カ ウ ン タ ー 染 色 した.

結 果

1.  RT-PCRに よ るPTHrPmRNAの 定 量 Internal controlと して 用 い たGAPDHmR NAの 発 現 量 は,胎 生 期18日 齢,0日 齢,1, 2,3,5,7週 齢 の 腎 に お い て ほ ぼ 一 定 だ っ た(図1).PTHrPmRNAは0日 齢,1週 齢 で 最 も 多 く発 現 し て お り,腎 に お け る尿 細 管 形 成 の終 了 す る2週 齢 以 降 明 らか に 減 少 した(図1). 2.  PTHrPmRNAの 腎 に お け る 局 在 出 生 直 後 の マ ウ ス 腎 に お い て は 腎盂 上 皮,集 合 管,S-shaped bodyや 尿 管 芽 を含 む 未 熟 な 腎 皮 質 領 域(nephrogenic zone)に 強 い シ グ ナ ル を認 め た.尿 細 管 に も弱 い シ グナ ル を 認 め た. 糸 球 体 に は 明 らか な シ グ ナ ル は 認 め られ な か っ た(図2AB).胎 齢16日 で は,腎 盂 上 皮,集 合 管,S-shaped bodyやureteric budを 含 む 未 熟 な 腎 皮 質 領 域(nephrogenic zone),尿 細 管, 糸 球 体 に 強 い シ グナ ル を 認 め た(図2C).い ず れ に お い て もセ ン ス プ ロー ブ で は シ グ ナ ル は 認 め ら れ なか っ た. 考 察 発 達 段 階 に あ る 腎 に お い てPTHrPmRNAは 強 く発 現 し て い る.こ の こ とか ら,PTHrPは, 発 達 腎 に お い て 重 要 な 働 き を し て い る と推 測 さ れ る. PTHrP遣 伝 子 欠 損 マ ウス で もPTH/PTHrP 受 容 体 遺 伝 子 欠 損 マ ウ ス で も腎 臓 を含 め 骨 以 外 の 組 織 に 形 態 学 的 に 顕 著 な 変 化 は み ら れ て い な い12,15)_{.し か し,PTHrPを 皮 膚 や 乳 腺 に 過 剰 発} 現 させ る と毛 包 形 成 や 導 管 形 成 に 遅 延/不 全 が 生 じ る11,13).膵臓 の ラ ンゲ ル ハ ン ス 島 に 過 剰 産 生 を 誘 導 させ る と ラ 氏 島 の 過 形 成 と高 イ ン シ ュ リン 血 症 が お こ る20).これ らの こ と は,遺 伝 子 欠 損 マ ウ スPTHrPが 発 達 作 用 を 持 つ す べ て の 組 織 に 異 常 を もって い るわけで は ないこ とを示す.PTHrP 機 能 欠 如 に 対 す る代 償 機 構 や 感 受 性 が 組 織 型 に よ っ て 違 うこ と も考 え ら れ る.さ らに,遣 伝 子 欠 損 マ ウ ス は 生 後 す ぐ死 亡 す る た め 生 後 明 らか と な っ て く る 異 常 を検 串 す る こ と は 難 し い. PTHrPmRNAは 多 くの 胎 児 組 織 で 発 現 して お り6,7,8,9,10),PTHrPは 骨 だ け で な く他 の 多 くの 組 織 の 発 達 に 関 与 して い る と推 測 さ れ る. 今 回 の 研 究 で 我 々 はPTHrPmRNAの 発 現 を 胎 齢16日 の マ ウ ス 腎 に お い て 集 合 管,腎 盂 上 皮, 尿 細 管,糸 球 体,S-shaped bodyや 尿 管 芽 を含 む 未 熟 な 腎 皮 質 領 域(nephrogenic zone)に 認 め て い る.出 生 直 後 で は,集 合 管,腎 盂 上 皮, nephrogenic zoneに 強 い 発 現 が 認 め ら れ る が, 尿 細 管 で は 弱 く,糸 球 体 に は ほ とん ど認 め ら れ な い.PTHrP蛋 白 は 集 合 管,腎 盂 上 皮6,7,21,2, 尿 細 管6,7,22),renal blastema6)に 存 在 し て お り, 糸 球 体 で は 発 達 に つ れ て 減 少 す る6,22). PTHrPmRNAの 発 現 部 位 と蛋 白の 存 在 部 位 が ほ と ん ど一 致 して い る こ と よ り,PTHrPは こ れ らの 細 胞 で 作 ら れ,自 己/傍 分 泌 的 に これ らの 細 胞 に 作 用 し て い る と考 え られ る. PTHrPmRNAは 新 し く尿 細 管 が 作 ら れ る2 週 齢 ま で 強 く発 現 し て い る.さ ら に,そ れ は nephrogenic zoneに 発 現 して お り,PTHrPは 腎 の 発 達 に 関 与 し て い る と考 え ら れ る. In vitroに お い て,PTHrPは 近 位 尿 細 管 由 来 培 養 ヒ ト腎 癌 細 胞17)や 近 位 尿 細 管 細 胞23), MDCK細 胞18),メ サ ン ギ ウ ム 細 胞16)に対 し て 増 殖 作 用 が あ り,PTHrPは 腎 細 胞 の 成 長 因 子 と 推 測 さ れ る.ま た,虚 血 後 再 潅 流 に よ り, PTHrPmRNAは2倍 に 増 加 す る16)こ とか ら, 発 達 だ け で な く再 生 過 程 に も関 与 す る と推 測 さ れ る. 最 近,PTHrPは ア ポ トー シ ス 抑 制 因 子 で あ るBcl-2の 発 現 を軟 骨 細 胞 に お いて 増 加 させ, Bcl-2はPTHrPの シ グ ナ ル伝 達 機 構 の 下 流 に あ る と い うこ とが 報 告 さ れ て い る26).腎に 関 して は,Bcl-2遺 伝 子 欠 損 マ ウ ス は 生 後1週 齢 ま で に 尿 細 管 の 拡 張 を お こ す25).Bcl-2蛋 白 は,胎 齢16日 に お い て,集 合 管,尿 細 管,糸 球 体, metanephric cap tissueに 存 在 し て お り26), PTHrPmRNAの 発 現 部 位 に 類 似 し て い る.こ れ らの こ と か ら,PTHrPはBcl-2に 作 用 し, 発 達 腎 に お い て ア ポ トー シ ス を 制 御 し て い る と い う仮 説 も考 え ら れ る.

ま だ 予 備 実 験 の 段 階 で あ る が,PTH/PTHrP 受 容 体mRNAの 発 現 量 は2週 齢 後 も 減 少 し な い.PTH/PTHrP受 容 体mRNAは 発 達 腎 に お い て,尿 細 管 と 糸 球 体 に 発 現 が 認 め ら れ る が, 集 合 管,腎 盂 上 皮,nephrogenic zoneに は 認 め ら れ な い.成 獣 ラ ッ ト腎 に お い て も,glomerular podocytes, convoluted and straight proximal tubules, the cortical portion of thick ascend

ing limbs, distal convoluted tubulesに 発 現 が 認 め ら れ る がthe thin limbs of Henle's loopや collecting tubulesに は 発 現 を 認 め ず27)発 達 腎 に お け る 局 在 と 一 致 し て い る.こ れ ら の 発 現 は 発 達 の 過 程 で 変 化 せ ず,胎 児 腎 に お い てPTH/ PTHrP受 容 体 は 胎 児 の 副 甲 状 腺 や 腎 臓 な ど の 組 織 で 作 ら れ たPTHrPやPTHに よ る 胎 生 期 の カ ル シ ウ ム ホ メ オ ス タ ー シ ス に 関 与 し て い る と も考 え ら れ る.し か し,PTHrPに よ る 胎 盤 か ら の カ ル シ ウ ム 輸 送 の 方 が,胎 生 期 の カ ル シ ウ ム ホ メ オ ス タ ー シ ス に と っ て は よ り重 要 と 考 え ら れ る. PTH/PTHrP受 容 体mRNAの 局 在 は PTHrPの も の と か な り 異 な っ て い る.こ の こ と は,次 の2通 り の 可 能 性 を 示 唆 し て い る.一 つ は,PTH/PTHrP受 容 体 は,本 来,集 合 管, 腎 盂 上 皮,nephrogenic zoneに も 存 在 し て い る が,同 一 部 位 で 産 生 さ れ たPTHrPに よ っ て

downregulateさ れ て い る た めin situ hybridiza

tionで は 検 出 で き な か っ た10)と い う 考 え 方 で あ る.も う 一 つ は,PTHrPは 未 知 のPTHrP受 容 体 に 結 合 し て 作 用 す る と い う もの で あ る.PTH/ PTHrP受 容 体 以 外 のPTHrP受 容 体 は ま だ ク

ロ ー ニ ン グ さ れ て い な い が,placenta, hippocampal neurons, malignant squamous carcinoma cells, human epidermal ker

atinocytesに そ の 存 在 が 示 唆 さ れ て い る28,29,30). ラ ベ ル 化 し たPTHの 結 合 実 験 に よ り,糸 球 体 に 受 容 体 が 存 在 す る こ と がPTH/PTHrP受 容 体 の 同 定 以 前 に 証 明 さ れ て お り31),ラ ベ ル 化 し た PTHrPの 結 合 実 験 も 今 後 の 検 討 課 題 と 考 え ら れ る. 結 論 発 達 腎 に お い て,PTHrPmRNAは 多 く 発 現 さ れ て お り,集 合 管,腎 盂 上 皮,尿 細 管,糸 球 体,nephrogenic zoneに そ の 発 現 が 認 め ら れ る. そ の 局 在 は,蛋 白 と ほ と ん ど 同 じ で あ る. こ れ ら の こ と か ら,PTHrPは 自 己/傍 分 泌 的 に 腎 の 発 達 に 作 用 し て い る と 考 え ら れ る. 稿 を 終 え る に 臨 み,終 始 懇 切 な る 御 指 導,御 校 閲 を 賜 わ り ま し た,岡 山 大 学 小 児 科 学 教 室 清 野 佳 紀 教 授 に 深 謝 致 し ま す.ま た,本 研 究 に お い て 御 指 導, 御 助 言 を い た だ き ま し た 同 教 室 田 中 弘 之 先 生 に 感 謝 致 す と と もに,教 室 の 皆 様 に お 礼 申 し 上 げ ま す. 文 献

1) Suva LJ, Winslow GA, Wettenhall REH, Hammonds RG, Moseley JM, Diefenbach, -Jagger H, Rodda CP, Kemp BE, Rodriguez H, Chen EY, Hudson PJ, Martin TJ and Wood WI: A parathyroid hormone-related protein implicated in malignant hypercalcemia: cloning and expres

sion. Science (1987) 237, 893-896.

2) Mangin M, Webb AC, Dreyer BE, Posillico JT, Ikeda K, Weir EC, Stewart AF, Bander NH, Milstone L, Barton DE, Francke U and Broadus AE: Identification of a cDNA encoding a parathyroid hormone-like peptide from a human tumor associated with humoral hypercalcemia of malignancy. Proc Natl Acad Sci USA (1988) 85, 597-601.

3) Martin TJ, Moseley JM and Gillespie MT: Parathyroid hormone related protein: biochemistry and molecular biology. Crit Rev Biochem Mol Biol (1991) 26, 377-395.

4) Juppner H Abou-Samra A-B, Uneno S, Gu W-X, Potts Jr JT and Segre GV: The parathyroid hormone-like peptide associated with humoral hypercalcemia of malignancy and parathyroid hor

263, 8557-8560.

5) Abou-Samra A-B, Juppner H, Force T, Freeman M, Kong X-F, Schipani E, Urena P, Richards J, Bonventre JV, Potts Jr JT, Kronenberg HM and Segre GV: Expression cloning of a common receptor for parathyroid hormone and parathyroid hormone-related peptide from rat osteoblast-like cells: a single receptor stimulates intracellular accumulation of both cAMP and inositol trisphos

phates and increases intracellular free calcium. Proc Natl Acad Sci USA (1992) 89, 2732-2736. 6) Moniz C, Burton PBJ, Malik AN, Dixit M, Banga JP, Nicolaides K, Quirke P, Knight DE and

McGregor AM: Parathyroid hormone related peptide in normal human fetal devel opment. Mol Endocrinol (1990) 5, 259-266

. 7) Campos AV. Asa SL and Drucker DJ: Immunocytochemical localization of parathyroid hormone like peptide in the rat fetus. Cancer Res (1991) 51, 6351-6357.

8) Senior PV, Heath DA and Beck F: Expression of parathyroid hormone-related protein mRNA in the rat before birth: demonstration by hybridization histochemistry. Mol Endocrinol (1990) 6, 281 -290.

9) Van de Stolpe A, Karperien M, Juppner H and Segre GV: Parathyroid hormone related peptide as an endogenous inducer of parietal endoderm differntiation. J cell Biol (1993) 120, 235-243. 10) Lee K, Deeds JD and Segre GV: Expression of parathyroid hormone related peptide and its receptor

messenger ribonucleic acids during fetal development of rats. Endocrinology (1995) 136, 453-463. 11) Wysolmerski JJ, Broadus AE, Zhou J, Fuchs E, Milstone LM and Philbrick WM: Overexpression

of parathyroid hormone related protein in the skin of transgenic mice interferes with hair follicle development. Proc Natl Acad Sci USA (1994) 91, 1133-1137.

12) Karaplis AC, Luz A, Glowacki J, Bronson RT, Tybulewicz VLJ, Kronenberg HM and Mulligan RC: Lethal skeletal dysplasia from targeted disruption of the parathyroid hormone-related peptide gene. Genes Dev (1994) 8, 277-289.

13) Wysolmerski JJ, McCaughern-carucci JF, Daifotis AG and Philbrick WM: Overexpression of parathyroid hormone-related protein or parathyroid hormone in transgenic mice impairs branching morphogenesis during mammary gland development. Development (1995) 121, 3539-3547. 14) Weir EC, Philbrick WM, Amiling M, Neff LA, Baron R and Broadus AE: Targeted overexpression

of parathyroid hormone-related peptide in chondrocytes causes chondroplasia and delayed endochon dral bone formation. Proc Natl Acad Sci USA (1996) 93, 10240-10245.

15) Lanske B, Karaplise AC, Lee K. Luz A, Vortkamp A, Pirro A, Karperien M, Defize LHK, Ho C, Mulligan RC, Abou-Samra A-B, Juppner H, Segre GV and Kronenberg HM: PTH/PTHrP

receptor in early development and indian Hedgehog-regulated bone growth. Science (1996) 273, 663 -666 .

16) Soifer NE. van Why SK, Ganz MB, Kashgarian M, Siegel NJ and Stewart AF: Expression of parathyroid hormone-related protein in the rat glomerulus and tubule during recovery From renal ischemia. J Clin lnvest (1993) 92, 2850-2857.

17) Burton PBJ, Moniz C and Knight DE: Parathyroid hormone-related peptide can function as an autocrine growth factor in human renal cell carcinoma. Biochem Biophys Res Commun (1990) 167, 1134-1138.

18) De Miguel F, Garcia-canero R and P. Esbrit: Co-purification of calcium transport-stimulating and DNA synthesis-stimulating agents with parathormone-like activity isolated from the hypercalcemic

19) Margin M, lkeda K and Broadus AE: Structure of the mouse gene encoding parathyroid hormone related peptide. Gene (1990) 95, 195-202.

20) Vasavada RC, Cavaliere C, D'Ercole AJ, Dann P, Burtis WJ, Madlener AL, Zawalich K, Zawalich W, philbrick W and Stewart AF: Overexpression of parathuroid hormone-related protein in the

pancreatic islets of transgenic mice causes islet hyperplasia, hyperinsulinemia, and hypoglycemia. J Biol Chem (1996) 271, 1200-1208.

21) Moseley JM, Hayman JA, Danks JA, Alcorn D, Grill V, Southby J and Horton MA: Immunohisto chemical detection of parathyroid hormone related peptide. J Clin Endocrinol Metab (1991) 73, 478

-484 .

22) Burton PBJ, Moniz C, Quirke P, Malik AN, Bui TD, Juppner H, Segre GV and Knight DE : Parathyroid hormone-related peptide: Expression in fetal and neonatal development, J Pathol

(1992) 167, 291-296.

23) Garcia-Ocana A, de Miguel F, Penaranda C, Albar JP, Sarasa JL and Esbrit P: Parathyroid hormone-related protein is an autocrine modulator of rabbit proximal tubule cell growth. J Bone Miner Res (1995) 10, 1875-1884.

24) Amling M, Neff L, Tanaka S, Inoue D, Kuida K, Weir E, Philbrick WM, Broadus AE and Baron R: Bcl-2 lies downstream of parathyroid hormone-related peptide in a signaling pathway that regulates chondrocyte maturation during skeletal development. J Cell Biol (1997) 136, 205-213. 25) Veis DJ, Sorenson CM, Shutter JR and Korsmeyer SJ: Bcl-2-deficient mice demonstrate fulminant

lymphoid apotosis, polycystic kidneys, and hypopigmented hair. Cell (1993) 75, 229-240. 26) Novack DV and Korsmeyer SJ: Bcl-2 protein expression during murine development, Am J Pathol

(1994) 145, 61-73.

27) Lee K, Brown D, Urena P, Ardaillou N, Ardaillou R, Deeds J and Segre GV: Localization of parathyroid hormone/parathyroid hormone-related peptide receptor mRNA in kidney. Am J Physiol

(1996) 270, F 186-191.

28) Orloff JJ, Ganz MB, Ribaudo AE, Burtis WJ, Reiss M, Milstone LM and Stewart AF: Analysis of PTHRP binding and signal transduction mechanisms in benign and malignant squamous cells. Am

J Physiol (1992) 262, E599-E607.

29) Kovacs CS, Lanske B, Hunzelman JL, Guo J, Karaplise AC and Kronenberg HM: Parathyroid hormone-related peptide (PTHrP) regulates fetal-placental calcium transport through a receptor distinct from the PTH/PTHrP receptor. Proc Natl Acad Sci USA (1995) 93, 15233-15238. 30) Fukayama S, Tashjian AH Jr, Davis JN and Chisholm JC: Signaling by N and C-terminal

sequences of parathyroid hormone-related protein in hippocampal neurons. Proc Natl Acad Sci USA (1995) 92, 10182-10186.

31) Rouleau MF, Warshawsky H and Goltzman DG: Parathyroid hormone binding in vivo to renal, hepatic and skeletal tissues of the rat using a radioautographic approach. Endocrinology (1986) 118,

Expression of parathyroid-related peptide mRNA in the kidney

Kunihiko AYA Department of Pediatrics, Okayama University Medical School,

Okayama 700, Japan (Director: Prof. Y. Seino)

PTHrP mRNA was quantified by RT-PCR and the localization of PTHrP mRNA was determined by in situ hybridization in kidney. During development, the expression of PTHrP mRNA is much higher before 2 weeks of age while kidney is developing. In E16 fetal mice, PTHrP mRNA was strongly expressed in the collecting ducts, urothelium of the pelvis, tubules, the glomeruli and immature elements in the cortex of the developing kidney (ne phrogenic zone). Within O-day-old mice, it was dominantly expressed in collecting ducts, the urothelium of the pelvis and nephrogenic zone. These findings suggest that PTHrP plays a role in kidney development as an autocrine/paracrine factor.