序 文
近年， 難治性疾患に対する治療の高度化に伴い，
免疫不全患者の数は増加の一途をたどっている．
免疫不全患者に発症することが多い日和見感染の 一つに深在性真菌症がある．
深在性真菌症の診断法として，菌体の細胞壁構 成成分の（1→3） -β-D-グルカンの測定法が知られ ており
1）〜3），本邦では現在， 測定方法の異なる数種 のキットが実用化されているが， サルファ剤
4），溶 血
5），免疫グロブリン G（IgG）
5）の影響を受けると いった問題が指摘されている．
最近，これらの問題を克服した
β-グルカンテス トマルハが開発されたので， その性能を評価した．
材料と方法
（1→3）-
β-D-グルカンの測定には，
β-グルカンテ ストマルハ（体外診断用医薬品，カットオフ値：
11pg
!ml，製造元：マルハ，発売元：和光純薬工 業）を用いた．
干渉物質の影響を調べるため，深在性真菌症治 療薬，ST 合剤，サルファ剤，抗生物質，抗菌薬，
輸液剤，造影剤の影響を調べた．
深在性真菌症治療薬としてフルコナゾールの
「ジフルカン静注液」 （ファイザー製薬製造） ，ミコ ナゾールの 「フロリード F 注」 （持田製薬製造） ，イ トラコナゾールの「イトリゾールカプセル 50」 （ヤ ンセンファーマ製造） ，アンホテリシン B の 「ファ ンギゾン」 （ブリストル製薬製造） ， フルシトシンの
「アンコチル錠」 （日本ロシュ製造）を用いた．
抗菌薬の ST 合剤としてスルファメトキサゾー
血中
β-グルカン濃度を測定する新規の深在性真菌症診断法の性能評価
新潟大学大学院医歯学総合研究科臨床感染制御学分野
茂呂 寛 塚田 弘樹 小原 竜軌 諏佐理津子 田邊 嘉也 鈴木 栄一 下条 文武
（平成 14 年 10 月 15 日受付）
（平成 15 年 1 月 27 日受理）
深在性真菌症の高感度診断法として新たに開発されたβ-グルカンテストマルハは，菌体の細胞壁構成 成分の（1→3）-β-D-グルカンを検出するものである．本報告では，β-グルカンテストマルハの性能を評価 した．
β-グルカンテストマルハは，既存の（1→3）-β-D-グルカンの測定法で指摘されているサルファ剤，溶血，
免疫グロブリン G（IgG）の影響を受けるという問題点を克服しており，それぞれ 200µg!ml，500mg!dl，
6,000mg!dl 以下の濃度ではこれらの影響を受けないことが確認された．
さらに投与薬剤の影響を調べるため，深在性真菌症治療薬 5 種，抗生物質 8 種，合成抗菌薬 1 種，輸 液剤 2 種，造影剤 1 種の影響を調べた結果，β-グルカンテストマルハは，これら薬剤濃度が実用的濃度下 では，深在性真菌症の診断への影響を受けないことが確認された．
〔感染症誌 77：219〜226，2003〕
要 旨
別刷請求先：（〒951―8510）新潟市旭町通 1 番町757番地 新潟大学医学部第 2 内科 塚田 弘樹
Key words： β-glucan, deep mycosis
ル・トリメトプリムの「バクタ錠」 （塩野義製薬製 造） ，サルファ剤としてスルファメチゾールの 「ウ ロサイダル末」 （三生医薬製造）を用いた．
抗生物質として，硫酸ゲンタマイシンの「ゲン タシン注 10」 （シェリング・プラウ製造） ，イミペ ネム・シラスタチンの「チエナム点滴用」 （万有製 薬製造） ，塩酸バンコマイシンの 「塩酸バンコマイ シン点滴静注用」 （日本イーライリリー製造） ， フロ モキセフナトリウムの「フルマリン静注用」 （塩野 義製薬製造） ，セフメタゾールナトリウムの 「セフ メタゾン静注用」 （三共製造） ， ピペラシリンナトリ ウムの 「ペントシリン注射用」 （三共製造） ，アジス ロマイシンの「ジスロマッ ク カ プ セ ル 小 児 用」
（ファイザー製薬製造）を用いた．
また抗菌薬としてシプロフロキサシンの「シプ ロキサン注」 （バイエル薬品製造） ， 輸液剤としてデ キストランの「デキストラン 40 注」 （小林製薬製 造）とブドウ糖の「ブドウ糖注射液（20％）」 （メル ク・ホエイ製造） ， 造影剤としてイオパミドールの
「イオパミロン 370」 （日本シェーリング製造）を用 いた．
溶血モデルとして，ヒト血球ライセートは健常 人から採取して用いた．IgG モデルとして pH4 処理ヒト免疫グロブリンのポリグロビン N（バイ エル薬品製造） ， 乳びモデルとして静注用脂肪乳剤 のイントラリピッド 20％（フレゼニウス・カビ社 製造，スウェーデン）を用い，ビリルビンは和光 純薬製造のものを用いた．
試験に用いた臨床検体は， 健常人及び 2000 年〜
2001 年の間に新潟大学医学部附属病院入院患者 からヘパリン添加注射器を用いて採取後，遠心分 離した血漿を用いた．検査直前まで冷蔵保存を 行った．
希釈加熱法を前処理法とする
β-グルカンテス トマルハの測定手順を以下に示す．
マ イ ク ロ プ レ ー ト 上 に 血 漿 5
µl，前 処 理 液
（0.01％TritonX-100， 4mM NaIO
4，2mM NaOH）
45
µl を加え，プレートインキュベータ（バイオ テック社製 HBI-24）内に入れて 75℃ で 15 分間加 温し，前処理を行った．室温下で放冷後，反応試 薬 50µl を添加し，再びプレートインキュベータ内
に入れて 37℃ で 30 分間酵素反応を行った．発色 試薬（2.7％ SDS，4.5m M N， N-ジエチルアニリン 塩酸塩，91mM オルト過よう素酸） 100
µl を添加し て，反応停止と共に発色させ，マイクロプレート リーダー（SPECTRA max250， Molecular Devices 社製，アメリカ合衆国）で波長 730nm と波長 650 nm における吸光度の差を測定した．同時に反応 させた標準品（シイタケ由来レンチナン）より検 量線を作成し，検体中の （1→3） -
β-D-グルカン濃度 を算出した．
成 績
β
-グルカンテストマルハについて検量線を作成 し た（Fig. 1） ．縦 軸 に 吸 光 度（730nm と 650nm の差），横軸に（1→3） -β-D-グルカン濃度をとり，
5 回測定した平均値と SD（標準偏差）値をプロッ ト し た． （1→3） -
β-D-グ ル カ ン 濃 度 を 左 図 A で は 140pg
!ml まで，右図 B では 320pg
!ml までプロッ ト し た．Fig. 1B か ら 明 ら か な よ う に 200pg
!ml 以上の濃度ではプロットが直線から外れることが 確認された．また 140pg
!ml 以上では，120pg
!ml 以下と比べて SD 値が大きくなったことから 120 pg
!ml まで測定可能と判断した．
Table 1 は 2 検体（血漿）につき，測定回数 10 回で行った同時再現性試験の結果である．CV（変 動係数）値は 6％ 以下と良好な結果であった．
検出限界を調べるため，Fig. 2 に示すように，
（1→3） -
β-D-グルカン濃度 8pg
!ml 以下の吸光度を 測定した．測定は 5 回行い，平均値と 2SD 値を示 した．直線性から，1.2pg
!ml 以上の濃度であれば 十分検出可能と判断した．
また健常人血漿 6 検体に標準品を添加して測定 したところ，Table 2 に示すように，添加（1→3） -
β-D-グ ル カ ン 濃 度 17.2pg
!ml に お け る 回 収 率 は 90〜114％，51.9pg
!ml に お け る 回 収 率 は 86〜
113％ であり，示した全データの相関係数は 0.962 であった．
Fig. 3 は健常人 75 名を対象に
β-グルカンテス トマルハで血中（1→3） -
β-D-グルカン濃度を測定 した結果である．図から明らかなように全てカッ トオフ値の 11 pg
!ml 以下の値を示した．
次に
β-グルカンテストマルハについて，ST 合Table 1 Within-run Reproducibility measured value（pg/ml）
sample 2 sample 1
80.6 12.6
1
82.3 10.7
2
81.7 10.7
3
83.8 10.7
4
85.2 11.2
5
86.4 11.8
6
79.6 10.5
7
81.7 10.7
8
81.9 10.7
9
82.9 10.7
10
82.6 11
Average
1.9 0.60
SD
2.4 5.7
CV （%）
剤，サルファ剤の影響を調べるため，健常人血漿 にそれぞれ ST 合剤（sulfamethoxazole-trimetho- prim），サルファ剤（sulfamethizole）を添加して 確認した．また溶血，IgG，乳び，ビリルビンの影 響を調べるため，モデル系として，ヒト血球ライ セート，pH4 処理ヒト免疫グロブリン，乳化大豆 油， ビリルビンを健常人血漿に添加して確認した．
その結果，Fig. 4 に示すように，
β-グルカンテスト マルハは，ST 合剤，サルファ剤，溶血 （ヘモグロ ビン），IgG（ポリグロビン N），乳び（イントラリ ピッド） ，ビリルビンの影響をそれぞれ 100µg!
ml，200
µg
!ml，500mg
!dl，6,000mg
!dl，1.0％，20 mg
!dl 以下の濃度では，全く受けないことが確認 された．
また投与薬剤の影響を調べるため，5 種の深在 性真菌症治療薬，8 種の抗生物質，1 種の合成抗菌 薬，2 種の輸液剤，1 種の造影剤の影響を調べた
（Table 3） ．各薬剤添付文書記載の薬物動態のデー タから推測した最大血中濃度（maximum concen-
Fig. 1 Standard Curve ofβ-Glucan Test Maruha.Fig. 2 Limit of Detection
Table 2 Recovery Ratio
recovery ratio
（%）
detected concentration
（pg/ml）
added concentration
（pg/ml）
sample
― 5.2
0.0
1 17.2 24.5 112%
108%
61.2 51.9
― 3.7
0.0
2 17.2 21.7 105%
104%
57.5 51.9
― 2.1
0.0
3 17.2 21.0 110%
109%
58.6 51.9
― 0.3
0.0
4 17.3 19.9 114%
113%
58.2 51.4
― 18.1
0.0
5 17.3 35.5 101%
86%
62.5 51.4
― 3.1
0.0
6 17.3 18.5 90%
89%
49.0 51.4
Table 3 Effect of Various Drugs on（1 → 3）-β-D-glucan Measurement by β-Glucan Test Maruha
（1 → 3）-β-D-glucan concentration（pg/ml）
/drug concentration（µg/ml）
maximum concentration in plasma described
in pack insert proprietary
generic name name
1.2/10 1.3/5
1.2/2.5 1.4/1.25 1.2/0.625 1.1/0
1.33µg/ml Diflucan
fluconazole
antifungals
1.3/10 1.2/5
1.1/2.5 1.1/1.25 1.1/0.625 1.0/0
3.5µg/ml Florid F
miconazole
1.8/2 1.7/1
1.5/0.5 1.5/0.25 2.1/0.125 1.1/0
0.2µg/ml Itrizole
capsule 50 itraconazole
1.2/10 1.3/5
1.2/2.5 1.1/1.25 1.1/0.625 1.1/0
2µg/ml Fungizone
amphotericin B
6.4/400 5.0/200 2.7/100 2.3/50
1.4/25 1.1/0 25µg/ml Ancotil
flucytosine
0.9/200 0.9/100 1.2/50
0.8/25 0.9/12.5 0.8/0 6.66µg/ml Gentacin
gentamicin sulfate
antibiotics
1.0/400 1.0/200 0.9/100 0.8/50
0.8/25 0.8/0 82.8µg/ml Tienam
imipenem・
cilastatin sodium
0.9/200 0.9/100 1.0/50
0.9/25 1.0/12.5 0.9/0 49.5µg/ml Vancomycin
hydrochloride vancomycin
hydrochloride
0.9/1,000 1.0/500
1.0/250 0.9/125 1.0/62.5 1.0/0 126µg/ml Flumarin
flomoxef sodium
1.0/1,000 1.0/500
0.9/250 0.9/125 0.8/62.5 0.9/0 160.8µg/ml Cefamezin
cefazolin sodium
1.2/1,000 1.0/800
0.8/400 0.8/200 0.8/100
0.9/0 188µg/ml Cefmetazon
cefmetazole sodium
0.9/1,000 0.8/500
0.8/250 0.8/125 0.6/62.5 0.7/0 130µg/ml Pentcillin
piperacillin sodium
0.9/4 1.0/2
0.9/1 0.9/0.5 0.7/0.25 0.8/0 0.58µg/ml zithromax
azithromycin
0.8/20 0.8/10 0.9/5
0.8/2.5 0.8/1.25 0.8/0 3.33µg/ml Ciproxan
ciprofloxacin hydrochloride antibacterial
0.7/40 0.7/20 0.7/10 0.7/5
0.7/2.5 1.1/0 not described Dextran 40
dextran 40 infusion
− 0.1/100 0/50
0/25 0.4/12.5 0.6/6.25
0.7/0 not described Glucose 20
glucose
1.1/20 1.1/10 1.0/5
0.9/2.5 0.8/1.25 0.8/0 1.9mg/ml Iopamiron
iopamidol contrast
media
Fig. 3 Measurement ofβ-Glucan Value for Healthy Controls
Fig. 4 Effect of Coexistent Agent on（1→3）-β-D-glucan Measurement
tration in plasma described in pack insert）の 3〜
16 倍の範囲までの濃度を最大濃度とし，各薬剤に つき各 5 点の濃度における（1→3） -
β-D-グルカン 濃度を測定して，薬剤の影響を調べた．
その結果，Table 3 から明らかなように，anco- til（アンコチル錠）と glucose（ブドウ糖注射液）以 外は調べた濃度に関係なく反応への影響は全く認 められなかった．また ancotil と glucose に関して 影響が認められたのは，実用範囲を著しく超える 高濃度下におけるものであった．
考 察
従来のエンドポイント合成基質法
2）は， 遊離した パラニトロアニリンをジアゾカップリング反応で 発色させるため，ST 合剤，サルファ剤の投与症例 で偽陽性を呈すことが報告
4）されている．しかし
β-グルカンテストマルハ（Fig. 5）は，反応試薬に 含まれる G 因子に血漿または血清中の（1→3） -
β- D-グルカンが作用すると生じる活性型凝固酵素
（clotting enzyme）によって合成基質を加水分解 させ，遊離した 11D を発色試薬と酸化縮合反応に よって発色させ，比色定量することによって検体 中の（1→3） -
β-D-グルカン濃度を測定するエンド ポイント法であり，発色反応にジアゾカップリン グ反応を伴わないので，ST 合剤，サルファ剤の影 響を受けないことが確認された．
またアルカリ処理法・カイネティック合成基質 法
3）では溶血，IgG による偽陽性が問題になってお り，100mg
!dl 以上のヘモグロビン濃度，2,900mg
!dl 以上の IgG で強い偽陽性を呈すことが報告
5）さ れている．しかし
β-グルカンテストマルハでは 500mg
!dl の ヘ モ グ ロ ビ ン 濃 度，6,000mg
!dl の IgG 濃度までなら全く影響のないことが確認され た（Fig. 4）．レンチナン無添加群でわずかに（1→
3） -
β-D-glucan 濃度の IgG 濃度依存的増加が認め
られるが，この増加は安息香酸アミジノフェニル
の添加
6）によって完全に抑制されたので，IgG 製剤
Fig. 5 Principle ofβ-Glucan Test Maruha中に混入している（1→3） -
β-D-glucan の影響と考 えられる．
Table 3 に示したように ancotil と glucose だけ が，濃度依存的に （1→3） -
β-D-グルカン濃度がわず かにそれぞれ増大，減少したが，他は薬剤の影響 を全く受けなかった．
ancotil を添加した健常者血漿に CM-カードラ ン添加の影響
7）を調べたところ，ancotil の濃度依 存的な反応はほぼ完全に抑制されたので，ancotil の濃度依存的な反応は薬剤中の（1→3） -
β-D-グル カンによるものである．また ancotil は内服薬なの で，微量の（1→3） -
β-D-グルカンが混入していて も，血中濃度に対する影響は無視できると考えら れる．
glucose による（1→3） -
β-D-グルカン測定値の濃 度依存的減少は，
β-グルカンテストマルハの発色 反応が酸化縮合反応（Fig. 5）であるため，glucose の還元作用による発色阻害と考えられる．また健 常者の血糖値は通常 70〜110mg
!dl であり，重度 の糖尿病患者でも血糖値が 1,000mg
!dl を超える ことは非常にまれであることを考えると，血中 glucose 濃 度 が 1,250mg
!dl 以 上 に 上 昇 す る こ と はほとんどなく，実質的には glucose の影響は受 けないと考えられる．
また
β-グルカンの測定において，抗腫瘍性
β- グルカン製剤であるレンチナン，シゾフィランの 影響が考えられ，現在検討中である．
以上のように，
β-グルカンテストマルハについ て，検量線，同時再現性，検出限界，添加回収試 験，薬剤 （ST 合剤，サルファ剤，深在性真菌症治 療薬，抗生物質，抗菌薬，輸液剤，造影剤）の影
響，溶血，IgG，乳び，ビリルビンの影響を調べた 結果，他の （1→3） -
β-D-グルカン濃度測定診断法に 認められるサルファ剤，溶血，IgG の影響を受けに くい測定法であることが証明された．
文 献
1）Mori T, Ikemoto H, Matsumura M, Yoshida M, Inada K, Endo S,et al.：Evaluation of plasma（1→
3 ）-β-D-glucan measurement by the kinetic tur- bidimetricLimulustest, for the clinical diagnosis of mycotic infections. Eur J Clin Chem Clin Bio- chem 1997；35：553―60.
2）Miyazaki T, Kohno S, Koga H, Kaku M, Mitsutake K, Maesaki S,et al.：G test, a new direct method for diagnosis of candida infection ： Comparison with assays for beta-glucan and mannnan antigen in a rabbit model of systemic candidiasis. J Clin Lab Anal 1992；6：315―8.
3）Tamura H , Arimoto Y , Tanaka S , Yoshida M , Obayashi T, Kawai T：Automated kinetic assay for endotoxin and（1→3）-β-D-glucan in human blood. Clin Chim Acta 1994；226：109―12.
4）池邨勝美，田中 裕，吉岡敏治，杉本 侃：血液 製剤，抗生物質やサルファ剤による合成基質法リ ムルステストおよびエンドトキシン特異的テス トへの干渉．臨床病理 1990；38：87―92.
5）稲田捷也，遠藤重厚：リムルス試薬を用いた血中 エンドトキシンおよびβ-グルカン定量における カイネティック法での特異反応と非特異反応の 判別．医学と薬学 1999；42：885―97.
6）吉田耕一郎，二木芳人，宮下修行，松島敏春：血 中（1→3）-β-D-グルカン測定法の非特異反応検出 に関する検討．感染症誌 2002；76：754―63.
7）土谷正和，高岡 文，時岡伸行，松浦脩治：大過 剰のカルボキシメチル化カードランによる G 因 子系阻害作用を利用したエンドトキシン特異的 リムルステストの開発とその応用．日細菌誌 1990；45：903―11.
Clinical Evaluation of Performance of a New Diagnostic Method for Deep Mycosis by Measuring
β-Glucan Concentration in the Blood
Hiroshi MORO, Hiroki TSUKADA, Tatsuki OHARA, Ritsuko SUSA, Yoshinari TANABE, Eiichi SUZUKI & Fumitake GEJYO
Division of Clinical Infection Control and Prevention Niigata UniversityGraduate School of Medical and Dental Sciences
β
