ヒト血中 corticotropin-releasing factor-binding protein のラジオイムノアッセイ

原 著 〔東女医大誌 第64巻 第2号頁97∼101平成6年2月〕

ヒト血中corticotropin−releasing factor−binding

proteinのラジオイムノアッセイ

東京女子医科大学 第二内科学教室（主任         オオ   モリ   ナリ   コ

        大 森  就 子

出村 博教授） （受付 平成5年10月6日）

Radioimmunoassay for Corticotropin−Releasing Factor・Binding

       Protein in Human P藍asma

       Nariko OMORI

Department of Medicine II（Director：Prof． Hiroshi DEMURA）， Institute of Clinical End㏄rinology，        Tokyo Women’s Medical College   Plasma immunoreactive corticotropin−releasing factor・bind玉ng protein（CRF−BP）concentrations were determined by using a radioimmunoassay（RIA）for human CRFBP． Binding of CRFBP to the antiserum against the C−terminal fragment of CRF−BP was unaffected by human CRF． The basal plasma CRF−BP concentrat童on was 4ユ9±0．57 nmol／L（mean±SD）． Plasma CRFBP levels were藍ower in patients with cushing’s syndrome than in normal subjects， but higher in patients with Addison’s disease． Thus， there was a negative correlation between the basal plasma level of CRF−BP and cortisol．   These findings indicate that the CRF・binding site is not the C−term童nal side of CRF−BP and that plasma CRFBP levels are affected by plasma cortisol levels， at Ieast in chronic conditions．       緒  言

 ヒト血中には，adrenocorticotropic hormone

（ACTH）分泌刺激因子であるcorticotropin−

releasing factor（CRF）に特異的に結合する蛋白 CRF−binding protein（CRFBP）が存在する1）∼3）．

 我々は以前，ラベルしたCRFとCRF−BPとの

binding assay法により， CRF−BPの分子量が約

38，000で，分子内にS−S結合を有する糖蛋白であ

ること鋤，糖質コルチコイドの抑制を受けるこ

と5），また，贋帯血中にも存在し，分娩直前に減少

し，分娩後の新生児では1週間前後で回復するこ

と6），更にCRFはCRF−BPとの結合により，その

ACTH放出活性が不活化されること3），などを報

告した．ヒトでは，血中に存在するが，髄液中に

存在せず，ラット，ヒツジ，ウシ，ウサギの血中

には存在しないという種属特異性がある3）．

 1988年置Behanらにより，ヒト血漿からCRF−

BPが単離され7），1991年， Potterらにより，322個 ．のアミノ酸から成る一次構造が報告された8）．ま

た最近，CRF−BPmRNAがヒトの肝と胎盤，更に

ヒト，サルおよびラットの脳に存在することが明

らかとなった9）．

 今回，CRF−BPのC末端に対する抗体を用いた

radioimmunoassay（RIA）を確立し，その基礎的

検討を行った．       対象と方法

1．RIA

 1）ペプチド

  ヒトCRF−BPのC末端25個のアミノ酸から成

るフラグメントCRF−BP（298∼322）を用い，サ

イログロブリンとconjugateした後，家兎に免疫

して抗血清を作製した．更に，このフラグメント

をstandardとtracerに用いた． CRF−BP

（298∼322）のヨード化はヨードゲン法にて行っ

た．

 2）抗血清

 CRF・BP（298∼322）に対する抗血清は最終希釈

1：10，000で使用した．外因性CRFに対する交

叉は見られなかった．

 3）Assay

 （1） Incubation

 RIA用bufferとして，25mM Tris−saline， pH

7．5（0．1％ウシ血清アルブミン，5mM MgC12，

0．04％アジ化ナトリウムを含む）を用いた．CRF− BP（298∼322）を0∼1．000fmol／tubeの濃度で，

standardとして用いた．検体の希釈曲線には，加

熱不活化したウマ血清を用いて調整した．Stan−

dardには， carrier proteinとして，上記のウマ血

清50μ1を加え，更に抗体溶液を0．1mlずつ加え

た．次に，1251−CRF・BP（298∼322）0．1ml（約2，500

cpm）を添加し， incubation volumeを0．5mlと

し，4℃で48時間incubationした． Assayは全て

duplicateで行った．

 （2）B／F分離

 各チューブにphosphate・buffered salineで溶

解した0．2％ウシγ一グロブリン0．5m］と25％ポリ

エチレングリコール1m1を加え，3，000rpmで30

分間遠心し，上清を吸引除去し，pelletの放射活性 をγカウンターで測定した．

 2．ゲル濾過

 本RIAが確かに血中CRF−BPを測定している

ことを証明するため，血漿をセファクリルS−200

のゲル濾過にかけ，CRF−BPの免疫活性のピーク

が，1251一ヒトCRFとCRF−BPの結合体のピーク

に一致するかどうかを検討した．

 3．対象

 健常人23例，Cushing症候群（副腎腺腫による）

8例，アジソン病7例より，早朝空腹時に，EDTA

の入ったチューブに採血し，4℃にて冷却遠心後，

血漿を一20℃で凍結保存した．

 4．統計

 有意差検定は，一元配置の分散分析法にて行い， p〈0，05を有意とした．

         結  果

 1．標準曲線と血漿の希釈曲線（図1）

 本RIAの検出感度は2fmol／tubeであり，標準

曲線のIC50は，60fmol／tubeであった．血漿CRF−

BPの最：小検出濃：度は，40pmo1／しであり，最高20

nmol／しまで測定可能であった．一方，健常人血漿

の希釈曲線は，標準曲線と良好な平行関係を示し

た．

 Intra・aSSayおよびinter−aSSayは，それぞれ

5．7％，11．8％であった．

 2．CRFの影響（図2）

 CRF−BPとその抗血清との結合に， CRFが影

響を与えるか否かを調べるため，assay系のstan−

dardまたはCRF−BPを含む検体（血漿）に，ヒト

CRF 10ngを添加し， B／B。比を検討してみたが，

CRFの添加による影響は見られなかった．

BIBo

1．0 0．5 0 1芒至ヨ0μIPI・・m・     ■■岡一  Standard

一98一

 1     10     100    1000        Peptide（fmol／tube） 図1 CRF−BPの標準曲線と血漿の希釈曲線 B／BO

 tO

0．5 0．0  CRF（10ng） 一  十  一  十  一  十  Plasma（50μ1）一  一  十  十  一  一  Standard   ＿  一  一  一  十  十 （CRトBP＝298「322）

図2 CRF−BPのRIAに及ぼすCRFの影響

O．3 君 § 虐） 0．1

ND→

IgG ↓ ＿尋r Gel filtratlon chromatography of plasma    Bound HSA 1251−hCRF ↓  ↓

OVA

↓    只    ノ へ   ／ ＼   〆 、

 ／  ＼    ！

ノ   ＼、叡 ノ

Free 1251−CRF  ↓ ’ 1 R ！、 ノ 、

ノ ＼

＼ 、圃L噛   言   黒   ミ 6000 籠

  3

  ら 

4000告9

  誕1

  室6

2000歪）     20      30       Fraction number

      図3 血漿CRF−BPのゲル濾過

HSA：human serum albumin， OVA l ovalbumin， hCRF；ヒトCRF． 40 0 浮 目

 3．ゲル濾過（図3）

 CRF−BPの免疫活性のピークは，1251−hCRFと．

CRF−BPの結合体の溶出部位の1フラクション

後に見られた．この1フラクションのずれは，

CRF・BPに1251一ヒトCRFが結合し，その分，分子

量が増加したためと思われた．

 4．ヒト血漿CRF・BP濃度（図4）

 早朝空腹時の健常人23例の血漿CRF−BP濃度

は，4，19±0．57nmol／L（mean±SD）で，その範

囲は，3．31∼5．39nmol／しであった．副腎性Cush− ing症候群では，3．29±1．00nmol／しと健常人に比 べて有意に三値を示した（p＜o．01）．一方，Addis− on病群では，5．78±1．10nmol／しと有意に高値を 示した（p＜0．01）．

         考  察

 CRF・BP（298∼322）をstandardおよびtracer

として用いたRIAにおいて，ヒト血漿の希釈曲線

は標準曲線と良好な平行関係を示し，その免疫活

性は，ゲル濾過によりCRF−BPであることが明ら

かとなった．一方，CRF−BPは，ヒトCRFと特異

的に結合するが，CRF−BPのassay系に，ヒト

CRFは何ら影響を与えなかった．ここで用いた

CRFBP抗血清はC端抗体であることから，

CRF−BPのCRFとの結合部位は， CRF−BPのC

CRF−BP （nmo11L）  10．0 5．0 0．0

一「

       ●  齢。

欝

巳

ヰ

●3

   図4

＊p〈0．01vs． norma1． Norma［  Cushing闘s Addlson’s    syndrome disease    （AdrenaD 血中CRF一弓P濃度の基礎値

端側ではなく，N端側であることが示唆された．

 このassay系における健常人血車中のCRF−

BP濃：度は，4．19±0．57nmo1／L（mean±SD）で

あった．また，LintonらのCRF−BP（1∼322）を

用いたassay系では，4．46±1．0㎜01／L9）とよく

類似しており，この抗体のCRF・BP（1∼322）に

対する交叉率は，ほぼ100％に近いものと思われ

た．

 Cushing症候群における血中CRF−BP濃度は

低下で，Addison病では高値を示した．このこと

から，慢性のコルチゾール過剰状態では，CRF−BP

は三値を，慢性の副腎不全では高値を示すという

ことになる．これらの結果は，以前CRFとCRF−

BPとの結合能を用いて，血中CRFBPレベルと

コルチゾールレベルとの間に負の相関があること

を証明したが，その結果と一致する．また，Addis−

on病の結果から，血中ACTHがCRF−BP濃度に

直接的な影響を与える可能性は少ないものと思わ

れた．CRFに対する影響に関しては，ヒト血中に

おいてヒトCRFのクリアランスに及ぼす影響は

余り強くないが10），ヒトCRFを急速投与すると

一過性にCRFレベルが低下すると言われ，これ

はCRF−BPがCRFと結合することにより，

dimerを形成するためと考えられている11）．

 CRFおよびその標的細胞受容体は，中枢神経

系，胎盤，副腎，交感神経節，リンパ球，消化管， 膵臓，性腺系に広く分布し12）’3），また，2重免疫染

色法により，CRFとCRF−BPは共存しているこ

とが確認されている14）．一方，CRF−BPのヒト

・CRFに対する結合能は， CRF一レセプターの結合

能と同程度であることから3），CRF−BPがCRFレ

セプターの一部である可能性も残されている．し

かし，CRFレセプターは，ヒト，ヒツジのいずれ

のCRFとも結合するが， CRF・BPはヒツジの

CRFとは結合せず， CRF−BPがCRFレセプター

の一部である可能性は少ないものと思われる．

 CRF−BPがCRFに対する特異的なアンタゴニ

ストであり，しかも脳に多く存在するこ．とから，

neuromodulatorとしてCRFの中枢での作用に

何らかの影響を及ぼしている可能性も考えられ，

今後，更に検討されるものと思われる．

      結  語

 ヒトCRF−BPのC末端フラグメントを用い

て，CRF−BPのRIAを確立した．血中CRF−BP濃

度は健常者に比し，Cushing症候群では低値を示

し，Addison病では高値を示したことから，漫性

的な血中コルチゾールレベルの変動に影響される

ことが示された．  稿を終えるにあたり，御指導，御校閲を賜りました 出村 博教授に深謝申し上げます．またこの研究に際 し，直接御指導頂いた須田俊宏助教授，佐藤雄二先生 に心より感謝致し，御礼申し上げます．       文  献  1）Orth DN， Mount CD＝Specific high−af五nity   binding protein for human corticotropin−   releasing hormone in normal human plasma．    Biochem Biophys Res Commun 143：411−417，    1987  2）Linton EA， Wolfe CDA， Beban DP et al：A   specific  carrier  substance  for human   ．corticotropin−releasing  factor in  late ges・   tational matemal plasma which could mask   the ACTH−releasing activlty． Clin Endocrinol   （Oxf）28：315−324， 1988  3）Suda T， Iwashita M， Tozawa F et a1： Char−   acterization  of corticotropin−releasing  hor−   mone binding protein in human plasma by   chemical cross・linking and its binding during   pregnancy． J CIin Endocrinol Metab 67：   1278−1183， 1988  4）Suda T， Sumitomo T， Tozawa F et al：   Corticotropin・releasing  factor is a  glyco−   protein． Biochem Biophys Res Commun 165：   703−707， 1989  5）Suda T， Sumitomo T， Nakano Y et a1：   Glucocorticoids decrease a binding of   corticotropin−releasing hormone・binding Pro−   tein in human plasma． J CIin EndocrinQl Metab   71：913−917， 1990  6）Suda T， Iwashita M， Sumitomo T et al：   Presence of CRH・binding protein in amniotic   ’Huid and in umbilical cord plasma． Acta Endo−   crinol 125：165−169， 1991  7）Behan DP，1．inton EA， Lowry PJ： Isolation   of the human plasma corticotropin・releasing   factor−binding protein． J Endocrinol 122：   23−31， 1989  8）Potter E， Behan DP， Fischer WH et al：   Cloning and characterization of the cDNAs for   human and rat corticotropin・releasing factor．   binding proteins． Nature 349：423−426，1991  9）Lin．ton EA， Perkins AV， Woods RJ et al：．   Corticotropin・releasing hormone・binding pro．   tein（CRF・BP）：Plasma levels decrease during   the third trimester of normal human preg．   nancy． J CIin Endocrinol Metab 76：260−262，

  1993

 10）Suda T， Iwashita M， Ushiyama T et al：   Responses to corticotropin−releasing hormone   and its bound and free forms in pregnant and   nonpregnant women． J CIin Endocrinol Metab   69：38−42， 1989 11）Woods RJ， Kennedy KM， Saphier PW et al： 一100一

Dimerisation on circulating CRH-binding tein in the presence of its ligand may trigger clearance of the cortex. 75th Annual Meeting of the Endocrine Society (USA). Abstract : 362,

1993

12) Suda T, Tomori N, Tozawa F et al :

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corticotropin-releasing factor in human tissues.

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13) Aguilera G, Millan AM, Hauger LR et al :

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14) Potter E, Behan DP, Lonton EA et al: The

central distribution of a corticotropin-releasing

factor (CRF)-binding protein predicts multiple sites and modes of interaction with CRF. Proc Natl Acad Sci SUA 89 1 4192-4196, 1992