Non-protein-coding RNAs (ncRNAs)

1

インターフェロン-αを制御する

分子医薬の開発

立命館大学 薬学部 薬学科

教授 木村 富紀

立命館大学 新技術説明会 7

RITSUMEIKAN

2

従来技術

• 核酸を用いた遺伝子発現の制御方法:

リボザイム法、RNA干渉法、アンチセンスDNA

オリゴヌクレオチド法、デコイ核酸法並びにRNA

アプタマー法がある。

• これらの方法は、発現の抑制（低下）のみを可

能にする。

RITSUMEIKAN

3

新技術の特徴

• 内在性のアンチセンスRNAを用いるわれわれ

の制御方法は、SODNによりIFNA1遺伝子の

発現を抑制できるだけでなく、ASORNの使用

によりその発現の増強を可能にする。

• すなわち、これまで不可能であった双方向性

の遺伝子の発現制御が可能となる点で独創

的であり、従来法にない新規性並びに優位性

を有する。

RITSUMEIKAN

4 Transcripts Rest Protein-coding genes Rest

ヒトゲノム(ca 3 Gb)

3% (20,687 遺伝子)

Human genome

sequencing

consortium, ‘03

ヒトトランスクリプトーム

90%<

ENCODE project

Consortium (2012)

(制御性, 非コードRNA)

ゲノムからの転写産物の大部分はタンパク質を

コードしない非コードRNAである

Protein-coding genes

Rest

Transcripts

Rest

RITSUMEIKAN

内因性の遺伝子転写産物はタンパク質

非コード性である

RITSUMEIKAN 5

Gene

Messenger RNA (mRNA)

AAAAA

Natural antisense transcript (NAT) = AS（アンチセンス） RNA:

ヒトを含む多数の哺乳類遺伝子から転写される

Protein

Exon 1

Exon 7

ヒト細胞におけるアンチセンス鎖の転写頻度

Classification of genes by the asymmetric strand-specific analysis of gene expression in PBMC

All genes S genes 81.60 % AS genes 2.50 % SAS genes 15.9 % Coding genes S genes 81.30 % AS genes 2.50 % SAS genes 16.1% Noncoding genes S genes 95.50 % AS genes 1.80 % SAS genes 2.7 % RITSUMEIKAN 6 Yiping et al., Science, 322: 1855, 2008

殆どのアンチセンス転写産物の機能は解明されていない

RITSUMEIKAN 7

CSS

An 3’

IFN-

α



mRNA

SL1 SL2 229 305 308 434 SL1 SL2

BSL

322 352 487 487 452 208 68 AUG BSL 1 637 876 AREs UAA 5’

Nuclear export of IFN-

α1 mRNA

IFN-

α



mRNA

IFN-

α



mRNA

ΔSL1

IFN-

α



mRNA

ΔSL2

IFN-

α



mRNA

ΔBSL

Kimura et al., J.Cell Sci., 2004 Kimura et al., Med.Mol.Morp.,2010 Matsui, Kimura et al., Hepatology, 2008

ヒトInterferon-α1 antisense RNA (IFN-α1 AS)の同定

839 PCR3: 652

3’

UTR

5’ UTR

IFNA1

_ARE motifs 68 1 637 876

*

Polyadenylation site PCR1: 32 210 301 PCR2: 131 188 PCR4: 40 326 PCR5: 164 IFN-α1 AS RT-minus 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 PCR: RT primer: 2-25 102-124

CDS

IFN-

α

1 AS

+188

SeV-infected

Namalwa cells

Total cellular RNA

Strand-specific

RT-PCR

Nc1

S1

S3

S4

Nc2

RITSUMEIKAN 9 AAA

IFN-

α1 AS

IFN-

α1 mRNA

Sense ODN

RNase HによるIFN-α1 AS発現の抑制

RT-minus IFN-α1 AS

S1

Nc1 Nc2

18S rRNA Time after transfection

S2

S3

S4

hr

S2

RITSUMEIKAN 10

S4, sense oligonucleotide (ODN); Scr4, a scrambled control of S4;

siE26 and siE27, siRNA; and siScr, a scramble control of siE27.

センスオリゴとsiRNAは同程度にiNOS mRNAの発現を抑制する

(Nishizawa et al., IBA news letter, 2009)

iNO

S m

RNA

(%

)

Sense ODN

siRNA

0

50

100

150

(–)

S4

Scr4 siE26 siE27 siScr

seODNとsiRNAとの発現抑制効果の比較

T

1/2

_of

_IFN-

α1 mRNA (<80% )

IFN-

α1 mRNA 発現レベルの低下

IFN-α1 AS発現抑制が同mRNA発現に及ぼす効果

RITSUMEIKAN 11

IF

N

-α



m

R

NA

(f

o

ld

)

1

2

3

4

5

0

1.25

0

1.00

0.75

0.50

0.25

Actinomycin D treatment (hr)

KD(-)/mRNA

KD(+)/mRNA

5.1hr

0.9hr

12 13 14 15 16 17

Time after SeV infection (hr)

KD(-)/18S

KD(+)/18S

IFN-

α

1

AS

IFN-

α

1

mRNA

18S

rRNA

RT-minus

0 12

Time after

infection

_hr

AHCC (+)

0 12 24

AHCC (-)

24

Time after SeV infection (hr)

IFN

-α

c

onc

ent

rat

ions

(pg/

m

l)

AHCC は IFN-α1 AS 発現を抑制し同mRNA/タンパク質の発

現低下をもたらす

RITSUMEIKAN 12

Matsui et al., JPEN.,2007

IFN-

α1 AS の過剰発現が同mRNA の発現に及ぼす効果

RITSUMEIKAN 13

T

1/2

_of

_IFN-

α1 mRNA (290% )

IFN-α1 mRNA 発現レベルの増大

IFN-

α1 AS

0 1 3 6 12 24 0 1 3 6 12 24

Control

AS over-expression

Time after inf.

1

2

3

4

5

0

IF

N

-α



m

R

NA

(f

ol

d)

Actinomycin D treatment (hr)

Control/ mRNA

Over-expression(+)/ mRNA

8.1 hr

2.8 hr

CMV pro ATG 876 IF NA1

Over-expression(+)/ 18S

Control/ 18S

1.4

0

1.2

0.6

0.4

0.2

1.0

0.8

1

2

3

4

0

RITSUMEIKAN 14

Overexpression of truncated IFN-

α1 AS mutants

Cont

Relative IFN-

〈

1 mRNA

expression (fold)

AREs AUG UAA BSL CSS SL2 5’ 3’

1

2

3

4

0

Relative IFN-

α

1 mRNA

expression (fold)

DS DS Cont IFN-α1 AS 5’UTRR

IFN-α1 AS BSLR ドメインが IFN-α1 mRNA の安定性制御

のための中心領域である

RITSUMEIKAN 15

IFN-

〈

1

mRNA

asORN (corresponding to BSLR)

AAA

Time after SeV infectin (hr)

IFN-α1 AS IFN-α1 mRNA

208 229 322 352

asORN

ncORN

IFN

-α



m

RNA

(

fol

d)

0 40 10 30 20 5 10 15 20 25 0 asORN ncORN mock

2.3 fold

increase

0 5 15 10 5 10 15 20 25 0

IFN

-α1

A

S

(

fol

d)

25塩基長のBSLR塩基配列からなるアンチセンスリボオリゴヌクレオチド

(asORN)は全長のAS RNA と同程度にIFN-α1 mRNAの発現量を増加する

Rel

ati

v

e

IFN

-α

1

AS

ex

pr

es

s

ion (

fol

d)

2.5

2

1.5

1

0.5

0

RITSUMEIKAN 16

Rel

ati

v

e

IFN

-α

1

m

RNA

ex

pr

es

s

ion (

fol

d)

2.5

2

1.5

1

0.5

0

total

nucl

cytoplasmic

IFN-

α

1 AS

IFN-

α

1 mRNA

17

想定される用途

 現行INF製剤では適応がなく、又抗ウイルス薬が

存在しない呼吸器ウィルス感染症の治療：

1．コロナウイルス、パラインフルエンザウイルスやRSV

による乳幼児冬期感冒

2．ライノウイルスやコロナウイルス等による風邪症候群等

3．抗ノイラミニダーゼ阻害薬抵抗性のインフルエンザウイ

ルスによるインフルエンザ

 IFN-aの過剰産生に起因する自己免疫疾患（SLE、

皮膚筋炎等）

【アンチセンスリボオリゴヌクレオチド】

【センスリボオリゴヌクレオチド】

RITSUMEIKAN

RITSUMEIKAN 18

モルモット

マウス

•Balb/c やC57BL/6等のマウスはIFN-a刺

激応答遺伝子の主体となるMx遺伝子が変

異している

インフルエンザウイルスに感染すると死ぬ

•機能性のMx 遺伝子を持つので、IFN-a応

答を遺伝子レベルで検討できる

•インフルエンザに罹患しても死亡せず、感

染を水平伝播するため、実験結果をヒトに

外挿可能

POC実験：ASORN効果の生体内における検証

RITSUMEIKAN 19

ヒトインフルエンザA型ウイルス*感染モルモット気道における

IFN-

α

1候補遺伝子mRNA/ASの発現

*Influenza A virus:PR/8/32 (E) H1N1

Re

la

tiv

e

RNA

ex

pr

es

s

ion (

fol

d)

mRNA

AS

Days after virus inoculation

候補遺伝子１

候補遺伝子２

候補遺伝子３

候補遺伝子1/2においてウイルス接種後にmRNA/ASの

発現誘導とその消退が観察された

20

実用化に向けた課題

• POC実験：ASORN効果の生体内における検証

• インフルエンザウイルス感染動物モデルの構築

1.モルモット IFNA1遺伝子が決定済み (AB671739)

2.モルモットIFN-α1 AS RNAの発現確認（気道組織）

3.モルモットIFN-α1 ASORNの効果判定<<検討中>>

• DDSの開発

RITSUMEIKAN

(BiBiServ RNAhybrid)

IFN-α1 AS はBSL領域においてmiR-1270の結合と拮抗

することによりIFN-α1 mRNAを安定化する

22

企業への期待

• モルモット感染実験系を用いてIFN-α1 AS

のmRNA発現制御効果を生体中で検証す

る研究に対し、共同実験を行える企業の

参加を希望します。

RITSUMEIKAN

23

本技術に関する知的財産権

• 発明の名称 ：インターフェロン-〈 モジュレーター

• 出願番号

：特願2011-536201

• 出願人

：学校法人立命館、

学校法人関西医科大学、

株式会社アミノアップ化学

• 発明者

：木村 富紀、西澤 幹雄、蒋 時文、

西川 正雄

発表論文： Kimura et al., CMLS in press (DOI 10.1007_s00018-012-1216-x)

24

お問い合わせ先

立命館大学

研究部 リサーチオフィス(BKC)

産学官連携コーディネーター 松田 文雄

ＴＥＬ ： 077-561-2802

ＦＡＸ ： 077-561-2811

e-mail ： bma22013＠se.ritsumei.ac.jp

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