二 段 階PCR法
に よ る 咽 頭 ス ワ ブ か ら の
Mycoplasma
pneumoniae検
出
神奈川県衛生研究所細菌病理部
岡
崎
則
男
山
井
志
朗
国立感染症研究所安全性研究部
佐 々 木
裕
子
佐 々 木
次
雄
(平成10年1月21日 受付)
(平成10年4月14日 受理)
Key words : two-step
PCR, Mycoplasma pneumoniae,
throat
swab
要 旨 Mycoplasma pneumoniaeの16SrRNA遺 伝 子 領 域 か ら設 定 し た2組 の プ ラ イ マ ー を使 用 し,二 段 階 PCR法 に よ るM.pneumoniae検 出 を 検 討 し た .本PCR法 で は1.5fgのM.pneumonine遺 伝 子 が 検 出 可 能 で,M.pneumontae以 外 の ヒ ト系 マ イ コ プ ラ ズ マ11種 お よ び 口 腔 内 細 菌4種 の 遺 伝 子 は検 出 さ れ な か っ た.M.pneumonine感 染 を疑 わ れ た 急 性 呼 吸 器 疾 患 患 者322例 の 咽 頭 ス ワ ブ に こ の 二 段 階PCR法 を 応 用 した 結 果,陽 性 率 は23.6%で,一 段 階PCR(20.8%)お よ び 分 離 培 養 法(20 .2%)の 陽 性 率 よ り高 か っ た.ま た,培 養 あ る い は血 清 抗 体 検 査 でM.pneumoniae感 染 が 証 明 さ れ た に もか か わ らず ,一 段 階 PCR法 で 陰 性 と判 定 さ れ た13例 中7例 が 二 段 階PCR法 で は 陽 性 とな っ た .更 に 一 段 階PCRで は増 幅 が 不 十 分 で,判 定 に困 惑 し た5例 が 二 段 階PCRに お い て 明 瞭 な 陽 性 を 示 した .以 上 の 成 績 か ら,二 段 階 PCR法 は 操 作 が 煩 雑 で は あ る も の の,臨 床 材 料 か ら のM .pneumoniae検 出 に 有 用 な手 段 と考 え ら れ た .は じめ に
最 近,感
染 症 の 迅 速 診 断 法 と し てPCR法
が 注
目 さ れ て お り,Mycoplasma
pnezamonlae感
染 症
の 診 断 に お い て も この 方 法 が 応 用 さ れ 始 め て い
る1)∼6).著
者 ら4)は前 報 に お い て,一 段 階PCR法
に
よ るM.pneumonine検
出 を検 討 し,そ の有 用 性
を 認 め る一 方 で,臨 床 試 料 に応 用 す る と感 度 が や
や低 下 す る こ と を指 摘 した.感 度 を 高 め る た め に,
NestedPCR等
の 二 段 階PCR法
が 既 に試 み られ
て い るが1)3),いず れ もPCR操
作 だ けで な く,試 料
調 製 も煩 雑 で,実 用 的 で は な い よ う に思 わ れ る.
本 報 で は,患 者 咽 頭 ス ワ ブ か ら簡 便 な方 法 で 調 製
し た 試 料 に 二 段 階PCR法
を 適 用 し,良 い 成 績 が
得 られ た の で 報 告 す る.
材 料 と方 法
1. 供 試 菌 株
東 京 大 学 医 科 学 研 究 所 微 生 物 保 存 室 よ り分 与 さ
れ たMycoplasma属9菌
株,Acholeplasma属
お よ
びUreaplasma属
各1菌 株 な らび に 神 奈 川 県 衛 生
研 究 所 細 菌 病 理 部 で分 離 同 定 さ れ た細 菌4菌 株 の
計15株 を供 試 した.そ の 内訳 は以 下 の 通 りで あ る.
Mycoplasma
pneumoniae-Mac,
Mycoplasma
buccale, Mycoplasma fermentans,
Mycoplasma
genitalium,
Mycoplasma hominis,
Mycoplasma
orale,
Mycoplasma
penetrans,
Mycoplasma
primatum,
Mycoplasma salivarium,
Acholeplas-ma laidlawii,
Ureaplasma urealyticum,
Bacillus
subtilus, Escherichia coli, Enterococcus faecalis,
別刷 請 求 先:(〒241-0815)神 奈 川 県横 浜 市旭 区中 尾1 -1-1
神 奈 川 県衛 生 研 究所 細 菌病 理 部
Stmphylococcu saureus こ れ ら の 菌 株 をSasakiら7)の 記 載 に 従 っ て 培 養 し,実 験 に 供 し た. 2. 咽 頭 ス ワ ブ 1992年 ∼1995年 に,神 奈 川 県 の 結 核 ・感 染 症 サ ー ベ イ ラ ン ス に お い てM.pneumoniae感 染 を 疑 わ れ た322名 お よ び イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル ス 感 染 を 疑 わ れ た96名 の 急 性 呼 吸 器 疾 患 患 者 な ら び に 健 常 者50名 よ り採 取 さ れ た 咽 頭 ス ワ ブ を 使 用 し た.ま た,M.pneumoniae感 染 の 集 団 発 生 事 例(1995年) に お い て 採 取 さ れ た 咽 頭 ス ワ ブ で,当 所 へ の 搬 入 過 程 に お け る ト ラ ブ ル に よ り 凍 結(-20℃)融 解 を3回 繰 り返 し た57例 も併 せ て 使 用 し た. 3. プ ラ イ マ ー M.pneblmoniaeの16SrRNA遺 伝 子 領 域 の 一 部 を プ ラ イ マ ー と し た.一 次 お よ び 二 次PCRに 用 い た プ ラ イ マ ー の 塩 基 配 列 は 下 記 の 通 りで あ る が,二 次PCRの 下 流 プ ラ イ マ ー は 一 次PCRと 同 じ も の を 使 用 し た.尚,二 次PCRに 用 い た プ ラ イ マ ー は,M.Pneumoniae遺 伝 子 を 特 異 的 に 増 幅 す る こ と がSasakiら7)に よ り確 認 さ れ て い る. 一 次PCR;5/GCAAGTCGATCGAAAGTA-GT3' 5'ATTTGCTCACTTTTACAT-GCTGGCG3 二 次PCR;5'GAATGACTTTAGCAG-GTAATGGCTA3' 5'ATTTGCTCACTTTTACAT-GCTGGCG3' ま た,比 較 の た め 実 施 し た 一 段 階PCR法 に は
Sasakiら7)お よ びvan Kuppeveldら8)の 報 告 し た
プ ラ イ マ ー を使 用 し た. 4. PCR法 咽 頭 ス ワ ブ か ら のPCR試 料 の 調 製 は 次 の よ う に 行 っ た.咽 頭 ス ワ ブ を マ イ コ プ ラ ズ マ 保 存 培 地9)中 で 充 分 絞 り 出 し,そ の 絞 り 液1mlを15,000 rpm30分 遠 心 し て 沈 渣 を1%Triton-X加STE 緩 衝 液10)0.1mlに 再 浮 遊 さ せ た.こ れ を100℃10分 加 熱 後,急 冷 し てPCR試 料 と した.ま た,上 記 各 マ イ コ プ ラ ズ マ お よ び 細 菌 か ら 所 定 の 方 法11)で DNAを 調 製 し,PCRの 特 異 性 あ る い は 感 度 を調 べ る た め に 使 用 し た. 一 次PCR反 応 液 は50mMKCl ,10mMTris-HCI(pH9.0),0.1%TritonX-100,2mMMgCI2, 0.2mMd-NTP,31.25nMプ ラ イ マ ー お よ び 耐 熱 性DNAポ リ メ ラ ー ゼ1Uよ り成 り,二 次PCR反 応 液 に は プ ラ イ マ ー 濃 度 を50nMと し た も の を 使 用 し た.一 次PCRは 反 応 液40μlに 試 料10μl,二 次 PCRは 反 応 液45μlに 一 次PCR産 物 の5μlを 試 料 と し,各 々 全 量 を50μlと し た.増 幅 反 応 は 一 次 お よ び 二 次 共 に"94℃1分,59℃1.5分 お よ び72℃ 2分 を30サ イ ク ル"の 条 件 で 実 施 し た.PCR産 物 の 解 析 は1.5%ア ガ ロ ー ス ゲ ル を 使 用 し た 電 気 泳 動 と エ チ ジ ウ ム ブ ロ マ イ ド染 色 に よ り行 っ た.比 較 の た め に 実 施 し た 一 段 階PCR法 は 既 報4)8)に 従 っ た. 5. 分 離 培 養 M.pnezamoniae分 離 培 養 の 試 料 に は 咽 頭 ス ワ ブ 絞 り液 を 使 用 し,分 離 培 養 は 二 層 培 地 と寒 天 平 板 培 地 で9),同 定 は 抗 血 清 に よ る 発 育 阻 止 試 験 で 行 っ た12). 結 果 1. 特 異 性 と感 度 Fig.1に 示 す よ う に,二 段 階PCRで807bpの
Fig. 1 Specificity of two-step PCR method for M.
pneumoniae.
Lane 1, pHY marker ; 2, M. pneumoniae-Mac;
3,
M. buccale; 4, M. fermentans, 5, M. genitalium ; 6,
M. hominis ; 7, M. orale ; 8, M. penetrans ; 9, M.
primatum ; 10, M. salivarium ; 11, Acholeplasma
laidlawii ; 12, Ureaplasma urealyticum ; 13,
Bacil-lus subtiBacil-lus ; 14, Eschericha coli ; 15, Enterococcus
faecalis ; 16, Staphylococcus aureus ; 17, no
tem-plate.
M.pneumoniae遺 伝 子 断 片 が 増 幅 さ れ,今 回 供 試 し たM.pneumoniae以 外 の ヒ ト系 マ イ コ プ ラ ズ マ11種 お よ び 細 菌4種 の 遺 伝 子 は 増 幅 さ れ な か っ た.本PCRの 遺 伝 子 検 出 感 度 は,Fig.2に 示 す よ う に1.5fgで あ っ た.尚,比 較 の た め 実 施 し た 一 段 階PCRの 感 度 は15fgで あ っ た. 2. 分 離 培 養 法 との 比 較 Table1に,患 者 咽 頭 ス ワ ブ か ら のM. Pneumoniae検 出 に お け る 二 段 階PCR法 と 分 離 培 養 法 に よ る 成 績 を 示 し た.322例 中,PCR法 に よ る 検 出 率 は23.6%そ し て 培 養 法 の そ れ は20。2%で あ っ た.雑 菌 増 殖 に よ り培 養 検 査 で は 結 果 が 判 明 し な か っ た29例 中 にPCR陽 性 が10例(34.5%)存 在 し た.イ ン フ ル エ ン ザ を 疑 わ れ た 患 者 由 来96例 お よ び 健 常 者 由 来50例 の 咽 頭 ス ワ ブ の 中 にPCR 陽 性 あ る い は 培 養 陽 性 例 は な か っ た. 3. 一 段 階PCR法 と の 比 較
Fig. 2 Sensitivity of two-step PCR method for M.
p neumonice.
Lane 1, pHY marker ; 2, 1, 500fg/assay ; 3, 150fg ;
4, 15fg ; 5, 1.5fg ; 6, 0 .15fg ; 7, 0 .015fg ; 8, negative
control.
Table 1 Evaluation of two-step PCR method in comparison with culture method for the detection of M. Pneumoniae from throat swabs
*Culture result was not reliable due to contamination with other bacteria.
二 段 階PCR法 と 前 報4)で 報 告 し た 一 段 階PCR 法 の 比 較 をTable2に 示 し た.前 者 の 陽 性 率 23.6%に 対 し,後 者 の そ れ は20.8%で あ っ た.一 段 階PCRで は 陰 性 を 示 し た255例 中,二 段 階 PCRで 陽 性 と な っ た9例(3.5%)が 認 め ら れ た . ま た,培 養 あ る い は 血 清 抗 体 検 査 でM.pneumon-iae感 染 が 証 明 さ れ た に も か か わ ら ず,一 段 階 PCR法 で は 陰 性 を 示 し た13例 中7例 が 二 段 階 PCR法 で 陽 性 を 示 し た.更 に,一 段 階PCR法 で は 遺 伝 子 増 幅 が 不 十 分 で,判 定 に 戸 惑 っ た5例 が 二 段 階PCR法 で は 明 瞭 な 陽 性 と な っ た . M.pneumoniae感 染 の 集 団 発 生 事 例 で 採 取 さ れ た 咽 頭 ス ワ ブ で,凍 結 融 解 を3回 繰 り返 し た 後 の 咽 頭 ス ワ ブ よ り 調 整 し た 試 料57例 に つ い て は, 培 養 検 査 で の 陽 性 例 は 認 め ら れ ず,一 段 階PCR 法 で11例(19.3%)お よ び 二 段 階PCR法 で は29例 (50.9%)が 陽 性 を 示 し た. 考 察 二 段 階PCR法 は,一 回 目 のPCRで 増 幅 し た 遺 伝 子 断 片 の 塩 基 配 列 の 内 側 に 設 定 し た プ ラ イ マ ー を 使 用 し,再 度PCRに よ る 増 幅 を す る た め,感 度 お よ び 特 異 性 共 に 一 段 階PCR法 よ り も優 れ て い る と さ れ る.今 回 著 者 ら が 検 討 し たM.pneumo-niae検 出 の た め の 二 段 階PCR法 は1 .5fgの DNAを 検 出 で き た が,こ れ は 試 料 中 に 存 在 す る 1∼2個 のM.pneumoniaeを 検 出 可 能 で あ る こ と を 示 し て お り,十 分 に 満 足 し 得 る 感 度 と 言 え る . 二 段 階PCR法 の 感 度 に つ い て はNaritaら3)が 5∼50fgと し,石 田 ら1)は1CFUと 報 告 し て い る. CFUで 表 すPCR感 度 は 正 確 性 に 欠 け る と 考 え ら れ る こ と か ら,Naritaら の 報 告 と比 較 す る と本 報 のPCRは よ り 高 い 感 度 を 持 っ と言 え る.一 方
Table 2 Evaluation of two-step PCR method in comparison with single-step PCR method for the detection of M. pneumoniae from throat swabs
で,van
Kuppeveldら8)は
一 段 階PCR法
で1fgの
感 度 が 得 られ た こ と を報 告 して い るの で,著 者 ら
も彼 ら と同 じ プ ラ イ マ ー に よ り検 討 し た.使 用 し
た 耐 熱 性DNAポ
リ メ ラー ゼ お よ びPCRイ
ン
キ ュベ ー タ ー の メ ー カ ー が 異 な るの で,直 接 的 に
比 較 す る に は問 題 が あ るが,15fgの
感 度 で あ り,
著 者 ら の 二 段 階PCR法
よ り高 い 感 度 は 示 さ な
か っ た.
二 段 階PCRを
臨 床 試 料(咽 頭 ス ワ ブ)に 適 用 し
た 場 合,一
段 階PCR法
で 陰 性 を示 した 臨 床 試 料
9例 お よび 遺 伝 子 増 幅 が 不 十 分 で 判 定 に戸 惑 った
5例 が 二 段 階PCRで
は明 瞭 な 陽 性 とな り,陽 性
率 が 上 昇 した.著 者 ら4)は前 報 で,咽 頭 ス ワブ か ら
調 製 した 試 料 に 一 段 階PCR法
を応 用 す る と感 度
の低 下 を 招 く こ と を指 摘 し た.こ
れ は 何 ら か の
PCR阻
害 作 用 に よ る もの と考 え られ るが,二 段 階
PCR法
で は この よ う な 阻 害 作 用 もあ る程 度 解 消
さ れ る もの と推 察 され る.ま た,M.pnezamoniae
感 染 の 集 団 発 生 事 例 に お い て 採 取 さ れ,検 査 以 前
に凍 結 融 解 を3回 繰 り返 した57例 の咽 頭 ス ワ ブ よ
り調 製 した 試 料 に つ きPCRを
実 施 した と こ ろ,
二 段 階PCR法
で の 陽 性 率 が50.9%で
あ っ た の に
対 し,一 段 階PCR法
の そ れ は19.3%で
あ った.こ
れ ら咽 頭 ス ワ ブ の培 養 成 績 は全 て陰 性 で あ っ た こ
とか ら,試 料 中 のM.pneumonineは
死 滅 し て い
た も の と考 え られ,更 に,一 段 階PCR法
で の 陽性
率 が 著 し く低 か っ た こ と は,試 料 中 のPCR阻
害
因 子 の存 在 あ る い は増 幅 可 能 な鋳 型 遺 伝 子 の 量 が
極 め て少 な か っ た こ と を示 す もの と思 わ れ る.二
段 階PCR法
は この よ う な試 料 に対 し て も強 力 な
武 器 とな り得 る こ とが 示 さ れ た.
PCR法
で は検 出 目的 とす る病 原 体 が 生 菌 で あ
る必 要 は な く,増 幅 可 能 な遺 伝 子 さ え存 在 す れ ば
検 出 で き るが,こ
の こ と はPCR法
が 病 原 体 と疾
患 との 因 果 関 係 を直 接 的 に証 明 す る もの で は な い
こ と を示 し て お り,検 出感 度 が 高 い ほ ど この 問 題
は大 き くな ろ う.こ の よ うな観 点 か ら,50例
の健
常 者 お よ び イ ン フル エ ンザ が 疑 わ れ た96例 の患 者
よ り採 取 し た 咽 頭 ス ワ ブ に つ き著 者 ら の 二 段 階
PCR法
を応 用 した と こ ろ,全 て 陰 性 で あ った.こ
の件 に関 して は今 後 更 に 多 くの例 に つ い て確 認 す
る 必 要 が あ る と 思 わ れ る が,健 常 者 お よ びM. pneumonine感 染 症 以 外 の 疾 患 か らM.pneumo-niae遺 伝 子 が 検 出 さ れ る こ と は 希 で あ る よ う に 思 わ れ る こ と か ら,本PCR法 で 陽 性 で あ れ ばM. pneumonine感 染 症 と判 断 し て ほ ぼ 間 違 い は な い と 考 え られ る. 遺 伝 子 増 幅 反 応 がPCR法 で は 最 も 重 要 な 部 分 で あ る が,試 料 の 調 製 も 大 切 な 要 素 と な る.殊 に, 二 段 階PCR法 に お い て は2回 のPCR操 作 だ け で も 相 当 に 煩 雑 で あ る の に,そ の 上 に 試 料 の 調 製 に 数 時 間 あ る い は 一 昼 夜 を 費 や す こ と は 実 用 性 の 面 か ら 問 題 で あ る.今 回 検 討 し た 試 料 調 製 法 は 既 報1)3)よ り操 作 が 簡 単 で,30分 程 度 で 済 み,こ の 点 も 長 所 と思 わ れ る. 以 上 の こ と か ら,今 回 検 討 し た 二 段 階PCR法 はM.pneumonine感 染 症 の 診 断 法 と し て 有 用 と 判 断 さ れ る.一 方,高 感 度 で あ る 二 段 階PCR法 は 操 作 中 に お け るM.Pneumonlae遺 伝 子 の 混 入 に よ る 疑 陽 性 結 果 を も た ら す こ とが あ り,こ れ を 回 避 す る た め の 慎 重 な 操 作 が 必 要 で あ る. 文 献 1) 石 田 一雄, 賀 来 満夫: PCRを 用 い た病 原 微 生物 の 検 出, Mycoplasma pneumoniae. 臨床 検 査1993; 37: 139-143.2) Kai M, Kamiya S, Yabe H, Takakura I, Shioz-awa K, OzShioz-awa A : Rapid detection of Myco-plasma pneumoniae in clinical samples by polymerase chain reaction. J Med Microbiol 1993 ; 38 : 166-170.
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by 16S rRNA
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9) 岡 崎 則 男, 明 間 鯉 一 郎, 滝 沢 金 次 郎: 分 離 検 査 に よ るMycoplasma pnezamoniae肺 炎 流 行 の 追 跡. 感 染 症 誌1987; 61: 547-554.
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Lind K : Detection of Mycoplasrna pneurnoniae
in simulated clinical samples by polymerase
chain reaction. APMIS 1989 ; 1046-1048.
11) Wilson K : Preparation
of genomic
DNA
from bacteria. In : Ausubel FM et al, ed.
Cur-rent protocols
in molecular
biology, Green
Publishing Associates and Wiley-Interscience,
New York, 1990 ; 1 : 2.4.1-2.4.2.
12) 輿 水 馨, 小 谷 均: 動 物 マ イ コ プ ラズ マ の分 離 と同定. 日本 細 菌 学会 教 育 委員 会 編, 細 菌 学 技 術 叢 書2, ヒ ト ・動物 お よ び植物 マ イ コプ ラ ズマ の 分 離 と同定, 菜 根 出版, 東 京, 1982: 42-86.
