平成３０年度外部精度管理事業
課題１ 麻疹・風疹
実施手順書
（ウイルスの核酸検出検査）
1) 検体を受け取りましたら、外部精度管理事業ホームページ （https://www.niid.go.jp/niid/ja/reference/eqa.html）にてお手続きください。 2) 検体到着後、各チューブのスピンダウンを行ってから 500 マイクロリットルの Nuclease-free water を加え、 室温で 2 分間静置してください。その後 15 秒間のボルテックス、続いて 10 回の転倒混和（チューブ内 の溶液が完全に上下移動するように、確実にシェイクする）を行い、サンプルが完全に溶解したことを 確認してください。（検体は溶解の有無にかかわらず、到着後は-70℃以下にて保管してください） 3) 各参加施設の検査方法に従って、検体からの RNA 抽出を行い、麻疹および風疹ウイルスの核酸検出 検査を行ってください。検体は「発熱・発疹を呈し、麻疹・風疹が疑われる患者の検体」という前提で検 査を行ってください。 4) 使用後の検体は臨床検体に準じて廃棄してください。 5) 検査終了後、本手順書 2 ページ以降の内容（共通項目、各検体項目、アンケート調査項目）を外部精 度管理事業ホームページの結果入力専用ウェブサイトに入力してください。Ct(Cp)値は小数第一位ま で算出してください。Conventional RT-PCR 法を用いて検査を行った場合は泳動図ファイルを作成し てください。 （入力の途中で保存可、のちに再開可能です） 6) 平成 30 年 8 月 31 日金曜日までに入力を終了してください。 （備考） 結果報告の締切に間に合わないと見込まれる場合は、事前に事務局に連絡をお願いします。事前に連絡 が無く、締切を過ぎた場合は評価を行いません。 ご不明な点やトラブルなどがありましたら、下記にお問い合わせください。 国立感染症研究所 外部精度管理事業事務局 TEL 03-5285-1111（内線 2301） FAX 03-5285-1175 E-mail [email protected]共通の結果入力項目 括弧内の入力規則に従って結果入力専用ウェブサイトにて入力してください。 基本項目 ■入力者（自由記載） ■検査実施開始日・終了日（カレンダーから選択、もしくは自由記載） 麻疹 判定方法 ■realtime RT-PCR 方法（以下の 3 項目より選択） 病原体検出マニュアル 病原体検出マニュアル改変（変更点を特記事項に記載） その他（方法を特記事項に記載） 特記事項（自由記載） 陽性コントロールのコピー数（数値を記載、半角入力）： 陽性コントロールの Ct（Cp）値（数値を記載、小数第一位、半角入力）： ■conventional RT-PCR 方法（以下の 4 項目より選択） 病原体検出マニュアル（N 遺伝子検出法） 病原体検出マニュアル（H 遺伝子検出法） 病原体検出マニュアル改変（変更点を特記事項に記載） その他（方法を特記事項に記載） 特記事項（自由記載） 泳動図（次頁の要領に従って作成した泳動図の Powerpoint ファイルをウェブサイトからアップロードしてください。） ■その他の判定方法（自由記載） 風疹 判定方法 ■realtime RT-PCR 方法（以下の 3 項目より選択） 病原体検出マニュアル 病原体検出マニュアル改変（変更点を特記事項に記載） その他（方法を特記事項に記載） 特記事項（自由記載） 陽性コントロールのコピー数（数値を記載、半角入力）： 陽性コントロールの Ct（Cp）値（数値を記載、小数第一位、半角入力）： ■conventional RT-PCR 方法（以下の 4 項目より選択） 病原体検出マニュアル（2-step 法） 病原体検出マニュアル（1-step 法） 病原体検出マニュアル改変（変更点を特記事項に記載） その他（方法を特記事項に記載） 特記事項（自由記載） 泳動図（次頁の要領に従って作成した泳動図の Powerpoint ファイルをウェブサイトからアップロードしてください。） ■その他の判定方法（自由記載） その他の特記事項（自由記載）
泳動図 Powerpoint ファイル作成要領 1. 外部精度管理事業ホームページ（https://www.niid.go.jp/niid/ja/reference/eqa.html）から泳動図例 Powerpoint ファイル（H30_eqa_MR_EP_image.ppt）をダウンロードしてください。 2. ファイル名を「施設名―（麻疹もしくは風疹）.ppt」（拡張子は pptx でも可）に変更して下さい。 （例：「国立感染症研究所—麻疹.ppt」） 3．使用プライマー1 セットにつき、1 枚のスライドを作成してください。複数のプライマーセットで行った場合 は、複数枚のスライドページを 1 つのファイルにまとめて下さい。麻疹・風疹の泳動結果は、それぞれ独立し たファイルとして作成・保存して下さい。 4．下の記載例に従って、最終判定に用いた電気泳動写真画像を貼り付け、説明を追加してください。 5．作成したファイルを保存し、結果入力専用ウェブサイトにて、ファイルをアップロードして下さい。 施設名 麻疹もしくは風疹 使用プライマー レーン番号 マーカーサイズ アガロース濃度 レーンの説明 その他報告事項があれば、 こちらに記載して下さい。
各検体の結果入力項目 ６検体（順不同）それぞれの判定結果と Ct(Cp)値を記載してください。 1．検体番号（半角数字 5 桁）： 麻疹 判定結果（右の 3 項目より選択） 陰性・陽性・判定保留 麻疹 realtime RT-PCR Ct（Cp）値（数値を記載、小数第一位、半角入力）： 風疹 判定結果（右の 3 項目より選択） 陰性・陽性・判定保留 風疹 realtime RT-PCR Ct（Cp）値（数値を記載、小数第一位、半角入力）： 2．検体番号（半角数字 5 桁）： 麻疹 判定結果（右の 3 項目より選択） 陰性・陽性・判定保留 麻疹 realtime RT-PCR Ct（Cp）値（数値を記載、小数第一位、半角入力）： 風疹 判定結果（右の 3 項目より選択） 陰性・陽性・判定保留 風疹 realtime RT-PCR Ct（Cp）値（数値を記載、小数第一位、半角入力）： 3．検体番号（半角数字 5 桁）： 麻疹 判定結果（右の 3 項目より選択） 陰性・陽性・判定保留 麻疹 realtime RT-PCR Ct（Cp）値（数値を記載、小数第一位、半角入力）： 風疹 判定結果（右の 3 項目より選択） 陰性・陽性・判定保留 風疹 realtime RT-PCR Ct（Cp）値（数値を記載、小数第一位、半角入力）： 4．検体番号（半角数字 5 桁）： 麻疹 判定結果（右の 3 項目より選択） 陰性・陽性・判定保留 麻疹 realtime RT-PCR Ct（Cp）値（数値を記載、小数第一位、半角入力）： 風疹 判定結果（右の 3 項目より選択） 陰性・陽性・判定保留 風疹 realtime RT-PCR Ct（Cp）値（数値を記載、小数第一位、半角入力）： 5．検体番号（半角数字 5 桁）： 麻疹 判定結果（右の 3 項目より選択） 陰性・陽性・判定保留 麻疹 realtime RT-PCR Ct（Cp）値（数値を記載、小数第一位、半角入力）： 風疹 判定結果（右の 3 項目より選択） 陰性・陽性・判定保留 風疹 realtime RT-PCR Ct（Cp）値（数値を記載、小数第一位、半角入力）： 6．検体番号（半角数字 5 桁）： 麻疹 判定結果（右の 3 項目より選択） 陰性・陽性・判定保留 麻疹 realtime RT-PCR Ct（Cp）値（数値を記載、小数第一位、半角入力）： 風疹 判定結果（右の 3 項目より選択） 陰性・陽性・判定保留 風疹 realtime RT-PCR Ct（Cp）値（数値を記載、小数第一位、半角入力）：
アンケート調査項目 以下の回答はトラブルシューティングに活用されます。
麻疹・風疹共通
■ RNA 抽出
試薬（以下の 3 項目より選択）
QIAGEN QIAmp Viral RNA Mini Kit Roche High Pure Viral RNA Kit その他（特記事項に記載）
特記事項（自由記載）
麻疹
■ realtime RT-PCR (1-step 法) 試薬（以下の 4 項目より選択）
TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix QuantiTect Probe RT-PCR Kit One Step Prime Script RT PCR Kit その他（特記事項に記載）
特記事項（自由記載）
■ realtime RT-PCR (2-step 法)
Ø RT 試薬（以下の 6 項目より選択） PrimeScript Reverse Transcriptase SuperScript III Reverse Transcriptase SuperScript IV Reverse Transcriptase ReverTra Ace qPCR RT
ReverTra Ace -α- その他（特記事項に記載）
特記事項（自由記載）
Ø Realtime PCR 試薬（以下の 5 項目より選択） TaKaRa Probe qPCR Mix
TaqPath qPCR Master Mix
TaqMan Fast Advanced Master Mix
TOYOBO THUNDERBIRD Probe qPCR Mix その他（特記事項に記載） 特記事項（自由記載） ■ realtime RT-PCR 装置 装置（以下の 8 項目より選択） ABI 7500 Fast ABI 7500
ABI StepOne Plus
Roche LightCycler 480 System I Roche LightCycler 480 System II QuantStudio3 QuantStudio5 その他（特記事項に記載） 特記事項（自由記載） ■ conventional RT-PCR (1-step 法) Ø RT-PCR 試薬（以下の 6 項目より選択） QIAGEN OneStep RT-PCR Kit
PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2 PrimeScript II High Fidelity One Step
RT-PCR Kit
SuperScript III One-Step RT-PCR System with Platinum Taq DNA Polymerase SuperScript IV One-Step RT-PCR その他（特記事項に記載）
特記事項（自由記載）
Ø Nested -PCR 試薬（以下の 12 項目より選択） TaKaRa PerfectShot ExTaq
TaKaRa ExTaq TaKaRa LATaq
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase PrimeSTAR Max DNA Polymerase Tks Gflex DNA Polymerase Platinum Taq DNA polymerase
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity Platinum SuperFi DNA Polymerase
KOD -Plus- KOD -Plus- Ver.2 その他（特記事項に記載）
特記事項（自由記載）
■ conventional RT-PCR (2-step 法)
Ø RT 試薬（以下の 6 項目より選択） PrimeScript Reverse Transcriptase SuperScript III Reverse Transcriptase SuperScript IV Reverse Transcriptase ReverTra Ace qPCR RT
ReverTra Ace -α- その他（特記事項に記載）
Ø 1st PCR 試薬（以下の 12 項目より選択） TaKaRa PerfectShot ExTaq
TaKaRa ExTaq TaKaRa LATaq
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase PrimeSTAR Max DNA Polymerase Tks Gflex DNA Polymerase Platinum Taq DNA polymerase
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity Platinum SuperFi DNA Polymerase
KOD -Plus- KOD -Plus- Ver.2 その他（特記事項に記載）
特記事項（自由記載）
Ø Nested PCR 試薬（以下の 12 項目より選択） TaKaRa PerfectShot ExTaq
TaKaRa ExTaq TaKaRa LATaq
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase PrimeSTAR Max DNA Polymerase Tks Gflex DNA Polymerase Platinum Taq DNA polymerase
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity Platinum SuperFi DNA Polymerase
KOD -Plus- KOD -Plus- Ver.2 その他（特記事項に記載） 特記事項（自由記載 ■ スタンダード RNA を用いた realtime RT-PCR 測定 系最適化の実施（以下の 3 項目より選択） 実施している 実施していない 無回答 ■ 上で「実施している」と答えた場合、その頻度（以下 の 5 項目より選択） 1 年に 1 回程度 半年に 1 回程度 今回初めて実施 検査の都度 その他（特記事項に記載） 特記事項（自由記載） ■ Positive control の希釈（以下の 5 項目より選択） H2O Easy dilution
Carrier RNA 添加 H2O（濃度を特記事項 1 に記載） その他（特記事項 2 に記載） 無回答 特記事項 1（Carrier RNA 濃度記載） 特記事項 2（自由記載） 風疹 ■ realtime RT-PCR (1-step 法) 試薬（以下の 4 項目より選択）
TaqMan Fast Virus 1-Step Master Mix QuantiTect Probe RT-PCR Kit One Step Prime Script RT PCR Kit その他（特記事項に記載）
特記事項（自由記載）
■ realtime RT-PCR (2-step 法)
Ø RT 試薬（以下の 6 項目より選択） PrimeScript Reverse Transcriptase SuperScript III Reverse Transcriptase SuperScript IV Reverse Transcriptase ReverTra Ace qPCR RT
ReverTra Ace -α- その他（特記事項に記載）
特記事項（自由記載）
Ø realtime PCR 試薬（以下の 5 項目より選択） TaKaRa Probe qPCR Mix
TaqPath qPCR Master Mix
TaqMan Fast Advanced Master Mix
TOYOBO THUNDERBIRD Probe qPCR Mix
■ realtime RT-PCR 装置
装置（以下の 8 項目より選択） ABI 7500 Fast
ABI 7500
ABI StepOne Plus
Roche LightCycler 480 System I Roche LightCycler 480 System II QuantStudio3 QuantStudio5 その他（特記事項に記載） 特記事項（自由記載） ■ conventional RT-PCR (1-step 法) Ø RT-PCR 試薬（以下の 6 項目より選択） QIAGEN OneStep RT-PCR Kit
PrimeScript One Step RT-PCR Kit Ver.2 PrimeScript II High Fidelity One Step
RT-PCR Kit
SuperScript III One-Step RT-PCR System with Platinum Taq DNA Polymerase SuperScript IV One-Step RT-PCR その他（特記事項に記載）
Ø Nested PCR 試薬（以下の 12 項目より選択） TaKaRa PerfectShot ExTaq
TaKaRa ExTaq TaKaRa LATaq
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase PrimeSTAR Max DNA Polymerase Tks Gflex DNA Polymerase
Platinum Taq DNA polymerase
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity Platinum SuperFi DNA Polymerase
KOD -Plus- KOD -Plus- Ver.2 その他（特記事項に記載）
特記事項（自由記載）
■ conventional RT-PCR (2-step 法)
Ø RT 試薬（以下の 6 項目より選択） PrimeScript Reverse Transcriptase SuperScript III Reverse Transcriptase SuperScript IV Reverse Transcriptase ReverTra Ace qPCR RT
ReverTra Ace -α- その他（特記事項に記載）
特記事項（自由記載）
Ø 1st PCR 試薬（以下の 12 項目より選択） TaKaRa PerfectShot ExTaq
TaKaRa ExTaq TaKaRa LATaq
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase PrimeSTAR Max DNA Polymerase Tks Gflex DNA Polymerase Platinum Taq DNA polymerase
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity Platinum SuperFi DNA Polymerase
KOD -Plus- KOD -Plus- Ver.2 その他（特記事項に記載）
特記事項（自由記載）
Ø Nested PCR 試薬（以下の 12 項目より選択） TaKaRa PerfectShot ExTaq
TaKaRa ExTaq TaKaRa LATaq
PrimeSTAR GXL DNA Polymerase PrimeSTAR Max DNA Polymerase Tks Gflex DNA Polymerase Platinum Taq DNA polymerase
Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity Platinum SuperFi DNA Polymerase
KOD -Plus- KOD -Plus- Ver.2 その他（特記事項に記載） 特記事項（自由記載） ■ 参照 RNA を用いた realtime RT-PCR 測定系最適 化の実施（以下の 3 項目より選択） 実施している 実施していない 無回答 ■ 上で「実施している」と答えた場合、その頻度（以下 の 5 項目より選択） 1 年に 1 回程度 半年に 1 回程度 今回初めて実施 検査の都度 その他（特記事項に記載） 特記事項（自由記載） ■ Positive control の希釈（以下の 5 項目より選択） H2O Easy dilution
Carrier RNA 添加 H2O（Carrier RNA 濃度を特記 事項 1 に記載）
その他（特記事項 2 に記載） 無回答
特記事項 1（Carrier RNA 濃度記載） 特記事項 2（自由記載）
