超音波造影ガスを封入したバブルリポソームの開発とその応用

超音波造影ガスを封入したバブルリポソームの開発とその応用

鈴木　亮・丸山一雄

帝京大学 薬学部

〒 229-0195 神奈川県相模原市相模湖町寸沢嵐 1091-1

Recently, we developed novel liposomal nanobubbles (Bubble liposomes) containing perfluoropropane, which is an

ultrasound imaging gas. Here, we used ultrasound to induce cavitation in Bubble liposomes and then investigated

their ability to deliver gene and drug. The combination of Bubble liposomes and ultrasound could deliver plasmid

DNA into many cell types without cytotoxicity. Additionally, in cancer gene therapy, this system could effectively

deliver interleukin–12 (IL–12) corded plasmid DNA into tumor tissue and effective anti–tumor effect was achieved.

Moreover, this system could be utilized as an effective anti

–cancer agent delivery system into the cancer cells which

had the resistance for the agent. Thus, this system might be a novel and efficient gene and drug delivery system.

Key words : liposome

／ ultrasound ／ nanobubble ／ sonoporation ／ drug delivery system

Development of Bubble Liposomes Entrapping the Gas

for Ultrasound Imaging

Ryo Suzuki and Kazuo Maruyama

Department of Biopharmaceutics, School of Pharmaceutical Sciences, Teikyo University

1091-1 Suwarashi, Sagamiko, Sagamihara, Kanagawa 229-0195, Japan

1.

はじめに

リポソームは脂質二重膜からなる閉鎖小胞であり，

その内部に薬物を封入したり，表面にポリマーや抗

体などを修飾できる性質を有していることから，薬

物キャリアーとして期待されている．実際に Table 1

に示すようなリポソーム製剤が世界中で上市されて

おり，リポソーム技術は薬物治療の最適化を目指す

ドラッグデリバリーシステム（DDS）のための製剤

技術として注目されている．そのなかで著者らは，

リポソームに関する研究を長年続けており，がん細

胞にアクティブターゲティング可能な抗がん剤封入

リポソームや中性子補足療法におけるがん組織への

ボロン化合物送達システムとしてのリポソームの利

用など様々なリポソーム開発に携わってきた

_．そ

して最近では，新たな取り組みとしてリポソームの

内水相部分に超音波造影ガスであるパーフルオロプ

ロパンを封入した新たなタイプのリポソーム開発を

行っている

．そこで本稿では，著者らが開発を

続けているリポソーム型微小気泡（バブルリポソー

ム）と超音波照射の併用による遺伝子・薬物デリバ

リーについて紹介する．

2.

バブルリポソームについて

バブルリポソームは，リポソームに超音波造影ガ

スであるパーフルオロプロパンを封入することで調

製される

_{．著者らは，血中安定性・滞留性に優れ，}

標的指向性を容易に付与可能なポリエチレングリコ

ール（PEG）修飾リポソームにガスを封入したバブ

ルリポソームを調製した（Fig. 1）．このバブルリポ

●特集

医薬品開発，膜研究からのアプローチ

ソーム懸濁液は白濁しており，この懸濁液を静置す

ると，マイクロバブルと同様に水相上部に浮上する

性質を有していた．なお，この浮上したバブルリポ

ソームは，混和により容易に再懸濁可能であった．

このバブルリポソームを Darklite illuminator（NEPA

GENE

）を用いて顕微鏡観察したところ，市販され

ているマイクロバブルである Sonazoid（第一三共株

式 会 社 ） よ り 小 さ い 粒 子 で あ る こ と が 判 明 し た

（Fig. 1）．Table 2 に世界で市販されているマイクロバ

ブルの一覧を示した．この表をみると既存のマイク

ロバブルのサイズは比較的大きいことがわかる．角

田らは，マウスに多量の Optison を単回静脈内投与す

ると，毛細血管に詰まりマウスが死亡することを報

告している

_{．著者らは，バブルリポソームにおいて}

も同様の影響があるかを確認したところ，バブルリ

ポソーム量として 500 μg/マウスの投与でも致死マウ

スは認められなかった．これは，バブルリポソーム

が Optison より小さいために毛細血管における塞栓を

誘導しなかったためであると考えられた．それゆえ，

バブルリポソームが既存のマイクロバブルより組織

深部への到達性に優れたバブル製剤であると推察さ

れる．

3.

バブルリポソームを利用した超音波遺伝

子デリバリー

超音波を利用した遺伝子導入研究は 1987 年に

Fechheimer

らによる報告から始まった

．この超音

波による遺伝子導入メカニズムとしてキャビテーシ

ョン（空洞現象）が関与していると考えられている．

キャビテーションとは，液体に超音波を照射したと

きの負の圧力が液体を維持するのに必要な圧力に打

ち勝ったときに空洞を生じる現象である．このキャ

ビテーション気泡は最終的に圧壊するが，この圧壊

時に気泡近傍にジェット流が生じ，このエネルギー

により細胞膜に一過性の小孔が開くことで，細胞外

の物質が細胞内に送達されると考えられている．し

かし，超音波を利用した初期の遺伝子導入ではキャ

ビテーションの誘導効率を高めるために 20 ～ 50 kHz

の低い周波数の超音波が用いられており，細胞に対

する傷害性が問題となっていた．この問題を解決す

るために考えられたのが，超音波によるキャビテー

ションを誘導しやすくするために予めキャビテーシ

ョンの核となる微小気泡を存在させておくことであ

る（Fig. 2（a））．すなわち，上述の超音波遺伝子導

入において超音波造影剤であるマイクロバブルを添

加することで，低い超音波照射強度および短時間で

遺伝子導入可能であることが報告されるようになっ

た．そこで，このキャビテーションを利用した遺伝

子デリバリーが既存のマイクロバブルより粒子径の

小さいバブルリポソームでも可能であることを評価

した．様々な種類の細胞にルシフェラーゼ発現プラ

スミド DNA を超音波単独またはバブルリポソームと

超音波照射の併用により遺伝子導入したところ，い

ずれの細胞種においてもバブルリポソームと超音波

Table 1 Liposomal drug in the world

Fig. 2 Gene delivery with Bubble liposomes and ultrasound. (a) Schema of gene delivery mechanism

(b) Gene delivery into various types of cells

Cells (1 × 105_{cells/500 μL) mixed with pCMV–Luc (5 μg) and Bubble liposomes (60 μg)} were exposed or not to ultrasound (2 MHz, 2.5 W/cm2_{, 10 sec). The cells were washed and} cul-tured for 2 days. Thereafter, luciferase activity was measured. Data are shown as means ± S.D. (n＝ 3). BL: Bubble liposomes, US: Ultrasound.

Table 2 Comparison of microbubbles and Bubble liposome

照射の併用により高いルシフェラーゼ発現が認めら

れた（Fig. 2（b））．このようにバブルリポソームと

超音波の併用が細胞種を問わず遺伝子導入可能であ

ったのは，キャビテーションによる物理的エネルギ

ーを利用して細胞質内に遺伝子を直接導入できるた

めであると考えられた．

4.

バブルリポソームを利用した超音波がん

遺伝子治療

近年，interleukin–12（IL–12）を用いたサイトカイ

ン療法が，抗腫瘍免疫の活性化によるがん治療法と

して注目されている．しかし，IL–12 の全身投与では，

全身性の副作用の発現が懸念されている．そのため，

がん組織で局所的に長時間 IL–12 を作用させることの

できる IL–12 がん遺伝子治療が有望な治療法になると

考えられている．遺伝子治療を行うにあたり安全性

の観点から，非ウイルスベクターの利用が期待され

ている．しかし，既存の非ウイルスベクターは in

vivo

における遺伝子導入効率が低く，IL–12 遺伝子治

療への適用は困難であり新たな遺伝子導入法の開発

が求められている．そこで我々は，前項で紹介した

バブルリポソームと超音波の併用による遺伝子導入

システムを用い，IL–12 遺伝子治療への応用の可能性

を評価した（Fig. 3）．その結果，既存の遺伝子導入

試薬である Lipofectamine 2000 で IL–12 遺伝子導入を

行っても全く腫瘍増殖抑制効果が得られなかったの

に対し，バブルリポソームと超音波照射を利用して

がん組織に遺伝子導入した群で顕著な腫瘍増殖抑制

が認められた．一方，この腫瘍増殖抑制効果はコン

トロールプラスミドであるルシフェラーゼ発現プラ

スミド DNA 導入において全く認められなかった．こ

のことから，バブルリポソームと超音波照射を利用

した IL–12 遺伝子治療では，IL–12 ががん組織で効率

よく発現し，強力な抗腫瘍免疫が誘導されたために

得られた結果であると考えられた．以上の結果より，

バブルリポソームと超音波照射の併用法は IL–12 がん

遺伝子治療において有用な非ウイルスベクターにな

ることが示唆された．

5.

バブルリポソームを利用した超音波薬物

デリバリー

がん化学療法において抗がん剤耐性細胞の出現は，

がん治療効果の低下を引き起こす重大な問題として

考えられている．この抗がん剤耐性は，主に P– 糖た

ん白質（P–gp）や多剤耐性関連たん白質（MPR）な

どのトランスポーターの発現による抗がん剤の細胞

外への排出や薬物代謝酵素の発現誘導による抗がん

剤の代謝促進によるものと考えられている．したが

って，投与する抗がん剤の変更や投与量を増加させ

るなどの対策がとられている．しかし，抗がん剤投

与量の増加に伴い，副作用の発現頻度も高くなって

しまうのが現状である．この問題を解決する方法と

して，トランスポーターによる抗がん剤排出や代謝

酵素による抗がん剤の不活性化能力を超える多量の

抗がん剤をがん細胞内に送達することができれば，

抗がん剤耐性がん細胞を効率よく傷害可能になるも

のと期待される．そこで，ヒト白血病細胞（K562 細

胞）のドキソルビシン耐性細胞株である K562/Adr 細

胞に対し，バブルリポソームと超音波照射の併用に

よるドキソルビシンデリバリーを行ったときの細胞

傷害性を評価した．まずはじめに，K562 細胞および

K562/Adr

細胞のドキソルビシンに対する感受性を評

価するため，各細胞のドキソルビシンに対する傷害

性を IC

（50% 阻害濃度： 50% Inhibition

concentra-tion

）を指標に検討した，その結果，K562 細胞およ

び K562/Adr 細胞の IC

は，それぞれ 0.035 μg/mL

および 4.4 μg/mL であり，K562/Adr 細胞は K562 細

胞よりも約 100 倍高いドキソルビシン耐性を有してい

た．次に，K562/Adr 細胞がほとんど傷害されないド

キソルビシン濃度である 0.5 μg/mL におけるバブル

リポソームと超音波を利用したドキソルビシンデリ

バリーによる細胞傷害性を検討した（Fig. 4）．その

結果，ドキソルビシン単独，ドキソルビシンとバブ

ルリポソーム，バブルリポソームと超音波照射にお

いて細胞傷害性は低かった．一方，バブルリポソー

ムと超音波照射の併用によりドキソルビシンを細胞

にデリバリーすることで高い細胞傷害が認められた．

これは，がん細胞における抗がん剤の排出または代

謝能力よりはるかに多い抗がん剤が，バブルリポソ

Fig. 3 Anti–tumor effect of IL–12 gene delivery.

B6C3F1 mice were intradermally inoculated with 1× 106OV–HM cells into the flank. On day 7 after tumor inoculation, the tumors were injected with pCMV–IL12 (10μg) using Bubble liposomes (2.5μg) and/or ultrasound (1 MHz, 0.7 W/cm2_{, 1} min), or Lipofectamine 2000 as a conventional lipo-fection method. The volume of the growing tumors was calculated by: (tumor volume; mm3_)＝(major axis; mm)×(minor axis; mm)2_{× 0.5). The data are} represented as tumor volume relative to the tumor volume on day 7 after tumor inoculation. Each point represents the mean± SD (n ＝ 5). BL: Bubble lipo-somes, US: Ultrasound, LF2000: Lipofectamine 2000, pCMV–IL–12: IL–12 cording plasmid DNA, pCMV–Luc: Luciferase cording plasmid DNA

Fig. 4 Doxorubicin (DXR) delivery into DXR resistant tumor cells with Bubble liposomes and ultrasound.

K562/Adr cells (2× 105_{cells/well) were cultured} on 48 wells plate for 24 hr. After that, doxorubicin solution (final conc. 0.5μg/mL) and Bubble lipo-somes (final conc. 0.1μg/mL) were added into the wells. Ultrasound (2 MHz, 0.5 W/cm2_{, 10 sec}× 2) was exposed to cells. After 48 hr of culture, cell via-bility was measured by MTT assay. DXR: doxoru-bicin, BL: Bubble liposome, US: Ultrasound

ームと超音波照射の併用により送達されたためであ

ると考えられた．以上の結果から，バブルリポソー

ムと超音波照射の併用を利用した抗がん剤デリバリ

ーは，がん化学療法における抗がん剤耐性の問題を

解決しうる抗がん剤デリバリーの基盤技術になるも

のと期待される．

6.

おわりに

これまでの医学において，診断と治療は異なる領

域として捉えられていた．しかし，本稿で示したよ

うに超音波造影剤は単なる診断用製剤ではなく，治

療にも応用可能であることが示唆された．現時点で

は，診断薬としての超音波造影剤が技術的に先行し

ており，2007 年 1 月に肝がん診断用の超音波造影剤

である Sonazoid が，世界に先駆けて本邦で上市され

た．この Sonazoid は，静脈内投与後に肝臓のクッパ

ー細胞に積極的に取り込まれ，クッパー細胞密度の

低い肝がん組織と正常組織の超音波造影におけるエ

コーシグナルのコントラストを鮮明にすることに成

功している．このようなアクティブターゲティング

型超音波造影剤は，今後の超音波診断の発展に必要

不可欠なツールであると思われる．このような背景

のもと，著者らもアクティブターゲティング型バブ

ルリポソームの開発に着手している．今回紹介しな

かったが，バブルリポソーム表面に血栓を認識する

ペプチドを修飾し，血栓モデル動物に静脈内投与す

ることで，バブルリポソームの血栓部位への集積を

超音波造影により確認している．さらに，この集積

したバブルリポソームにキャビテーションを誘導す

るような周波数・強度の超音波を体外から照射する

ことで，血栓を破壊し血流を再開することが可能で

あることも確認している．このようにアクティブタ

ーゲティング型バブルリポソームは，これまで超音

波造影に適さない部位のイメージングや低侵襲的治

療を可能にする診断・治療システムを確立する上で

重要な役割を演じるものと考えられる．

最近の超音波装置の小型化・高性能化により，ベ

ッドサイドでの超音波診断・治療が今後ますます普

及すると考えられる．しかしながら，現在の超音波

造影用マイクロバブルはサイズ・安定性・標的指向

性付与の点で数多くの課題を有している．超音波診

断・治療装置の完成度が高くても，それらと併用す

るバブル製剤が最適化されていなければ，超音波を

用いた医療の進展はないといっても過言ではない．

すなわち超音波診断・治療の発展は，優れた超音波

診断・治療剤となるバブル製剤の開発にかかってい

る．それゆえ，今回紹介したような特性を有するバ

ブルリポソームが，次世代型バブル製剤として超音

波診断のみならず超音波治療や薬物・遺伝子デリバ

リーツールに利用され，新たな医療システム構築に

貢献できることを期待したい．

謝

辞

本稿で紹介したバブルリポソームに関する研究は，

帝京大学 薬学部 生物薬剤学教室で行われた研究であ

り，研究遂行にご協力いただいた宇都口直樹先生，

小田雄介先生ならびに学生諸氏に深謝する．本研究

の一部は，厚労省科研費：第 3 次対がん総合戦略研究

事業，医薬基盤研究所：保健医療分野における基礎

研究推進事業，新エネルギー・産業技術総合開発機

構（NEDO）：深部治療に対応した次世代 DDS 型治

療システムの研究開発事業，文科省科研費：萌芽研

究，基盤研究（A），基盤研究（B），若手研究（B）

の研究助成により遂行された研究である．

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Natl. Acad. Sci. U. S. A., , 8463-8467 (1987) (Received 10 September 2009 ; Accepted 29 September 2009) 著者略歴 鈴木　亮（すずき　りょう） 1996年 3 月 東京薬科大学薬学部 薬学科卒業 1998年 3 月 大阪大学大学院薬学 研究科博士前期課程 修了 2001年 3 月 大阪大学大学院薬学 研究科博士後期課程 修了 薬学博士（大 阪大学）取得 2001年 4 月 東 レ 株 式 会 社 入 社 医薬研究所配属 2003年 4 月 東レ株式会社先端融 合研究所に異動 （薬物ナノキャリア ー に 関 す る 研 究 に 従事） 2004年 3 月 東レ株式会社退社 2004年 4 月 帝京大学薬学部生物 薬剤学教室　助手 2007年 4 月 帝京大学薬学部　生 物薬剤学教室　助教 現在に至る 丸山　一雄（まるやま　かずお） 1979年 3 月 熊本大学大学院薬学 研 究 科 修 了 　 薬 学 修士 1979年 4 月 帝京大学薬学部薬剤 学教室　助手 1988年 2 年間 The University of Tennessee 博士研 究員として留学 Leaf Huang教授の 下でステルスリポソ ームの研究に従事 1999年 4 月～現在　信州大学医学 部　非常勤講師 2002年～現在　帝京大学薬学部生 物薬剤学教室　教授 2002年 京都大学原子炉研究 施設　客員教授 2007年 九州大学大学院工学 府　非常勤講師