リン酸基含有化合物分析に対する
新規高耐圧ステンレスフリーカラムの有用性について
○佐藤友紀1,3，山口忠行2，尾坂裕輔2，山本祝久1 (株式会社島津ジーエルシー1,株式会社島津製作所2, 独立行政法人国立循環器病研究センター薬剤部3) 学会発表資料＿抜粋 2はじめに
リン酸基含有化合物や⾦属キレート性のある化合物は，分析を⾏う際
にテーリング現象や吸着現象が起こる事が一般的に知られている。この
種の化合物は代謝物・薬物等に多く存在し，HPLCによる分析時には溶離
液に塩やキレート剤を添加する事で吸着現象を軽減できる。しかしなが
ら，これらの溶離液は質量分析計には使⽤できないものが多く，また，
HPLC
システム流路に残存しゴーストピークの原因となる事も懸念される。
これらの吸着現象は，カラムを含めたHPLCシステム流路全体の⾦属部
分が影響しており，根本的な改善が広く求められているところである。
そこで我々は，カラムボデーに着目し開発・検討を⾏った。PEEK製
のボデーはこれらの物質に対し不活性度が非常に⾼いが，耐圧性が低い。
そのため，ステンレススチールのカラムボデー内面を特殊コーティング
し，フリットは⾼耐圧性の樹脂素材を採⽤することで不活性と⾼耐圧の
両⽴を目指した。本報告ではリン酸基含有化合物を⽤い，新開発したボ
デーのカラムの評価を⾏ったのでここに報告する。
3
講演概要
リン酸基含有化合物の⾦属吸着について
新規高耐圧ステンレスフリーカラムについて
分析例
4講演概要
リン酸基含有化合物の⾦属吸着について
新規高耐圧ステンレスフリーカラムについて
分析例
5
リン酸基含有化合物について
ヌクレオチド
ATP,ADP,AMP,GMP,UDP,CTPなど・・・代謝物
医薬品（有効成分）
農薬
など・・・
6リン酸基含有化合物の⾦属吸着について
Metal Metal Metal MetalMe
n+Me
n+Me
n+Me
n+Me
n+Me
n+Me
n+例えば、下記のHPLC条件でヌクレオチド（ATP、AMP） を分析してみると・・・
Instruments : Nexera
Column : Typical C18 100mmL*2.1mmI.D., 3µm
Mobile Phase : 10 mM Ammonium Formate in Water
:ACN = 99:1_Isocratic flow
Flow Rate : 0.2 mL / min
Oven Temperature : 40
℃
Detection : SPD-M20A at 256nm , Slit Width 1.2nm
Injection Vol. : 1µL
ヌクレオチドの分析例
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 min
AMP
ATP
Adenosine triphosphate (ATP)
ヌクレオチドの分析例
島津アプリケーションニュース No.L423より抜粋 ATP 10配管素材の影響
－：Stainless steel配管(600mm) －：PEEK配管(600mm)リン酸基含有化合物の⾦属吸着について
Column :Typical C18 （100 mm L.×2.1 mm I.D., 3µm） Instrument : Nexera
Mobile Phase : Mobile Phase : 10 mM Ammonium Formate in
Water : MeCN=99:1
Flow Rate : 0.2 mL/min
Column Temp. : 40 ℃
Detection : SPD-M20A at (254 nm)
11
配管素材の影響
リン酸基含有化合物の⾦属吸着について
：600mmL 12リン酸基含有化合物の⾦属吸着について
配管素材の影響
－：Stainless steel配管(600mm) －：PEEK配管(600mm) 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 1.50 1.75 2.00 2.25 2.50 2.75 min 2 2 1 ■Peak 1. Adenosine Triphosphate 2. Adenosine Monophosphate 1 1.48 4.67 PEEK 1.49 5.10 Stainless steel Peak 2 Peak 113
講演概要
リン酸基含有化合物の⾦属吸着について
新規高耐圧ステンレスフリーカラムについて
分析例
14新規高耐圧ステンレスフリーカラムについて
Polymer frit Polymer lining Stainless steel BodyStationary phase
Mastro
TM15 Polymer frit
Polymer lining Stainless steel Body
Stationary phase Mastro（マストロ）カラム 耐圧 Mastro C18 100mmL×2.1mmI.D., 3µm 耐圧 ：50MPa (7250psi)
新規高耐圧ステンレスフリーカラムについて
16新規高耐圧ステンレスフリーカラムについて
Mastro
TM17
講演概要
リン酸基含有化合物の⾦属吸着について
新規高耐圧ステンレスフリーカラムについて
分析例
新規高耐圧ステンレスフリーカラムについて
Column : Mastro C18 100mmL*2.1mmI.D.,3µm Instruments : Nexera
Mobile Phase : 10 mM Ammonium Formate in Water :ACN = 99:1_Isocratic flow
Flow Rate : 0.2 mL / min Oven Temperature : 40 ℃
Detection : SPD-M20A at 256nm , Slit Width 1.2nm Injection Vol. : 1µL
新規高耐圧ステンレスフリーカラムによる
ヌクレオチドの分析例
0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 min 0 10000 20000 30000 uV AMP ATPヌクレオチドの分析例（カラム⽐較）
1.49 5.10 Typical C18 1.14 1.39 MastroTM C18 AMP ATP Peak Asymmetry 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 min 0 10000 20000 30000 40000 50000 60000 uV AMP (Mastro) ATP (Mastro) AMP(Typical C18) ATP(Typical C18)副腎皮質ホルモン製剤，
水溶性ヒドロコルチゾン製剤の分析
副腎皮質ホルモン製剤（有効成分） 水溶性ヒドロコルチゾン製剤（有効成分）
Hydrocortisone Sodium Phosphate Hydrocortisone Sodium Succinate
副腎皮質ホルモン製剤，
水溶性ヒドロコルチゾン製剤の分析
Column : MastroTMC18（100 mm L.×2.1 mm I.D., 3µm） Typical C18 （100 mm L.×2.1 mm I.D., 3µm） Instrument : Nexera
Mobile Phase : 0.1 % Formic Acid in Water : 0.1 % Formic Acid in MeCN=50:50
Flow Rate : 0.2 mL/min Column Temp. : 40 ℃
Detection : SPD-M20A at (254 nm) Injection Vol. : 1µL
副腎皮質ホルモン製剤，
水溶性ヒドロコルチゾン製剤の分析
■Peak
1. Hydrocortisone Sodium Phosphate 2. Hydrocortisone Sodium Succinate Typical C18カラム 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 min 0 2 1
副腎皮質ホルモン製剤，
水溶性ヒドロコルチゾン製剤の分析
1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 min 0 1 2 Mastro MastroMastro MastroTMTMTMTMC18C18C18C18カラムカラムカラムカラム ■Peak1. Hydrocortisone Sodium Phosphate 2. Hydrocortisone Sodium Succinate
副腎皮質ホルモン製剤，
水溶性ヒドロコルチゾン製剤の分析
1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 min 0 1 2 MastroTMC18カラム ■Peak1. Hydrocortisone Sodium Phosphate 2. Hydrocortisone Sodium Succinate
Typical C18カラム 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 min 0 2 1
副腎皮質ホルモン製剤の分析
Column : MastroTMC18（100 mm L.×2.1 mm I.D., 3µm） Typical C18 （100 mm L.×2.1 mm I.D., 3µm） Instrument : Prominece UFLCXR+ LCMS - 2020
Mobile Phase : A：0.1 % Formic Acid in Water B： 0.1 % Formic Acid in MeCN
Flow Rate : 0.2 mL/min Column Temp. : 40 ℃
Detection : MS (SIM mode) Injection Vol. : 2µL
0.01min ポンプ B.Conc 10％
5.00 ポンプ B.Conc 80
5.01 ポンプ B.Conc 10
副腎皮質ホルモン製剤の分析 10ppm
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 min 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 (x100,000) Mastro MastroMastro MastroTMTMTMTMC18C18カラムC18C18カラムカラムカラム Typical Typical Typical Typical C18C18C18C18カラムカラムカラムカラム S/N : 685 S/N : 685S/N : 685 S/N : 685 S/N : 492 S/N : 492 S/N : 492 S/N : 492副腎皮質ホルモン製剤の分析 5ppm
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 min 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 (x10,000) Mastro Mastro Mastro MastroTMTMTMTMC18C18C18C18カラムカラムカラムカラム Typical Typical Typical Typical C18C18C18C18カラムカラムカラムカラム S/N : 567 S/N : 567S/N : 567 S/N : 567 S/N : 425 S/N : 425 S/N : 425 S/N : 425副腎皮質ホルモン製剤の分析 1ppm
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 min 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 1.1 1.2 1.3 1.4 1.5 1.6 1.7 1.8 (x10,000) Mastro MastroMastro MastroTMTMTMTMC18C18カラムC18C18カラムカラムカラム Typical TypicalTypical Typical C18C18C18C18カラムカラムカラムカラム S/N : 539 S/N : 539S/N : 539 S/N : 539 S/N : 141 S/N : 141S/N : 141 S/N : 141副腎皮質ホルモン製剤の分析 0.1ppm
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 min 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 3.0 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 3.6 3.7 3.8 3.9 (x1,000) Mastro Mastro Mastro MastroTMTMTMTMC18C18C18C18カラムカラムカラムカラム Typical TypicalTypical Typical C18C18C18カラムC18カラムカラムカラム S/N : 34 S/N : 34 S/N : 34 S/N : 34 S/N : 9.5 S/N : 9.5 S/N : 9.5 S/N : 9.5副腎皮質ホルモン製剤の分析 25ppb
0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 min 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9 3.0 3.1 3.2 3.3 3.4 3.5 (x1,000) Mastro MastroMastro MastroTMTMTMTMC18C18C18C18カラムカラムカラムカラム Typical TypicalTypical Typical C18C18C18カラムC18カラムカラムカラム S/N : 24 S/N : 24 S/N : 24 S/N : 24 S/N :2.8 S/N :2.8 S/N :2.8 S/N :2.8まとめ
リン酸基含有化合物の分析において新規高耐圧ステンレスフリーLCカラム “MastroTM”が有効である事が示唆された。 ギ酸、ギ酸アンモニウム等の揮発性の塩を用いリン酸基含有化合物を分析したと ころ、⼀般的なステンレスボデーカラムに⽐べ良好なピーク形状となった事より 、LC/MS(/MS)分析において有効である事が示唆された。終わりに
本資料は静岡県⽴⼤学 薬学部 生体機能分子分析学分野 轟⽊堅⼀郎准教授との 共同研究により得られたデータを使用しております。
