IRUCAA@TDC : マレー人のミトコンドリアDNA多型検査により認められた新しい系統の確立

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(1)Title Author(s) Journal URL. マレー人のミトコンドリアDNA多型検査により認められた新しい系統の確立佐々木, 継泰 , (): http://hdl.handle.net/10130/26. Right. Posted at the Institutional Resources for Unique Collection and Academic Archives at Tokyo Dental College, Available from http://ir.tdc.ac.jp/.

(2) マレー人のミトコンドリア DNA 多型検査により認められた新しい系統の確立. 東京歯科大学６学年佐々木継泰. 指導教員法歯学講座水口清教授丸山澄助手.

(3) マレー人のミトコンドリア DNA 多型検査により認められた新しい系統の確立東京歯科大学６学年要. 佐々木継泰. 旨. マレーシアクアラルンプール周辺に在住するマレー人 16 人を対象に、ミトコンドリア DNA 多型のコントロール領域の多型を検査したところ11 型の異なる系統が見い出された。これらのうち、 6 型は東アジアに多く認められている系統で、 1 型は東アジアに認められているが稀な系統で、４型は主として南アジアに存在する系統と考えられた。これらのうち、２型は既存の系統に属さないと判断されたため、１つの系統のミトコンドリア DNA 全ゲノム配列を決定し、新しい M* 系統の特徴を明らかにした。この系統はコーディング領域に特有な変異を多く有し、既存の M 系統と変異を共有せず、新しい M 系統の枝と考えられた。本系統は、M 系統の拡散時に独立して生じ、南アジアに広がった古い系統と思われる。. 緒. 言. ミトコンドリア DNA は環状の二本鎖分子で、１細胞当たり 1000? 10000 コピー存在する(Bogenhagen and Clayton 1974)。完全な全ゲノム DNA 配列は 1981 年に Anderson et al.により決定された。ミトコンドリア DNA は tRNAPro と tRNAPhe 遺伝子の間に 1.122bp の non-coding 領域が存在する。このいわゆる「コントロール領域」は、ミトコンドリア DNA の中で最も早く進化する部分であると考えられており(Upholt and Dawid 1977)、非常に多型的である。ミトコンドリア DNA のコピー数の多さ、早い変異速度に加え、母性遺伝をするという特徴は、ミトコンドリア DNA 多型を法医学、集団遺伝学、分子進化、人類学分野などに応用するために様々な利点を与えている。近年の自働塩基配列決定装置、塩基配列決定用の試薬、DNA 精製キットなどの進歩は、PCR 産物から正確で容易な直接塩基配列決定を可能にした。ミトコンドリア DNA 多型の変異の高さは、法医学的応用に関しては、他人の DNA のコンタ. 1.

(4) ミネーションに注意を払うことを考慮していれば、特に変性していてほんの僅かな資料しか得られないようなケースの個人識別においても、コントロール領域の塩基配列決定が極めて容易で有力な手段となり得る(Bar et al. 2000)。ミトコンドリア DNA 多型は集団に偏ってい出現するため、あるミトコンドリア DNA 多型の配列がどの集団にどの程度に出現するかを調査することは、ミトコンドリア DNA 多型を法医学に応用するに当たり極めて重要な情報である。特に法医学領域においてはコントロール領域のうち、HV1（Hypervariable 1）、HV2 と呼ばれる領域の変異が個人識別に利用されることが多い。人類遺伝学分野においては、当初ミトコンドリア DNA の制限酵素切断部位の有無による系統分類が広まり、多くの報告がなされた。その後塩基配列決定の迅速化により、特に HV1 領域の変異の遺伝距離を計算することによる分類法が用いられるようになった。これらの情報は同時に検査されるようになり、現在では全ゲノムの塩基配列を元に系統を確立しようとする方向に向かっている。近年の国際化の波は、我が国においても外国人が被害者や加害者になる事件を増加させてきている。ミトコンドリア DNA 多型の系統を確立することは、人類遺伝学的応用のみならず、法医学的にも対象者の地理的由来を推定するために有力な情報を提供してくれる。今回著者はクアラルンプール周辺に在住するマレー人のミトコンドリア DNA 多型の検査を行い、その中で新しい系統を見い出した。そこで、この系統を確立するために、全ゲノム配列の決定を試みた。. 材料及び方法 1. 試料試料 DNA は血縁関係のないマレー人男性 16 人から得た DNA を用いた。本研究はマレーシアの University of Malaya の Phrabhakaran Nambiar 教授との共同研究で、試料については対象者よりインフォームドコンセントを得た歯科外来患者の抜去歯牙を用いた。また本研究は東京歯科大学、および University of Malaya の倫理委員会の承認を得た上で遂行している。 2. DNA 抽出歯牙は分割・細分後、0.5M-EDTA (pH8.0)にて 36 時間脱灰後、歯牙が浸る量. 2.

(5) の TE 緩衝液に、30μl の 20mg/ml の proteinase K、および 1/10 量の 10%SDS 溶液を加え、56℃で１晩処理した。続いて、上清を用い、Phenol/Chlorform 抽出を２時間、２回繰り返し、クロロホルム/イソアミルアルコールで処理をした後、上清を QIAquick PCR Purification Kit (Quiagen)にて精製し、50μl の TE に溶出し DNA 試料とした。 3. ミトコンドリア DNA 多型の検出 15 例の試料についてミトコンドリア DNA のコントロール領域（16025-579）の塩基配列を決定した。その結果からそれぞれの試料の系統を推測し、必要な試料については 3010、5178 の変異を検査した。 16025-579 の塩基配列の決定に際しては、原則的に 15978-68、16481-698 領域を PCR 増幅した。以下の実験において用いたプライマーおよび、塩基配列決定のために使用したプライマー配列は、表１に示した如くである。PCR 増幅は 30 μl の混合物に 10 ng のゲノム DNA、10 mM Tris-HCl (pH 8.3)、50 mM KCl、 2.5mM MgCl2 、0.02% gelatin、 200μM dNTP、 400 nM のそれぞれのプライマー、および 2U の AmpliTaq Gold になるように混合し、95℃10 分変性の後、95℃50 秒-56℃105 秒のサイクルを 35 回繰り返し、最後に 56℃で 10 分間延長した。PCR 後、8%ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し、銀染色で増幅を確認した。PCR 産物は QIAquick PCR Purification Kit にて精製し、直接塩基配列決定を行った。Sequencing PCR は BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit を用い、 PCR に用いたプライマーで反応させた後、ABI 3130 DNA Sequencer (Applied Biosystems)により塩基配列解析を行った。 3010、5178 の変異は Umetsu et al.（2001）の方法により行った。全ゲノムの塩基配列の解析は、771-4798、4506-8539、8239-12360、12219-13830、 13681-15964、の範囲を LA Taq を用いて PCR 増幅した。つまり 30μl の混合物に 20 ng のゲノム DNA、10x LA PCRTM Buffer (Mg2+ free) 3μl、25mM MgCl2 3 μl、dNTP mixture (各 2.5 mM) 4.8μl、400 nM のプライマー、および 1.5U の TAKARA LATM Taq になるように混合し、94℃1 分変性の後、98℃10 秒-58℃4 分のサイクルを 32 回繰り返し、最後に 72℃で 10 分間延長した。PCR 後、4%ポリアクリルアミドゲルにて電気泳動し、銀染色で増幅を確認した。PCR 産物の精製、 Sequencing 反応、解析はコントロール領域の塩基配列決定と同様で、プライマーのみ表１に示したものに加え、講座で作製しているプライマーを適宜使用し. 3.

(6) た。得られた塩基配列は Andrews et al. (1999)の修正されたミトコンドリアゲノム塩基配列と比較した。. 結. 果. 1. コントロール領域の塩基配列と系統の推測 16 例の試料のコントロール領域の塩基配列は表２に示した如くである。またそれぞれの系統を日本人に認められた系統と並列して示したものが図１である。それぞれの系統に特徴的な配列は表２において太字で示した。489 の変異を有する場合は M 系統に属し、489 の変異を持たない場合は N 系統に属するものと判断できる。それぞれの系統は、Fucharoen et al. (2001)、Maca-Meyer et al. (2001)、 Herrnstadt et al (2002)、Yao et al. (2002)、Kivisild et al. (2002)、Kong et al. (2003)、Ingman and Gyllensten (2003)、Maruyama ey al. (2003)、Tanaka et al. (2004)、Palanichamy et al (2004)、Macaulay et al. (2005)、Rajkumar et al. (2005)の文献データを参考に検索し、以下の如く推測した。 (1) M73 は 16298、16327、249d の変異を有するところから C1 系統と推測できる。 (2) M70、M72、M64 は、16223、16362、16390 を有する。この配列は東アジアでは D5a に類似しているが、D5a は 16519、150 の変異を持つため、南アジアでは E 系統の可能性が最も高い。 (3) M13、M75 はいずれも極めて近似した配列で、489 を有するため M 系統ではあるが、3010G で 5178A であるため D 系統には属さない。本例と類似した配列はタイ集団に１人見い出されているが、東アジアでは認められていないところから、新しい M 系統に属する可能性が高い。 (4) M62、M67 は 16093、16129、16256、16271 の変異を有する点は、Macauley et al.（2005）のマレー原住民に見い出された M21a 系統の試料と共通する。 (5) M61 は 489 の変異を有するため M 系統であるが、3010G、5178C で変異を持たないところから、D 系統には属さず、その他の既報の M 系統とも共通しないところから、新しい M 系統に属すると考えられる。 (6) M66 は 3010A、5178A の変異を有するところから D 系統で、さらに 16129、 16362、152 の変異を持つため、D4a 系統と判断できる。. 4.

(7) (7) M65 は 5178A で変異を持つが、3010G で変異を有していないため、D 系統ではあるが D4 ではなく、D5 の特徴も持たない。しかし Kong et al. (2003）の D6 系統と配列が近似しているため、D6 系統と判断した。 (8) M63 は 16136、16189、16217 の変異を有するところから、B4b 系統であることがわかる。 (9) M71 は 16140、16189、16217、16274、150 の変異を有するため、B4c1b1 系統と判断できる。この配列は中国人に同じ配列が見い出されているが、日本人においても類似した配列がある。 (10) M68 は、16140、16189、16266、210 の変異を有するところから B5a 系統と判断できる。 (11) M69、M74 はいずれも同じ配列を示し、16129、16172、16304、249d の変異を持つところから F1a1 系統と判断できる。 2. 全ゲノム塩基配列決定による新しい系統の確立前記の試料において、M13 と M75 は同じ系統として複数個体見い出され、しかも東アジアではタイ人に同じ HV1 領域の配列が見い出されている他には報告がなく、既存の M 系統の subgroup のいずれに該当するか否か不明であった。そこで全ゲノム配列を決定してその特徴を検討した。全ゲノム配列の決定は LA Taq により 4kb ほどの大きさの PCR 産物を増幅し、ぞれぞれの産物を６つほどのプライマーを用いて一部を重ねながら塩基配列を決定した。その結果、コーディング領域の変異部位は、750、1438、2706、4688、4769、5054、6032、6293、6620、 6962、7028、7226、7642、8297、8701、8860、9540、10398、10400、10873、11719、 12705、12948、13802、14766、14783、15043、15301、15326、15663 であった（追加資料）。これらの変異部位のうち、750、1438、2706、4769、7028、8860、14766、 15326、 11719 はほとんどの試料が変異を有する部位で、 8701、 9540、10398、 10400、 10873、12705、14783、15043、15301 は M 系統に特徴的な変異を示す。その他の 4688、5054、6032、6293、6620、6962、7226、7642、8297、12948、13802、15663 はこの系統に特有の変異として見い出されたものであるが、4688、5054、6293、 6620、6962、7642、15663 は他の系統でも変異が見つかっている。しかしこれらはいずれも１箇所の変異のみを共有しているため、いずれかと同じ系統に属するとは考えづらい。その他の 6032、7226、8297、12948、13802、15663 は他の系統に見い出されていない。つまり本系統は未だ報告のない、新しい M 系統と. 5.

(8) 考えるべきで、本研究では仮に M*new と呼称した。. 考. 察. 今回 16 人のマレー人についてミトコンドリア DNA 多型の検査を行い、コントロール領域の変異部位の特徴から、それぞれの系統を推測した。推測に当たり、東アジアの確立された系統を参考にしたが、著者らは既に一部の系統についてはマレー人の系統を明らかにしているため、私達の既報のデータも考慮に入れている（水口ら、2006）。このようにして系統を決定した系統のうち、東アジアに広く分布する C1、D4a、B4b、B4c1b1、F1a1 系統の配列を日本人および中国人、韓国人のデータと比較したところ、C1 はいずれにも余り類似した配列は見い出せなかったが D４は中国の Xinjiang の配列に近似した配列が見い出された（Yao et al. 2002）。これに対し B4b、B4c1b1、F1a1 配列は異なる変異も有するが比較的類似した特徴を有し、これらの系統がアジアに広く、しかもおそらく短い期間で広がったことを示唆している。D6 は Kong et al. (2003)が東アジアの中国人に１例を報告しているが、相対頻度から考えるとマレー人の方が頻度が高いことになり、南アジア系の系統であるのかも知れない。その他の系統についてはいずれも東アジアのデータにほとんど無く、マレー原住民、タイ、フィリピンの集団などに一部が認められるところから、南に広がった系統と考えられる。今回２例に認められた M 系統の全ゲノム塩基配列を決定した。このことにより M*new は少なくとも６カ所の変異は今までのデータに認められない変異を有していた。その他の７カ所の変異は他の系統にも認められたものの、5054、6620、 7642 がそれぞれ M*の新しい系統、E 系統、M11 系統に認められたことを除くと、その他はいずれも N 系統の変異であるところから、３つの M 系統のいずれかと同じ枝に当たるとは考えにくい。おそらく M の幹から直接、古い時期に分かれた新しい枝に相当するものであろう。今回確立した系統はインド、東アジアに認められていないところから、インド中央部を通らずマレーシア付近にヒトが拡散した移動中に生じた系統と考えられる。マレー人には東アジア、インドに見い出されていないいくつかの系統がまだ他にも認められており、いずれも M 系統の幹から直接分岐している可能性が高い。この事実は旧石器時代より以前の古い時期に、マレーシア付近で人口が急激に増加した可能性を示唆している。. 6.

(9) 今回のマレー人における系統の調査から、マレー人に南に広がった系統が見い出されたこと、東アジアに広がった系統に日本と異なる変異を有していることなどが明らかとなった。本研究は法医学領域において、アジア人を対象とした１人の人間の地理的由来を推定するための有用な情報として役に立つ。謝辞稿を終わるにあたり、本研究遂行に際して懇篤なる御指導を戴いた水口清教授ならびに丸山澄助手に深甚なる謝意を表します。. 文. 献. Anderson S, Bankier AT, Barrell BG, de-Bruijn MH, Coulson AR, Drouin J, Eperon IC, Nierlich DP, Roe BA, Sanger F, Schreier PH, Smith AJ, Staden R, Young IG (1981) Sequence and organization of the human mitochondrial genome. Nature 290: 457-465. Andrews RM, Kubacka I, Chinnery PF, Lightowlers RN, Turnbull DM, Howell N (1999) Reanalysis and revision of the Cambridge reference sequence for human mitochondrial DNA. Nat Genet 23:147. Bar W, Brinkmann B, Budowle B, Carracedo A, Gill P, Holland M, Lincoln PJ, Mayr W, Morling N, Olaisen B, Schneider PM, Tully G, Wilson M (2000) DNA Commission of the International Society for Forensic Genetics: guidelines for mitochondrial DNA typing. Int J Legal Med 113:193-196. Bogenhagen. D,. Clayton. DA. (1974). The. number. of. mitochondrial. deoxyribonucleic acid genomes in mouse L and human HeLa cells. Quantitative isolation of mitochondrial deoxyribonucleic acid. J Biol Chem 249: 7991-7995. Fucharoen G, Fucharoen S, Horai S (2001) Mitochondrial DNA polymorphisms in Thailand. J Hum Genet 46:115-125.. 7.

(10) Herrnstadt C, Elson JL, Fahy E, Preston G, Turnbull DM, Anderson C, Ghosh SS, Olefsky JM, Beal MF, Davis R E, Howell N (2002) Reduced-median-network analysis of complete mitochondrial DNA coding-region sequencesfor the major African, Asian, and European haplogroups. Am J Hum Genet 70:1152-1171. Ingman M, Gyllensten U (2003) Mitochondrial genome variation and evolutionary history of Australian and New Guinean aborigines. Genome Res 13:1600-1606. Kong QP, Yao YG, Sun C, Bandelt HJ, Zhu CL, Zhang YP (2003) Phylogeny of east Asian mitochondrial DNA lineages inferred from complete sequences.. Am J Hum Genet73:671-676. Maca-Meyer N, Gonzalez AM, Larruga JM, Flores C, Cabrera VM (2001) Major genomic mitochondrial lineages delineate early human expansions. BMC Genet 2:13-20. Macaulay V, Hill C, Achilli A, Rengo C, Clarke D, Meehan W, Blackburn J, Semino O, Scozzari R, Cruciani F, Taha A, Shaari NK, Raja JM, Ismail P, Zainuddin Z, Goodwin W, Bulbeck D, Bandelt HJ, Oppenheimer S, Torroni A, Richards M (2005) Single, rapid coastal settlement of Asia revealed by analysis of complete mitochondrial genomes. Science 308:1034-1036. Maruyama S, Minaguchi K, Saitou N (2003) Sequence polymorphisms of the mitochondrial DNA control region and phylogenetic analysis of mtDNA lineages in the Japanese population. Int J Legal Med 117:218-225. 水口清、丸山澄、野平千鶴、佐々木継泰、石川昂、Phrabhakaran Nambiar （2006）マレーシア・クアラルンプール周辺に在住するマレー人のミトコンドリア DNA 多型解析。DNA 多型 Vol.14:91-94。. 8.

(11) Palanichamy MG, Sun C, Agrawal S, Bandelt HJ, QP, Khan F, Wang CY, Chaudhuri TK, Palla V, Zhang YP (2004) Phylogeny of mitochondrial DNA macrohaplogroup N in India, based on complete sequencing: implications for the peopling of South Asia. Am J Hum Genet. 75:966-978. Rajkumar R, Banerjee J, Gunturi HB, Trivedi R, Kashyap VK (2005) Phylogeny and antiquity of M macrohaplogroup inferred from complete mt DNA sequence of Indian specific lineages. BMC Evol Biol 5:26. Tanaka M, Cabrera VM, Gonzalez AM, Larruga JM, Takeyasu T, Fuku N, Guo LJ, Hirose R, Fujita Y, Kurata M, Shinoda K, Umetsu K, Yamada Y, Oshida Y, Sato Y, Hattori N, Mizuno Y, Arai Y, Hirose N, Ohta S, Ogawa O, Tanaka Y, Kawamori R, Shamoto-Nagai M, Maruyama W, Shimokata, H, Suzuki R, Shimodaira H. (2004) Mitochondrial genome variation in eastern Asia and the peopling of Japan. Genome Res 14:1832-1850. Umetsu K, Tanaka M, Yuasa I, Saitou N, Takeyasu I, Fuku N, Naito E, Ago K, Nakayashiki N, Miyoshi A, Kashimura S, Watanabe G, Osawa M (2001) Multiplex amplified product-length polymorphism analysis for rapid detection. of. human. mitochondrial. DNA. variations.. Electrophoresis. 22:3533-3538. Upholt WB, Dawid IB (1977) Mapping of mitochondrial DNA of individual sheep and goats: rapid evolution in the D loop region. Cell 11: 571-583. Yao YG, Kong QP, Bandelt HJ, Kivisild T, Zhang YP (2002) Phylogeographic differentiation of mitochondrial DNA in Han Chinese. Am J Hum Genet 70:635-651. Kivisild T, Tolk HV, Parik J, Wang Y, Papiha SS, Bandelt HJ, Villems R (2002) The emerging limbs and twigs of the East Asian mtDNA tree. Mol Biol Evol. 9.

(12) 19:1737-1751.. 10.

(13) 表１ PCR増幅に用いたプライマープライマー. bp. Tm値. 15978. F 20 caccattagcacccaaagct 60. 68. R 20 cccagacgaaaataccaaat 56. 16481. F 20 aagtgaactgtatccgacat 56. 698. R 21 gcatgtgtaatcttactaaga 56. 771. F 20 aatgcagctcaaaacgctta 56. 4798. R 20 ggggctattcctagttttat 56. 4506. Ｆ 20 atctttgcaggcacactcat 58. 8539. R 21 gattttcgttcattttggttc 58. 8239. F 20 ctttgaaatagggcccgtat 58. 12360. R 20 ggttatagtagtgtgcatgg 58. 12219. F 22 aagaactgctaactcatgccc 58. 13830. R 20 aagtcctaggaaagtgacag 58. 13681. Ｆ 20 accctactaaaccccattaa 56. 15964. R 20 tttctctgatttgtccttgg 56.

(14) 表２ 16例のマレー人のミトコンドリアDNA多型のコントロール領域の変異部位。3010、5178の変異は必要な場合のみ検査した。太字は系統に特徴的な変異部位を表わす。 16024-16569. 1-579. (16000+). 3010 5178. C1. M73. 223,298,316,327,519. 73,143,249d,263,309.1,315.1C (315.1→NT). E. M70. 223,291,362,390,519. 73,263,315.1C,489. E. M72. 223,291,362,390,519. 73,186,263,315.1C,489. E. M64. 223,362,390. 73,195,263,315.1C,489. G. C. M*new. M13. 129,153,172,223,263,526. 73,204,207,263,315.1C,466,489. G. C. M*new. M75. 129,153,172,223,263,309,526. 73,204,207,263,315.1C,466,489. M21a. M62. 93,129,223,256,271,362,. 73,152,263,315.1C,489. M21a. M67. 93,129,223,240,256,271,362 73,263,315.1C (317→NT). M*. M61. 223,243,262,278,311,319,519. 73,152,263,315.1C,489,499,524.1A,524.2C G C. D4a. M66. 129,223,249,278,311,362. 73,152,263,315.1C,489,524.1A,524.2C A. A. D6. M65. 189,223,311,362,519. 73,152,263,315.1C,489. A. B4b. M63. 136,182,183,189,,217,519. 73,204,263,315.1C,523d,524d. B4c1b1. M71. 140,182,183,189,217,274,335 73,146,150,263,315.1C. B5a. M68. 140,183,189,266,519. 73,210,263,315.1C,523d,524d. F1a1. M69. 129,172,304,519. 73,249d,263,315.1C,523d,524d. F1a1. M74. 129,172,304,519. 73,249d,263,315.1C,523d,524d. *NT = not tested. C. C G. G. C. C. C.

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