遺伝性乳がん・卵巣がん症候群の遺伝子検査

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特集遺伝性乳がん・卵巣がん

遺伝性乳がん・卵巣がん症候群の遺伝子検査

昭和大学医学部外科学講座（乳腺外科学部門）

横山士郎

はじめに

遺伝子乳がん・卵巣がん症候群（HBOC）の原因遺伝子として，BRCA1 と BRCA2 の 2 つの遺伝子が 1994 年と続いて 1995 年に同定され，欧米では HBOC の日常診療に広く活用されるようになった^1‑5）．日本では，当初，HBOC は欧米に比べ頻度が少ないのではないかと報じられていたが，菅野らの研究により欧米とほぼ同等かそれ以上の頻度で存在することが報告され，日本でも乳癌の 5 〜 10％

が HBOC である可能性があり，HBOC を念頭に置いた診療体制の整備が求められるようになった^6‑9）．しかし，遺伝性腫瘍の遺伝子検査はまだ診療報酬の適用になったものはなく一般に認知されていないので，今後，臨床現場で広く用いられる状況に備え，

本稿では，遺伝性腫瘍の遺伝子検査で留意すべき事柄を，遺伝子の基礎に立ち返りながら解説する．

遺伝子変異と成人型遺伝病

ヒトの細胞にある常染色体（性別を決める性染色体以外の染色体）は，通常，父親と母親から 1 つずつ受け継がれていて，1 つの遺伝子が機能を失ったとしても，もう 1 つの遺伝子が働くので，細胞の機能が維持される．細胞のがん化を抑制する方向に働く遺伝子（がん抑制遺伝子）では，2 つとも機能を失った時にがん化を抑制する能力を失う「Two hit 説」が提唱されている^10）．また，BRCA1 および BRCA2 遺伝子は，そのタンパクが細胞分裂の際の遺伝子の複写ミスを修復する作用を有することから，ミスマッチ修復遺伝子と呼ばれている．BRCA 1/2 遺伝子の機能喪失により直ぐにがん化が進むのではなく，細胞増殖を制御する種々の遺伝子の変異が積み重なることによりがん化が進むと考えられて

いる．

生まれながらに BRCA1 または BRCA2 遺伝子の 1 つに変異があっても，すぐに乳癌を発症するのではなく，年を経て体の中の細胞が分裂を繰り返す内に，もう一方の BRCA1/2 遺伝子の複製においてミスが起こり，更に細胞内にいくつもの遺伝子変異が蓄積して発がんに至るので，BRCA1/2 遺伝子の変異が遺伝性の病変であっても成人後にがんを発症することが多くなる．

易罹患性遺伝子検査の試料

臨床診断に用いられるがんの遺伝子検査は大きく分けると 2 つに分類できる．1 つは，がん細胞の中のがん関連遺伝子を解析して，がんの性質（悪性度や予後等）を診断する検査である．もう 1 つは，生殖細胞系列のがん関連遺伝子を解析して，その人のがん発症リスク（易罹患性）を診断する検査である．

Her2 遺伝子や K-ras 遺伝子などが前者の検査で，

がん組織そのものを試料とする．HBOC の遺伝子検査は，後者の易罹患性遺伝子検査である．親から受け継いで遺伝子の変化，あるいは発生の初期段階で起こった遺伝子の変化が全身の細胞に複写されているので，血液中の DNA を使用して検査を行う．

がん組織を試料とした場合は，遺伝子の変異が検出されたとしても，その変異が遺伝的変異なのか後発的変異なのか区別がつかないので，がん組織は易罹患性遺伝子検査には適さない．ただし，白血病などで骨髄移植の治療を受けた患者の場合は，血液は本人の生来の細胞ではないので，毛髪や爪から DNA を抽出して使用する必要がある．口腔内擦過細胞を DNA 検査に用いる場合も有るが，擦過細胞は口腔粘膜細胞と血液細胞の混ざりものなので，骨髄移植患者では試料に適さない．

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遺伝子検査の対象者

遺伝が関与すると思われる家族に集積する乳がん

（家族性乳がん）の家系において BRCA1/2 遺伝子に変異が検出される割合は，20 から 30％と報告され，更に卵巣がんも集積する家系においては，

BRCA1/2 遺伝子に変異が検出される割合は 30 から 60％と報告されている．被検者とその家族の乳がん並びに卵巣がんの発症歴により変異が検出される確率が異なるので，臨床現場で被検者に変異の検出確率を説明する際には，米国ミリアド社が公開している検出率の表（表 1）が多く用いられている．

HBOC を疑い BRCA1/2 遺伝子検査を希望する相談者には，家系内で既に乳がんまたは卵巣がんを発症した人で検査を行うことが有効であることを説明する．家族歴はあるが，乳がんも卵巣がんも発症していない人が BRCA1/2 遺伝子の検査を希望する時は，陰性の結果の結果が出た場合に，本人が HBOC 家系における陰性者なのか，BRCA1/2 遺伝子に関係しない家族性乳がん卵巣がん家系の一員なのかの区別がつかないことを理解してもらう必要がある．

可能であれば，相談者を通じ，乳がんまたは卵巣がんを発症した血縁者に遺伝子検査に協力を求めることを検討する．

家系内で複数の既発症者が，同等に遺伝子検査を希望している場合は，変異が検出される確率の高い人に最初に検査を受けてもらうことを勧める．例えば，図 1 の家系の場合，B が変異を有する可能性が最も高いので，最初の相談者が A であっても，もし B も検査に賛同しているなら B から遺伝子検査をすることが勧められる．しかし，実際の検査実施の場面においては，家族の中でも遺伝子検査に関する考え方が一致しているとは限らず，情報の共有ができていない場合もあるので，遺伝子検査の実施に当たっては，次節で解説される遺伝カウンセリングに関する注意を順守する必要がある．

遺伝子の機能

遺伝子にはアミノ酸の配列に関する設計図が含まれており，特定のアミノ酸配列を有する蛋白を合成して，その蛋白を介してさまざまな機能を発揮している．蛋白合成の工程（図 2）は，先ず遺伝子すなわち DNA からメッセンジャー RNA（mRNA）の前駆体

が転写され，蛋白合成に係らない領域（intron）が切り出され（スプライシング），蛋白合成に必要な領域

（exon）だけからなる mRNA となる．更に mRNA がトランスファー RNA（tRNA）に転写された後に，

tRNA の 3 つの塩基記号の組み合わせ（表 2）によりアミノ酸の配列を決定してゆく．アミノ酸配列の伸張は，3 塩基組み合わせの中にある停止記号（Stop Codon：UAA，UAG，UGA の 3 種類の組み合わせがある）により終了し，蛋白が完成する．この exon の 3 塩基組み合わせに変化を生じるような塩基の変化があると正常な蛋白合成が出来なくなり，病気の原因となる場合がある．

遺伝子変異の種類

遺伝子の変異には，遺伝子を構成する塩基対の中のただ 1 つの塩基対が入れ替わる小さな変異から，

遺伝子全体が抜け落ちてしまう大きな変異まである．遺伝子のアミノ酸合成を指令する領域（exon 内のコーディング領域）の一つの塩基が入れ替わった場合において，蛋白合成に与える影響から，変異を 3 種類に分けて分類している．1 つ目は，アミノ酸の配列に変化を生じないサイレント変異である．

例えば GCA が GCG に変化してもどちらもアラニンをコードしているので，アミノ酸は変化しない．

アミノ酸配列に変化がないので，通常は病気の原因となることはないが，この塩基の入れ替わりが，

intron と exon の接合部分に極近い場合，スプライシングに異常が起こることがある．スプライシングに異常があると，mRNA の配列が異なり，結果として異なるアミノ酸配列の蛋白が合成され，病気の原因となることがある．2 つ目はアミノ酸が入れ替わるミスセンス変異である．例えば GCA が GAA に変化した場合は，アラニンからグルタミン酸にアミノ酸が入れ替わる．1 つのアミノ酸の入れ替わりにより蛋白の機能が大きく失われることは少ないが，その蛋白が他の蛋白と反応をするためのレセプター部分などの立体構造を変化させるような変化の場合は，1 つのアミノ酸の入れ替わりでもその蛋白の機能が減弱したり，逆に機能を亢進することがある．3 つ目は蛋白の合成が途中で中段してしまうナンセンス変異である．例えば GAA が UAA に変化した場合は，グルタミン酸から Stop Codon に指令が変化して，アミノ酸の伸張はここで止まってしま

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表1 BRCA1およびBRCA2遺伝子の病的変異保有率（Ashkenazi Jewish家系を除く） 2010年2月更新家族歴（本人を除く第2度近親以内に1人以上の乳がんまたは卵巣がんの既往者がいる）

本人の既往歴

初発時50歳未満の乳

がん既往者がなく，卵巣がん既往者がない

†

初発時50歳未満の乳がん既往者が1人いる

が，卵巣がん既往者はいない

初発時50歳未満の乳がん既往者が2人以上

いるが，卵巣がん既往者はいない初発年齢を問わず，卵巣がん既往者が

1人いるが，50歳未満の乳がん既往者はいない

卵巣がん既往者が2人以上いるが，初発時 50歳未満の乳がん既往者は1人もいない

初発時50歳未満の乳

がん既往者および，初発年齢を問わず卵巣がん既往者がいる

†† 年齢を問わず，乳がんおよび卵巣がんにかかったことがない1.5％2.6％5.6％3.0％5.3％7.2％初発時50歳以上の乳がんにかかったことがある2.2％3.8％8.0％4.9％9.5％10.6％初発時50歳未満の乳がんにかかったことがある4.7％10.4％21.2％10.3％21.9％26.6％男性乳がんである 6.9％17.4％36.6％15.9％＊33.3％28.3％初発年齢を問わず，卵巣がんにかかったことがある7.7％14.3％27.4％14.7％22.7％34.4％初発時50歳以上の乳がんおよび初発年齢を問わず卵巣がんにかかったことがある12.1％23.6％50.0％23.6％44.2％39.4％初発時50歳未満の乳がんおよび初発年齢を問わず卵巣がんの両方にかかったことがある

26.3％40.0％64.5％41.2％45.5％ 57.4％ † 初発時50歳以上の乳がんにかかったことのある血縁者が含まれています（女性または男性で）． †† （乳がんおよび卵巣がんの）両方を診断されている血縁者を含みます．発症の分類にはDCISのデータも含まれます．

調査対象数表1： 162,914 ＊N＜20 この表は，米国Myriad Genetic Laboratories Inc.で実施された検査（研究検査を含む）で集計されたデータを編集し，日本語訳したものです．

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い，短い蛋白しか合成できなくなる．この場合は，

蛋白の構造が大きく変わるので，機能を失うことになる．ただ，この変異が，蛋白合成の終盤近く（N 端のすぐ近く）で起こった場合に，蛋白がほんの少し短くなるだけで，機能に影響がないこともあるので，病的変異の判断に注意を要する．

次に塩基が部分的に欠失，本来はなかった塩基が挿入される変異がある．欠失，挿入の効果から変異を大きく 2 つに分けると，フレームシフト変異とインフレーム変異になる．3 つの塩基の組み合わせでアミノ酸を規定しているので，3 の倍数以外の数で

塩基が欠失したり挿入されたりすると，たとえ 1 塩基の欠失あるいは挿入であっても，変化した部位以降のアミノ酸の配列指令が全て異なってくる．この場合，変異の塩基から数十塩基後の間までに Stop Codon の塩基組み合わせが発生して蛋白合成が中断され，機能喪失となる．尚，フレームシフト変異の場合も，ナンセンス変異と同様に N 端近くで起こった場合は機能に影響しない場合がある．一方，

3 の倍数の数で塩基の欠失や挿入があるインフレーム変異では，塩基の数の変化に応じたアミノ酸の数の変化が発生する．アミノ酸の数の変化が少ない場

図 1 遺伝子検査を検討する家系の例

図 2 DNA からタンパク質がつくられる仕組み

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合は，蛋白の機能が保たれることもある．

intron の塩基配列に変化が生じても，通常，蛋白合成への影響はほとんどないと考えられるが，サイレント変異の場合と同様に intron と exon の接合部分に極近い塩基の配列に変化があると，スプライシングに異常をきたすことがあるので注意を要する．

遺伝子の検査法

遺伝性乳がん・卵巣がん症候群の原因遺伝子として同定された BRCA1，BRCA2 遺伝子は，ゲノムの安定性維持に関与するがん抑制遺伝子なので，その機能を失うような変異があるとがん発症のリスクが高まる．機能喪失となる遺伝子変異の検出には，

遺伝子全体の検査をすることが必要になる．

BRCA1 は 1,863 個のアミノ酸，BRCA2 は 3,418 個のアミノ酸をコードする遺伝子で，遺伝子検査ではアミノ酸のコーディング領域全てと，コーディング領域に隣接する intron の領域も解析の対象となり，約 18,000 塩基対の配列の解析を行うことになる．臨床検査としての解析の方法は大きく分けて 2 つの方法が用いられている．

先ずは，遺伝子の塩基配列を 1 つ 1 つ解析するダ

イレクトシークエンシング法が基本となる．臨床検査として BRCA1/2 遺伝子の解析を行う場合は，遺伝子を約 180 の領域に分けて PCR 反応を行い，各 PCR 産物のシークエンシングが行われている．

遺伝子変異には数塩基が欠失するような比較的小さな変異から，遺伝子全体が抜け落ちたり，複数の exon にまたがり塩基が欠失する大きな変異がある．

このような大きな変異の場合は，PCR 反応を含む解析法では目的とする変異遺伝子を増幅が出来ず，

正常な塩基配列に対して反応した PCR 産物に対してシークエンシング解析がなされ，「変異なし」の判定結果が報告されることになる．そのため，大きな変異を検出するためには，ダイレクトシークエンシング以外に，サザンプロット法，FISH 法，ロング PCR 法，判定量 PCR 法などの組み合わせが必要となる．最近，このような大きな変異を効率よく検出する方法として MLPA（Multiplex Ligation-dependent Probe Ampliﬁcation）法が開発された^11）．MLPA 法では，目的とする遺伝子に対応するプローブを，同時に複数（40 プローブ）試料に反応させ，結合できたプローブのみを定量的に増幅することで，1 細胞に 2 アレル存在する遺伝子の片方の大きな領域が欠

表 2 A 3 つの塩基の組合せによるアミノ酸の選択 B アミノ酸の記号と名称

第 1 第 2

第 3 Ala：A, アラニン Arg：R, アルギニン Asn：N, アスパラギン Asp：D, アスパラギン酸 Cys：C, システイン Gln：Q, グルタミン Glu：E, グルタミン酸 Gly：G, グリシン His：H, ヒスチジン I l e ：I, イソロイシン Leu：L, ロイシン Lys：K, リジン Met：M, メチオニン Phe：F, フェニルアラニン Pro：P, プロリン

Ser：S, セリン Thr：T, スレオニン Tyr：Y, チロシン Try：W, トリプトファン Val：V, バリン

Stop Codon：X

U C A G

U

Phe Ser Try Cys U Phe Ser Try Cys C Leu Ser Stop Stop A Leu Ser Stop Try G

C

Leu Pro His Arg U Leu Pro His Arg C Leu Pro Gln Arg A Leu Pro Gln Arg G

A

Ile Thr Asn Ser U Ile Thr Asn Ser C Ile Thr Lys Arg A Met Thr Lys Arg G

G

Val Ala Asp Gly U Val Ala Asp Gly C Val Ala Glu Gly A Val Ala Glu Gly G

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失していることを検出できる（図 3）．

遺伝子変異の表示法

ダイレクトシークエンシング法の臨床検査としての結果報告では，基本のデータベースの配列と同じ塩基配列や既に多型と確定している塩基配列の場合は「変異を認めず」と表記し，変異が認められた場合には，塩基のアミノ酸の配列記号または塩基の配列記号で表示される（表 3）．サイレント変異，ミ

スセンス変異，ナンセンス変異の場合はアミノ酸表記で，「T1720T」，「K2729N」，「L63X」などと，両端に正常なアミノ酸と変異後のアミノ酸を記し間にそのアミノ酸の位置を記載している．塩基の欠失や挿入の変異は，「2632delA」，「3389delAG」，

「184insTT」，「5126ins13」，「1240delCACinsT」などと，変異が生じた塩基の頭の番号の後に欠失

（del）あるいは挿入（ins）と変化した塩基記号又は塩基の数を記載する．また intron の変異では，

図 3 MLPA 法の原理 A：プローブの設計

B：ハイブリダイゼーションとライゲースによる 1 本化 C：PCR による同時増幅

D：PCR 産物のフラグメント解析

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「IVS20−1G ＞ A」，「IVS26＋10T ＞ G」などと，変異のあった intron の番号と，接合する exon との接合部分からの塩基の数（上流よりは−，下流よりは

＋）と変化する前後の塩基の記号を記載する．

MLPA 法の検査結果報告では，「exon14-20del」

などと欠失している領域の exon の番号を記載する．

変異の臨床診断のための解釈

遺伝子の変異が蛋白の機能喪失をきたしているかは，遺伝子解析に精通していない人には困難な場合が多いので，臨床検査としての遺伝子検査の結果報告には，変異の内容（塩基の変化）に加えて臨床的な意義の解釈を添えることが求められている（図 4）．結果の解釈は大きく分けて 3 種類あり，「変異を認めず」，「Deleterious（病的変異）」，「Uncertain

（病的かどうか未確定）」となる．遺伝子の変異が合成される蛋白の機能を消失させるかどうか確定できていない新しい変異が検出された場合の解釈が

「Uncertain（病的かどうか未確定）」である．これらの分類は，蛋白の機能解析や，変異が検出された患者家系員の中で，発症者と変異保有者の関係を解析する Segregation Analysis などの情報を蓄積することによって判定がなされている．

遺伝子変異により蛋白の合成が中断するナンセンス変異やフレームシフトはそのほとんどが，

「Deleterious（病的変異）」と分類される．ミスセンス変異の多くは「Uncertain（病的かどうか未確定）」に分類される．BRCA1/2 遺伝子の変異を公開する米国 NIH の情報サイト BIC（Breast Cancer Information Core）に登録された変異種類ごとの件数と分類を表 4 に示す．分類欄に記載した変異例は，分類に注意を要する特殊な例である．尚，BIC への変異登録は，登録参加者の自主的な報告によるものなので，件数は必ずしも検出頻度を示す数値とはならなく，参考に留めるものである．特に多型が確定したようなサイレント変異は登録されることは少なく，小さい数値となっている．

未確定の追跡調査

「Uncertain（病的かどうか未確定）」の結果が出た場合，一旦，検査結果報告を行った後に，その家系員における Segregation Analysis を行い，その変異が病気に関係するのか，関係しないのかの追跡調査が行われることがある．追跡調査の結果と遺伝子変異の機能解析などの結果と合わせ，後日，解釈の検討が行われる．

解釈の検討の段階で，病的変異と確定できないまでも，ほぼ病気に関連すると判断された場合には，

「Suspected Deleterious（病的変異疑い）」と判定されることがある．また，多型と断定できないが，ほ

表 3 結果報告書に記載する変異の表記

変異の型変異の表記例表記要領

サイレント変異 C197C，S694S 前に正常なアミノ酸，後に変異後のアミノ酸の記号を記載し，その間にアミノ酸の位ミスセンス変異 K2729N，R1495M 置を表記

ナンセンス変異 L63X， Q563X フレームシフト変異 2632delA，3389delAG

184insTT，5126ins13 1240delCACinsT

変異が生じた最前の塩基番号の後に欠失

（del）あるいは挿入（ins）と変化した塩基記号又は塩基の数を表記

インフレーム変異 S616del（1965del3），

9203del126（in-frame deletion）

欠失または挿入したアミノ酸と位置を記し，

カッコで塩基番号と変化した塩基数を表記あるいは，塩基番号と塩基数にインフレームであることを付記

イントロンの変異 IVS20−1G ＞ A

IVS26＋10T ＞ G IVS の後に変異のあった intron 番号，より近い exon の上流にある場合は［−］，下流にある場合は［＋］を付けて塩基の接合部からの位置を記し，変化する前後の塩基の記号の順で表記

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図 4 検査結果報告の例

表 4 BIC に登録された BRCA1/2 遺伝子変異の数と臨床意義の分類

変異の型登録数

（2013. 4 現在）

変異の臨床意義と分類

病的変異未確定変異多型

サイレント変異 1,637 R（intron 接合部） Minor Major ミスセンス変異 11,641 R（立体構造変化，

intron 接合部）

Major Minor

ナンセンス変異 2,396 Major R（C 端に近い

部位の変異）

Minor（BRCA2, K3326X）

R（BRCA2, K3408X）

フレームシフト 9,467 Major R（C 端に近い

部位の変異）

R（BRCA2 10323delCins11）

インフレーム変異 139 R（非常に大きな欠失，

Stop Codonの挿入）

Major NR

イントロンの変異 3,789 Minor

（exon 接合部）

Major Minor

（exon 接合部から遠い）

Major：各変異型における主な臨床意義の分類． Minor：比較的少ない臨床意義の分類．

R：稀な臨床意義の分類． NR：BIC では未登録．

http://research.nhgri.nih.gov/projects/bic/application.cgi

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ぼ病気に関連しないと判断された場合には，「Favor Polymorphism（遺伝子多型と思われる）」と判定されることもある．暫定的な判定も含めると検査結果の解釈には 5 種類あることになるが，臨床の場での被検者への説明では，「Suspected Deleterious（病的変異疑い）」は「Deleterious（病的変異）」と同等に扱われ，「Favor Polymorphism（遺伝子多型と思われる）」は，多型（変異なし）として問題ない．

追跡調査の結果，判定基準を変更された時に，検査センターによっては Amended report を発行し，

解釈の変更を報告するところもあるので，HBOC の診療では検査結果の報告のためにも被検者と連絡手段を継続しておくことが求められる．

おわりに

遺伝子検査は新たな技法として，様々な疾患の診断に役立ってきているが，新しい技術であるだけに，技術的な限界がある中で利用されており，更なる研究による技術の改良がなされている．臨床現場においても常に遺伝子研究の成果を監視しながら，

患者への還元を心掛けることが必要と考える．

文献

1） Miki Y, Swensen J, Shattuck-Eidens D, . A strong candidate for the breast and ovarian cancer susceptibility gene BRCA1. . 1994;266:66‑71.

2） Wooster R, Bignell G, Lancaster J, . Identi- ﬁcation of the breast cancer susceptibility gene BRCA2. . 1995;378:789‑792.

3） Ford D, Easton DF, Stratton M, . Genetic heterogeneity and penetrance analysis of the BRCA1 and BRCA2 genes in breast cancer

families. The Breast Cancer Linkage Consor- tium. . 1998;62:676‑689.

4） Frank TS, Deffenbaugh AM, Reid JE, . Clinical characteristics of individuals with germline mutations in BRCA1 and BRCA2 : analysis of 10,000 individuals. . 2002;20:1480‑1490.

5） Risch HA, McLaughlin JR, Cole DE, . Prev- alence and penetrance of germline BRCA1 and BRCA2 mutations in a population series of 649 women with ovarian cancer. . 2001;68:700‑710.

6） Katagiri T, Kasumi F, Yosimoto M, . High proportion of missense mutations of the BRCA1 and BRCA2 genes in Japanese breast cancer families. . 1998;43:42‑48.

7） Sekine M, Nagata H, Tsuji S, . Mutational analysis of BRCA1 and BRCA2 and clinico- pathologic analysis of ovarian cancer in 82 ovarian cancer families: two common founder mutations of BRCA1 in Japanese population.

. 2001;7:3144‑3150.

8） Ikeda N, Miyoshi Y, Yoneda K, . Frequency of BRCA1 and BRCA2 germline mutations in Japanese breast cancer families. . 2001;91:83‑88.

9） Sugano K, Nakamura S, Ando J, . Cross- sectional analysis of germline BRCA1 and BRCA2 mutations in Japanese patients suspected to have hereditary breast/ovarian cancer. . 2008;99:1967‑1976.

10） Knudson AG Jr. Mutaition and cancer: statisti- cal study of retinoblastoma.

. 1971;68:820‑823.

11） Schouten JP, McElgunn CJ, Waaijer R, . Relative quantification of 40 nucleic acid se- quences by multiplex ligation-dependent probe ampliﬁcation. . 2002;30:e57.