麹菌を宿主としたダニアレルゲンDer f7の生産にお
けるコドン最適化効果の解析
著者
徳岡 昌文
号
865
発行年
2005
URL
http://hdl.handle.net/10097/16488
氏
名(本籍)
学 位 の 種 類
学 位 記 番 号
学位授与年 月 日
学位授与 の要件
研 究 科 専 攻
学 位 論 文 題 目
と く おか ま さ ふ み徳
岡
昌
文
博
士(農
学)
農
博
第865号
平
成18年3月24日
学 位 規 則 第4条
第1項
該 当
農学研 究 科 生物産 業創 成科 学専 攻
(博士課程)
麹菌 を宿 主 とした ダニ ア レル ゲ ンDerf7の
生 産 にお け る
コ ドン最 適化 効果 の解析
論 文 審 査 委 員
也
一
悦
勝
瞭
敬
味
亦
部
五
勝
阿
授
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教
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助
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査
主
副
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論
文
内
容
要
旨
〈序論〉
麹 菌 は 、 日 本 酒 や 味 噌 、 醤 油 な ど の 製 造 に 不 可 欠 の 微 生 物 で あ り、 日 本 の 食 文 化 に お い て 、主 要 な 役 割 を 果 た して い る一 方 、多 種 類 の 加 水 分 解 酵 素 を 分 泌 す る こ とか ら、 産 業 用 酵 素 の 供 給 微 生 物 と して 重 要 な 地 位 を 担 っ て い る 。 ま た 、 遺 伝 子 工 学 の 発 展 や ゲ ノ ム 解 析 の 成 果 を生 か す こ とで 、 麹 菌 を よ り高 度 に 利 用 し た 新 た な 産 業 の 創 成 が 期 待 さ れ て お り、 活 発 に 研 究 が 行 わ れ て い る 。 本 研 究 室 で は 、 安 全 性 と タ ン パ ク 質 分 泌 能 を 併 せ 持 つ 麹 菌 の 特 徴 を 生 か し 、 ダ ニ ア レ ル ギ ー の 経 口 減 感 作 療 法 に 用 い る た め の ワ ク チ ン 用 タ ン パ ク 質Derf7を 麹 菌 に よ り分 泌 生 産 す る 研 究 を 行 っ て き た 。Derf7 は コ ナ ヒ ョ ウ ダ ニ(De㎜a`qphagofde8faが ηae)由 来 の 機 能 未 知 の 分 泌 タ ン パ ク質 で あ り、 ハ ウ ス ダ ス トァ レル ギ ー 患 者 の50%が 、 抗Derf71gE抗 体 を保 持 す る とい わ れ て い る 。 ア レル ギ ー の 効 果 的 な 治 療 方 法 と して 、 ア レ ル ゲ ン を 治 療 用 抗 原(ワ ク チ ン) と して 用 い る 減 感 作 療 法 が 知 ら れ て お り、 生 産 物 お よ び 菌 体 と も に安 全 で あ る と.認識 さ れ て い る麹 菌 は、 経 口減 感 作 療 法 の た め の ワ ク チ ン の 有 望 な 生 産 宿 主 と して 期 待 さ れ る。 麹 菌 に お け る 異 種 タ ン パ ク 質 生 産 量 改 善 の 戦 略 と し て は 、 これ ま で 強 力 な 発 現 用 プ ロ モ ー タ ー に よ る高 発 現 と 、 自 己 の タ ン パ ク 質 との 融 合 タ ン パ ク 質 と し て 発 現 させ る こ との2点 が 主 と して と られ て き て い る 。 本 研 究 室 で も こ れ ら の 手 法 を 用 い て麹 菌 に よ りDerf7生 産 した が 、 生 産 量 は1mg/1以 下 で あ り、Derf7生 産 の 実 用 化 に は ま だ 大 き な 障 害 が あ る と考 え ら れ た 。 そ こ で 本 研 究 で は 、 麹 菌 を は じ め と す る 糸 状 菌 に お い て 基 礎 的 知 見 が 少 な く、 詳 細 な 解 析 が な ざ れ て こ な か っ た 宿 主 と発 現 遺 伝 子 の 使 用 コ ドン の 偏 り に 着 目 して 、Derf7の コ ド ン使 用 頻 度 を 麹 菌 に 適 合 さ せ る こ と に よ っ て 発 現 量 の 改 善 を 試 み た 。 原 核 生 物 か ら高 等 真 核 生 物 ま で の 多 くの 異 種 タ ン パ ク 質 発 現 系 に お い て 、 コ ドン 最 適 化 の 効 果 に つ い て は報 告 さ れ て お り、 大 腸 菌 に お け る レ ア コ ド ン の 影 響 に つ い て の 基 礎 的 な研 究 等 か ら 、 コ ド ン 最 適 化 は 翻 訳 過 程 の 効 率 化 に よ り、 発 現 量 が 改 善 さ れ る と い う説 明 が 一 般 的 に 受 け 入 れ ら れ て い る 。 しか し宿 主 や 発 現 遺 伝 子 に よ っ て は 、 コ ドン 最 適 化 の 効 果 が 、翻 訳 過 程 以 外 に も影 響 を 与 え る こ とが あ る こ とが 知 られ て お り、 本 研 究 で は基 礎 的 な観 点 か ら、 こ の 点 に つ い て 知 見 を得 る こ と も 目 的 と した 。第 一 章 コ ド ン 最 適 化 遺 伝 子 の 全 合 成 と分 泌 生 産 量 へ の 効 果
コ ド ン最 適 化 を 行 う た め に 、 ま ずDerf7と 麹 菌 の 遺 伝 子 の コ ドン 使 用 頻 度 を比 較 し た 。 麹 菌 の コ ド ン 使 用 頻 度 は 、 デ ー タ ベ ー ス(http:www.kazusa.orjp/codon/)を 参 考 に し て 、Derf7配 列 中 に 存 在 す る麹 菌 に お け る 使 用 頻 度 の 低 い コ ド ン を 使 用 頻 度 の 高 い も の に 置 き 換 え 、 ま た 特 定 の コ ドン の み に 偏 っ た 使 用 を 避 け 、 全 体 的 な コ ドン 使 用 傾 向 を 合 わ せ て 、 コ ド ン最 適 化Derf7遺 伝 子(Derf70pt)を デ ザ イ ン した(TableI)。
Derf7/optの 合 成 に は 、 合 成 オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ドを 用 い た2回 のPCRを 組 み合 わ せ る こ と に よ る 、recursivePCRに よ る方 法 を 用 い た 。 約100ntの オ リ ゴ ヌ ク レオ チ ド 8本 は 、隣 の オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ドと20bpのoverlapし た 領 域 を 持 た せ る こ とで 、PCR 時 に 相 互 に プ ラ イ マ ー と な る よ う に 設 計 した 。1回 目 のPCRは8本 の オ リ ゴ ヌ ク レ オ チ ドを す べ て 用 い て 行 い 、 得 られ たPCR産 物 を2回 目 のPCRの 鋳 型 と して 用 い た 。 2回 目 のPCRで は 両 末 端 の オ リ ゴ ヌ ク レオ チ ドの み を 用 い たPCRを 行 う こ とで 、 目 的 とす る約650bpのPcR産 物 が 得 られ た(Fig.1)。 こ のPcR産 物 をTAク ロー ニ ン グ し塩 基 配 列 を 決 定 す る こ と に よ り 、15ク ロ ー ン の 中 か ら デ ザ イ ン通 り の 塩 基 配 列 を 持 つ1ク ロ ー ン を 得 る こ とが で き た 。 麹 菌 で の 発 現 コ ン ス ト ラ ク ト と して 、 ま ずDerf7自 身 の シ グ ナ ル 配 列 に よ り分 泌 す る コ ン ス ト ラ ク トを 作 製 し た 。 麹 菌 形 質 転 換 ペ ク タ ー と して 、 麹 菌 の グ ル コ ア ミ ラ ー ゼ プ ロ モ ー タ ー の 改 変 プ ロ モ ー タ ー で あ るPglaAl42の 下 流 に マ ル チ ク ロ ー ニ ン グ サ イ トを も ち 、 硝 酸 塩 資 化 性 を指 標 と した 選 抜 が で き る ηfaDマ ー カ ー を 持 つpNGAl42 を用 い た 。 プ ロモ ー タ ー の 下 流 に ネ イ テ ィ ブ な コ ド ン を 持 っDerf7遺 伝 子 、 ま た は コ ド ン を 最 適 化 したDerf7遺 伝 子 を連 結 した 発 現 ベ ク タ ー を 作 製 し、NS4株 を親 株 と し て そ れ ぞ れ に つ い て 形 質 転 換 体 を 取 得 し、 こ れ をDer/ntv、Der/optと した 。 両 コ ン ス トラ ク トを液 体 培 養 し培 養 上 清 に つ い て 、Derf7抗 体 に よ りWestern解 析 を行 っ た と こ ろ 、Derf7分 泌 量 はDer/ntvで は 検 出 で き な い ほ ど の 低 レ ベ ル で あ っ た が 、Der/opt 株 に お い て は 検 出 可 能 な レ ベ ル に ま で 増 加 して お り 、 コ ドン 最 適 化 が 分 泌 量 改 善 に 効 果 的 で あ る こ とが 示 さ れ た(Fig.3)。 麹 菌 に お け る 異 種 タ ン パ ク 質 生 産 に は 、 目 的 タ ン パ ク質 を 宿 主 自 身 が 高 分 泌 す る タ ン パ ク 質 との 融 合 タ ン パ ク 質 と し て 発 現 さ せ る こ とが 有 効 で あ る こ とか ら、 コ ドン 最 適 化 を 行 う こ とで さ ら に 分 泌 量 の 改 善 が 可 能 で あ る か 調 べ た 。 本 研 究 で は 、 グ ル コ ア ミ ラ ー ゼ の 触 媒 ドメ イ ン を キ ャ リ ア タ ンパ ク 質 と し て 、 そ の 下 流 に成 熟 型Derf7を 連
結 し た 融 合 タ ン パ ク 質 を 作 製 し た 。 融 合 タ ンパ ク 質 は、 分 泌 さ れ る 際 に キ ャ リ ア タ ン パ ク質 か ら成 熟 型Derf7が 分 離 され る よ うに 、 キ ャ リ ァ タ ン パ ク質 とDerf7を 連 結 す る リ ン カ ー 領 域 の 直 後 に 、 ゴ ル ジ 体 の プ ロ セ シ ン グ プ ロ テ ァ ー ゼ で あ るKEX2の 切 断 配 列 を 導 入 した(Fig.2)。 この よ う に して 構 築 したGlaDer/ntvとGlaDer/opを 麹 菌 宿 主 に 導 入 し、 取 得 した 形 質 転 換 体 のDerf7分 泌 量 をWestern解 析 に よ り調 べ た と こ ろ 、 両 株 に お い て キ ャ リ ア タ ンパ ク質 と成 熟 型Derf7が 分 泌 され て い た が 、 コ ドン 最 適 化 を し た コ ン ス トラ ク トで はDerf7分 泌 量 が3倍 以 上 に増 加 して い た 。 ま た 、 濃 縮 し た培 養 上 清 のSDS-PAGEのCBB染 色 に よ り、 コ ドン最 適 化 した もの で は25kDa 付 近 にDerf7に 相 当 す るバ ン ドが 確 認 され た こ とか ら 、 融 合 ターンパ ク質 と して 発 現 さ せ る こ と に よ る効 果 と あ わ せ る こ とで 、 高 い生 産 性 が 得 られ る こ とが 分 か っ た(Fig.3)。 非 融 合 型 、 融 合 型 発 現 コ ン ス ト ラ ク ト に お い て 、 コ ド ン最 適 化 が 分 泌 量 改 善 に効 果 を もた ら し た 理 由 を 調 べ る た め に 、 転 写 産 物 量 をReal-timePCRに よ り解 析 し た と こ
ろ、Derf7mRNA量 に 差 が 生 じ て い た(Fig.4)。 以 上 の 結 果 か ら、麹 菌 に お け るDerf7 生 産 に お い て 、 コ ドン の 最 適 化 は 、 転 写 産 物 量 の 増 加 を も た ら す こ と に よ っ て 目 的 の Derf7分 泌 量 の 増 加 に つ な が っ た も の と考 え ら れ た 。 第 二 章 転 写 産 物 量 の 比 較 と部 分 的 コ ド ン 最 適 化 の 効 果 翻 訳 過 程 に 関 与 す る コ ド ン を 最 適 化 す る こ とが 、 転 写 産 物 量 に 影 響 す る と い う現 象 は これ ま で も い くつ か 報 告 さ れ て い る も の の 、 そ の 理 由 は ま だ 分 か っ て い な い 。 そ こ で 第 二 章 で は 、 コ ドン の 最 適 化 に よ り、 転 写 産 物 量 が 増 加 す る 理 由 を 解 明 す る こ と を 目 的 と して 研 究 を 進 め た 。 コ ド ン最 適 化 に 関 す る 研 究 が 進 ん で い る 大 腸 菌 に お い て 、 遺 伝 子 の51側 に あ る レ ア コ ド ン が そ の 遺 伝 子 の 発 現 量 に 大 き く影 響 す る とい う こ とが 報 告 さ れ て い る こ と か ら 、 Derf7に お い て 、 遺 伝 子 の 前 半 の み の コ ドン を 最 適 化 した コ ン ス トラ ク ト(Der/opト ntv)と 、 遺 伝 子 の 後 半 部 分 の み の コ ド ン を 最 適 化 した コ ン ス トラ ク ト(Der/ntv-opt) を 作 製 して(Fig.5)、 そ の 分 泌 量 お よ び 転 写 産 物 量 に 及 ぼ す 効 果 を 調 べ た 。 培 養 上 清 の ウ ェ ス タ ン 解 析 の 結 果 、 大 腸 菌 で 報 告 さ れ て い る結 果 と は 逆 に 、 遺 伝 子 後 半 部 分 の コ ド ン 最 適 化 が 全 体 の 最 適 化 と同 様 の 分 泌 量 の 改 善 を もた らす こ とが 分 か っ た(Fig.6)。 ま た 、 転 写 産 物 量 に も差 が 生 じ て い た こ とか ら(Fig.7)、 全 体 の コ ドン 最 適 化 と同 様 の 効 果 が 遺 伝 子 の 後 半 部 分 の コ ド ン最 適 化 で 得 られ た こ とが 示 唆 さ れ た 。mRNAの 二 次
構 造 予 測 か ら は 各mRNAの 間 に 熱 力 学 的 な 安 定 性 や 特 徴 的 な 構 造 な ど の 差 が 見 出 せ な か っ た こ とか ら 、 ネ イ テ ィ ブ な コ ドン を もつ 配 列 の 後 半 部 分 の 配 列 に が 、 転 写 産 物 量 の 減 少 を もた らす 配 列 が 存 在 す る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 そ こで 、 さ ら に 部 分 的 な コ ド ン 最 適 化 を 試 み た 。 全 合 成 に 用 い た プ ラ イ マ ー を 利 用 し 、 部 分 配 列 の コ ドン 最 適 化 コ ン ス ト ラ ク ト(Fig.8)を 作 成 し た が 、 す べ て の コ ン ス ト ラ ク トに お い て 培 養 上 清 中 にDerf7は 分 泌 さ れ ず 、 ま た ノ ー ザ ン解 析 を 行 っ た と こ ろ 、 い ず れ の コ ン ス ト ラ ク トもDer/ntv-optと 比 較 す る とmRNAレ ペ ル は低 か っ た(Fig. 9)。 しか し、 一 部 の ク ロ ー ン で 、 低 分 子 の シ グ ナ ル が 検 出 さ れ た こ とか ら、 正 常 な 転 写 産 物 が 合 成 さ れ て い る か 調 べ る た め に 、3'一RACEを 行 い 、RT-PCR産 物 の 断 片 長 を 比 較 した(Fig.10)。 そ の 結 果 、mRNA量 が 多 い コ ン ス ト ラ ク トで は 、 転 写 産 物 の 断 片 の 長 さ が 均 一 で あ っ た の に 対 し、mRNA量 が 少 な い コ ン ス トラ ク トで は 、 断 片 の 長 さ に ば ら つ き が あ っ た 。 そ こ で 一 部 の ク ロ ー ン の 配 列 を 調 べ た と こ ろ 、Der/optに お い て は 終 止 コ ド ン か ら約60bp下 流 の タ ー ミネ ー タ ー 領 域 でpoly(A)が 付 加 さ れ て い る の に 対 して 、Der/ntvで はORF内 でpoly(A)付 加 が 起 き て い る ク ロ ー ン が 数 多 く見 出 さ れ た(Fig.11)。 こ のpoly(A)付 加 はDer/ntv配 列 の 後 半 全 体 で 生 じ て い た 。 終 止 コ ド ン を 含 ま な いnonstopmRNAを 異 常 転 写 産 物 と して 積 極 的 に 分 解 す る機 構 と して 、 nonstopmRNAdegrada廿on経 路 の 存 在 が 最 近 見 出 さ れ(Fig.12)、nonstopmRNAは
半 減 期 が 非 常 に 短 くな る こ とが 知 られ て い る。 そ こで 、Der/ntv配 列 のmRNA量 の 減 少 は 、ORF内 で のpoly(A)付 加 に よ るnonstopr畝NA分 解 が 原 因 で あ る と考 え 、 これ を 裏 付 け る た め の 実 験 を 行 っ た 。 ま ず 、nonstopmRNAの 分 解 過 程 は翻 訳 と共 役 して お り、poly(A)付 加 配 列 の 上 流 に 終 止 コ ドン を 導 入 す る こ と で 、nonstopmRNA分 解 は 抑 制 さ れ る こ とが 知 られ て い る こ と か ら 、 融 合 型 コ ン ス ト ラ ク トのGlaDe∀ntvの 変 異 体 で 、 フ レ ー ム シ フ トに よ りDerf7配 列 の51側 末 端8ア ミノ 酸 目 に 終 止 コ ドン が 現 れ る コ ン ス トラ ク トに お け るmRNA量 をGlaDer/ntvと 比 較 した 。 ノ ー ザ ン 解 析 の 結 果 、mRNA量 は 終 止 コ ドン が 導 入 さ れ る こ とで 、3倍 程 度 増 加 した(Fig.13)。 し た が っ て 、Der/ntvに お い て はORF内 でpoly(A)付 加 を 受 け たmRNA分 子 がnonstop mRNA分 解 経 路 に よ る分 解 を受 け て い る こ とが 示 唆 さ れ た 。
以 上 か ら、Der/ntvのDerf7配 列 に はpoly(A)付 加 シ グ ナ ル と し て 機 能 し得 る複 数 の 配 列 が 存 在 す る こ とで 、nonstopmRNAが 合 成 さ れ 、mRNAが 蓄 積 し に くい の に 対 し、Der/optで は 、 コ ド ン 最 適 化 に よ り結 果 的 に そ れ ら の 潜 在 的 配 列 が 除 去 さ れ た
こ とで 、RNA量 の 増 加 と生 産 量 の 改 善 に つ な が っ た もの と推 定 され た 。 第 三 章 コ ド ン 最 適 化 遺 伝 子 を 用 い た 高 発 現 株 お よ び プ ロ テ ア ー ゼ 遺 伝 子 破 壊 株 に よ るDerf7の 分 泌 生 産 第 一 章 の 結 果 、GlaDer/optのDerf7生 産 性 が 最 も 高 い こ とが 判 明 した こ とか ら、 融 合 型 コ ンス ト ラ ク トを 多 コ ピ ー 導 入 したDerf7高 生 産 株 を 作 製 して 、 高 分 泌 生 産 を 試 み た 。 選 択 マ 「 カ ー をn∫aDか ら多 コ ピー 導 入 が 可 能 な硫 酸 塩 資 化 関 連 遺 伝 子5Cに 置 き換 え た 形 質 転 換 ベ ク タ ー(Fig.14)を 作 製 して 、 麹 菌NS4株 の 形 質 転 換 を行 っ た 。 得 られ た 高 発 現 株SGlaDer株 で は 、 高 発 現 用 ベ ク タ ー 中 の プ ロ モ ー タ ー に 多 コ ピー 挿 入 され て い る シ ス エ レ メ ン トのdtration効 果 に よ り、 麹 菌 で 最 も 分 泌 量 の 多 い タ ンパ ク 質 で あ る α ・ア ミ ラ ー ゼ の 生 産 量 が 著 し く低 下 し 、 目 的 の タ ン パ ク 質 の 割 合 が 高 くな っ て い た(Fig.15)。 ま た 、 分 泌 さ れ たDerf7のN末 端 解 析 を 行 っ た と こ ろ、Derf7が デ ザ イ ン ど お り にKEX2の 断 配 列 で グ ル コ ア ミ ラ ー ゼ と切 り離 さ れ て 成 熟 型 タ ンパ ク 質 と し て 培 養 上 清 に 分 泌 さ れ て い た(Fig.16)。 麹 菌 の 分 泌 タ ン パ ク 質 は 等 電 点 が 酸 性 の もの が 多 い こ とが 知 られ て お り、pH5.0で の 陽 イ オ ン交 換 カ ラ ム(ResourceS)を 用 い た イ オ ン交 換 ク ロ マ トグ ラ フ ィ ー を 行 う こ と に よ り、 培 養 上 清 か ら一 段 階 の 精 製 に よ り部 分 精 製Derf7が 取 得 で き た 。 こ の 部 分 精 製Derf7を 用 い て 、 取 得 した 各Derf7 発 現 株 のDerf7生 産 量 を 定 量 した と こ ろ 、・高 発 現 株 で は約30mg/1の 生 産 量 を示 す こ と が わ か っ た(Fig.17)。 こ の 生 産 量 は 、 瑠pe瑠 伽8属 糸 状 菌 の 野 生 株 を宿 主 と し た 異 種 タ ン パ ク 質 生 産 量 と して 報 告 さ れ て い る も の の 中 で は 最 高 レ ベ ル で あ っ た 。 し か し、 培 地 中 のDerf7及 び キ ャ リ ァ タ ン パ ク質 で あ る グ ル コ ァ ミ ラ ー ゼ の 経 時 変 化 を 調 べ た と こ ろ 、 グ ル コ ア ミ ラ ー ゼ は 安 定 に 存 在 す る に も か か わ ら ず 、Derf7は 減 少 して い くこ とが 観 察 され た(Fig.18)。 した が っ て 、Derf7はKEX2に よ っ て キ ャ リ ア タ ン パ ク 質 と切 断 さ れ た 以 降 の 過 程 で 、 麹 菌 の プ ロ テ ア ー ゼ に よ り分 解 を 受 け る もの と考 え られ た 。 そ こ で 、 ゲ ノ ム 解 析 情 報 を も と に 最 近 明 ら か に さ れ た 菌 体 外 プ ロ テ ア ー ゼ 遺 伝 子 の 転 写 因 子 と考 え ら れ るpπR、 お よ び 出 芽 酵 母 に お い て 異 種 タ ン パ ク 質 の 分 解 に か か わ っ て い る こ とが 報 告 さ れ て い る液 胞 プ ロ テ ア ー ゼ 遺 伝 子 で あ るPEP4の 相 同 遺 伝 子 で あ るPβpEを 破 壊 した 宿 主 を 用 い て 、Derf7高 発 現 を 試 み た が 、 そ れ ぞ れ 単 独 の破 壊 株 で は 顕 著 な 生 産 量 の 増 加 は 見 られ な か っ た(Fig.19)。 そ こ で 、 さ ら にpoρE
及 びp溜 の2重 遺 伝 子 破 壊 株 を宿 主 と したDerf7生 産 を試 み た と こ ろ 、 野 生 株 を 宿 主 と し た 発 現 株 と比 較 し、 培 養24時 間 に お い てDerf7生 産 量 が 約2倍 増 加 して い た (Fig.20)。 こ れ ら の 株 は サ ザ ン解 析 に よ りDerf7発 現 カ セ ッ トを1コ ピ ー 導 入 さ れ て い る こ と を 確 認 し て い る こ とか ら、pβρEとprtRの 両 遺 伝 子 の破 壊 はDerf7の 生 産 量 改 善 に 効 果 が あ る こ とが 示 唆 さ れ た 。 総 括 (1)麹 菌 に お い て コ ド ン最 適 化 は 異 種 タ ン パ ク質 生 産 量 の 改 善 に 効 果 的 で あ り、 融 合 タ ン パ ク 質 と して の 発 現 と組 み 合 わせ る こ とで 高 生 産 が 可 能 に な る こ と を 示 した 。 (2)コ ドン 最 適 化 効 果 は 転 写 量 の 増 加 を 介 した 分 泌 量 の 改 善 で あ っ た 。 (3)コ ド ン を 最 適 化 し な いDerf7配 列 に は 、poly(A)付 加 シ グ ナ ル と し て 機 能 し得 る 配 列 が 複 数 存 在 す る 可 能 性 が あ り、 コ ド ン最 適 化 効 果 は 、 そ れ ら の 配 列 が 除 か れ た こ と に よ る効 果 で あ る と考 え られ た 。
(4)ORF内 で のpoly(A)付 加 は、nonstopmRNA分 解 経 路 に よ る積 極 的 な 分 解 と そ れ に伴 う転 写 産 物 量 の 減 少 を 引 き 起 こ す も の と考 え ら れ 、 異 種 タ ンパ ク 質 発 現 に お い て は 、 潜 在 的 なpoly(A)付 加 シ グ ナ ル に よ りス ト ッ プ コ ドン の な い 不 完 全 なmRNAが 合 成 さ れ る こ と に よ る転 写 産 物 の 分 解 を 回 避 す る こ とが 重 要 で あ る と考 え られ た 。 (5)コ ドン 最 適 化Derf7遺 伝 子 と キ ャ リ ア タ ン パ ク 質 との 融 合 遺 伝 子 を 高 発 現 用 プ ロ モ ー タ ー に よ り高 発 現 さ せ 、 さ ら に 多 コ ピ ー 化 す る こ と に よ っ て 、A5pe㎎ π1u5属 糸 状 菌 の 野 生 株 を 宿 主 と し た 異 種 タ ン パ ク 質 生 産 量 と し て 、 これ ま で 報 告 さ れ て い る 中 で 最 も高 い 生 産 量 を 達 成 す る こ とが で き た 。 (6)プ ロ テ ァ ー ゼ 生 産 に 関 与 す る転 写 因 子 と液 胞 プ ロ テ ァ ー ゼ の 遺 伝 子 破 壊 が 、 異 種 タ ン パ ク 質 生 産 量 の 改 善 に効 果 的 で あ る こ と を 示 し た 。
原 著 論 文 TokuokaM.,OnoK.,TakagiS.,GomiK.Codonoptimizationimprovesmite allergenDerf7productioninAspergillusoryzae. (4ρ1ρ1.雌cmわfo1.研ofθchη01.投 稿 予 定)
TokuokaM.,OnoK.,TakagiS.,GomiK.High-levelsecretionofcodon-optimized
miteallergenDerf?inAspergillusoryzae.
(Manuscriptinpreparation)
参 考 文 献 幸 田 明 生 、 徳 岡 昌 文 、 五 味 勝 也:転 写 後 過 程 の 改 良 に よ る 異 種 タ ン パ ク 質 生 産 の 効 率 化 一 カ ビ の バ イ オ テ ク ノ ロ ジ ー の 新 展 開 ⑤,バ イ オ サ イ エ ン ス とイ ン ダ ス ト リー,63, 543-546(2005)aminocodonA.oryzae(96ｰ)Derf-(%) acidNativeOptimized
メしoり ぞaθ で%o)Derπ(%) NativeOpti耐zed AtaGCT GCA GCC GCG ArgAGA AGG CGA CGC CGG CGT AsnAAC AAT AspGAT GAC ⊂y5丁GC TGT GinCAA CAG GIuGAA GAG GIyGGA GGC GGG GGT HisCAC CAT lleATA ATC ATT LeuCTA CTC CTG 2 7 5 ② 6 1 4 3 9 2 9 9 8 8 2 8 2 8 8 4 3 6 3 2 9 5 5 6 1 5 1 1 26 鍋 35 欝 3 3 5 13 5 10 12 31 27 32 5 6 13 25 19 33 15 29 7 27 12 9 2 鈎 17 5 23 坦 7 9 8 ② 0 0 4 ② の 9 4 9 4 5 ② 0 8 0 5 9 5 5 の 7 9 8 9 3 5 0 0 ② 4 1 2 1 1 1 1 8 0 2 6 ② 0 ② 4 の 2 0 2 6 7 ② 7 ② の 0 ⑦ 4 0 9 4 9 2 6 0 ② 9 9 8 7 ⑦ 4 0 2 8 9 0 の 8 の 8 3 4 4 1 1 1 1 3 5 ② 1 2 4 1 4 2 の 7 2 2 2 Lys 醍et Phe Pro Ser 羽1r Trp Tyr Val STOP
α
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Z 8 8 1 2 3 1 6 1 4 9 1 2 2 7 2 9 1 6 6 6 6 5 4 7 ・ 9 ・ ・ ⋮ ● ・ ・ ・ ・ ・ ⋮ . ・ ・ . . . ・ ・ ⋮ 3 4 ② 8 9 6 9 0 8 の 5 6 7 7 3 3 6 0 9 0 6 5 4 Z 4 8 5 7 1 の 0 1 ら ﹁4 1 1 も 3 1 屯 ) ﹂ -‡ ← 1 6 1 亀-幽 2 1 1 1 2 1 1 1 2 1 2 1 1 4 4 1 5 5 7 9 8 3 0 ② 5 0 0 5 9 4 4 4 3 ② 4 の 4 9 3 3 9 7 4 0 0 1 1 5 6 0 3 1 2 2 0 0 0 1 1 1 2 0 0 0 2 Z O 3 ② 4 0 4 の ② 7 7 0 の 3 0 5 の 0 0 4 4 4 0 7 0 4 ② 4 の 0 6 9 7 4 0 0 1 1 7 3 4 2 0 1 1 1 3 0 1 4 ② 3 0 Table1コ ド ン 使 用 頻 度 の 比 較 麹 菌 の コ ドン 使 用 頻 度 は か ず さDNA研 究 所 の デ ー タ ベ ー ス(http:www.kazusa.or.lp/codorの を 参 考 し に し た 。 primerlprimer3prime_r5primer?→ → → →編 …瀟4P編,,濡kb
↓1・PCR 1 4 PO 3 9 6 2P面mer1L
=一
≡≡≡二2.0
F-p rimer80.51
2"dPCR 642byDerf71st2nd
● 卿
Directconstruct(Der/ntv(opt))
KEX2吻
↓
TA-cloning&Sequencing cleavagesite Derf7 GlucoamylasecatalyticdomainFusionconstruct(GlaDer/ntv(opt))
Fig.1recursive-PCRに よ るDerf7cDNAの 全 合 成 PCR反 応 は1回 目は 各 オ リゴ ヌ ク レオ チ ドを100pmol含 む 反 応 系 で 94℃30秒 、60℃30秒 、72℃30秒 で30サ イ クル 行 った 。2回 目のPCR は 鋳 型 と して1回 目 のPCR産 物1国 用 い て 末 端 の プ ラ イ マ ー を100 pmol含 む 反応 系 で 行 った 。 電 気 泳 動 は各PCR産 物 を1μ1泳 動 した 。 Fig.2非 融 合 型 と 融 合 型 に よ る Derf7発 現 コ ン ス トラ ク トkDa
み
鋭
メノノ
酪
覗
2 12121212癬鍵
ク マ シー染 色A
B
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ウ ェス タ ン解 析 Fig.3各 形 質 転 換 体 の培 養 上 清 のSDS-PAGE解 析各 株 をYPM培 地(yeastexけad1%,peptone2%,mal量ose2%)で24時 間 培 養 し た 培 養 上 清 をTCA沈 殿 に よ り5倍 澱 縮 し15μ1を泳 動 し 、12.5%のSDS一 ポ リ ア ク リル ア ミ ドゲ ル で 電 気 泳 動 した 。 ウ ェ ス タ ン 解 析 は 抗Derf7抗 体 を 用 い た 。 矢 印A;キ ャ リ ア タ ンパ ク 質 、B;Derf7
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量 native lDerlntv DedntyDer/optGlaDer/ntvGlaDer/opt Fig.4Rea団mePCR解 析 に よ るDerf7mRNA量 の 比 較 各 形 質転 換 体 をYPM培 地 にて20時 間 培 養 し菌 体 よ りRNAを 抽 出 しReve【set旧nsc巾taseに よ り逆 転 写 を行 い合 成 したcDNA ・に対 し特 異 的 プ ライ マ ー を用 いた 定 量PCRを 行 った 。 viiiiii optimizednative講
331EcoRVsite Der/opt-ntv Der/ntv-opt Fig.5部 分 最 適 化Derf7遺 伝 子 の 構 造kDa 5 0 7 ` 7 8 ﹁ 0 3
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Fig.6形 質 転 換 体 の ウ ェ ス タ ン 解 析 各 株 をYPM培 地(yeastextrad1%,peptone2%, maltose2%)で24時 間 培 養 した培 養 上 清 をTCA沈 殿 に よ り5倍 濃 縮 し15国 を泳 動 し、12.5%のSD$ポ リ ア ク リル ア ミ ドゲ ル で 電 気泳 動 した 。 ウ ェ ス タ ン解 析 は抗Derf7抗 体 を用 いた 。鷺
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Fig.7部 分 最 適 化 株 の ノ ー ザ ン 解 析 各 形 質転 換体 をYPM培 地 にて20時 間 培 養 した 菌体 よ りRNAを 抽 出 し、10四 を ホ ル ム ア ミ ドーア ガ ロ ー ス ゲ ル(1.2%) で泳 動 した。 プ ロ ー ブ はDerlntいoptを 鋳 型 と して作 成 した 。 Der56i Der57i L「L圃L「L1 IDer567' 曇「L-L.「 闇L.i「＼ 「「LL■ 竃 臨.「＼「9Lr」M屋 Der58i Der5681 ■「し 「」 鳳L「 墜, 鑑 「唱 「亀・「魍L「 し コ Der67i Der681 1「LL潤L「L1 ■L「LL、 ■LL「L■ Der578` `「 臥「凹 「■L¶ ■』■■Li Der678' Der78 畳「L・「■L「L「 「＼ 「■ L竃 穐 ・「口凶
コ ドン最適化 配列
Fig.8部 分 最 適 化Derf7遺 伝 子 の 構 造ど
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Fig.9部 分 最 適 化 株 の ノ ー ザ ン解 析 各 形 質 転 換 体 をYPM培 地 で20時 間培 養 し菌体 よ りRNAを 抽 出 し約 20μgを 泳 動 した 。 プ ロー ブ はDer/ntvの5'側 半 分 を鋳 型 と して 作 成 した 。' Der/opt Der7n
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Arrowheadsindicate500.by Fig.103'一RACEク ロ ー ン の 挿 入 断 片 長 の 比 較TA-cloningし た3'一RACEのPCR産 物 を εσoRlで 消 化 して 電 気 泳 動 し た 。
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CarrlerDerf71ntv醐 鶏 鍵.一 咋ameshi費 Fig.13perf7上 流 配 列 の ス ト ッ プ コ ド ン に よ るmRNA量 の 変 化GlaDerlntv-stopはGlaDerlntvに お い てKexBに よ る 切 噺 サ イ トの上 流 で2塩 基 の 欠 失 が 生 じる こ とでDerf7の8ア ミ ノ酸 目が ス トッ プ コ ドン とな っ た変 異 ク ロ ー ン。 両 株 をYPM培 地 で20時 間培 養 した 菌 体 よ りRNAを 抽 出 し 20μgを 泳 動 した 。 プ ロー・ブはDerlntvを 鋳 型 に作 成 した 。 Ndd7、0! 記 pSGIaDer 10冶kb T」a郎A 岬 ≧.,,9馳A Amp P軸42P認a3 "扇 。妊47 Fig.14多 コ ピ ー 導 入 型 ベ ク タ ー
kDa12345 97疲 66曇.乏'・諮 繍1 ・ 側 0 0 3 2 クマ シ ー染 色 GLAA catalyticdomain 「 一M。 ・、陀D。 煎 HVKRDPIHYDK ふD6t。m剛,eq、ence Kex2cleavagesite Fig.16融 合 型 発 現 株 の 分 泌Derf7のN末 端 解 析 ウ ェス タ ン解 析 Fig.15取 得 した 形 質 転 換 体5株 の 培 養 上 清 の SDS-PAGE解 析 各 株 をYPM培 地 にお いて24時 間 培 養 し培 養 上 清15μ1を 泳 動 した 。
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30mg/lFig.17部 分 精 製Derf7を 用 い た 各 発 現 株 のDerf7生 産 量 の 定 量
部 分 精 製Derf7を 希 釈 して ス タ ン ダ ー ド溶 液 を作 成 しシ グ ナ ル強 度 をNlHimageに よ り数 値 化 し定 量 した 。
kDa 97 66 42 1 234 5
