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サ イ トメ ガ ロ ウイル ス肺 炎 患者 の血 漿 中 ウイ ル スDNAの
PCR法
に よる検 出 と定 量 化
1)大分医科大学第2内 科,2)長崎大学医療技術短期大学部,3)大分医科大学輸血部 時 松 一 成1)田 代 隆 良2)山 上 由 理 子1)山 崎 透1) 長 岡 博 志1)永 井 寛 之1)橋 本 敦 郎1)後 藤 陽 一 郎1) 佐 分 利 能 生1)菊 地 博3)那 須 勝1) (平成7年5月1日 受 付) (平成7年6月13日 受 理)Key words : PCR, cytomegalovirus, cytomegalovirus pneumonia, immunocompromised patient
要 旨
病 理 組 織 学 的 に 確 認 さ れ た サ イ トメ ガ ロ ウ イ ル ス(CMV)肺 炎17例,非CMV肺 炎15例 と,健 常 人24 例 の 血 漿 を材 料 と し て,nested polymerase chain reaction (PCR)法 に よ るCMV遺 伝 子 の 検 出 と半 定 量 化 を行 い,CMV肺 炎 の 診 断 お よ び モ ニ タ リ ン グ に お け るPCR法 の有 用 性 に つ い て 検 討 し た. CMV肺 炎 患 者17例 全 例,非CMV肺 炎 患 者15例 中1例 の 血 漿 か らCMVDNAが 検 出 さ れ,健 常 人 で は 全 例 陰 性 で あ っ た.PCR陽 性 の 非CMV肺 炎 患 者 は 成 人T細 胞 白血 病 患 者 で,死 亡2日 前 の 血 漿 よ り CMVDNAが 検 出 さ れ た.血 漿CMVDNAは 入 院 時 は全 例 陰 性 で あ っ た が,肺 炎 発 症 の1∼28日 前(平 均14日 前)に 陽 性 化 し,そ の 時 の 血 漿CMVDNA量 は103∼105コ ピ ー/ml(平 均104.0コ ピ ー/ml)だ っ た. CMV肺 炎 発 症 時 に は104∼106コ ピ ー/ml(平 均105.3コ ピ ー/ml)と 増 加 し,抗 ウ イ ル ス 剤 治 療 に反 応 した 患 者 で は臨 床 症 状 の 改 善 と共 に 減 少 し て い た. 血 漿 中 のCMVDNAは 肺 炎 発 症 前 に 出 現 し,そ のDNA量 は病 勢 と相 関 し て い た こ と よ り,血 漿PCR 法 は易 感 染 性 宿 主 に お け るCMV肺 炎 の 診 断 と モ ニ タ リ ン グ に有 用 で あ る と思 わ れ た. 序 文 サ イ トメ ガ ロ ウ イル ス(CMV)は,日 本 人 成 人 の95%以 上 が 抗 体 を有 して い る ご くあ りふ れ た ウ イ ル ス で あ る1).初 感 染 の後,潜 伏 感 染 し,様 々 な 要 因 に よ り再 活 性 化 され るが,健 常 人 で は初 感 染 時,回 帰 感 染 時,あ るい は再 感 染 時 で も不 顕 性 で あ り,臨 床 的 に問 題 とな る こ とは ほ とん どな い. しか し,AIDS患 者2)や成 人T細 胞 白血 病(ATL) 患 者3),骨 髄 ・臓 器 移 植 患 者4)5)などの 易 感 染 性 宿 主 で は全 身性 にCMVに よ る巨 細 胞 封 入 体 症 を発 症 し,特 に 間 質 性 肺 炎 は し ば しば致 死 的 な経 過 を と る た め,そ の 早 期 診 断 法 と抗 ウ イ ル ス 剤 の 治 療 効 果 を 的確 に評 価 す るモ ニ タ リ ング 法 の 確 立 が 急 務 とな っ て い る.
Polyrnerase chain reaction (PCR)法 は特 異 性 の高 い迅 速 診 断 法 で あ るが,極 め て 感 度 が 高 い た め,PCR法 に よ る 末 梢 血 白 血 球 か ら のCMV DNAの 検 出 が 必 ず し も顕 性 のCMV感 染 症 を意 味 しな い とい う問題 点 を有 して い る5)∼8). 本 研 究 で は,nestedPCR法 に よ り血 漿 か ら の ウ イ ル スDNAの 検 出 を行 い,そ の 臨 床 的 意 義 に つ い て検 討 し た. 材 料 と方 法 1.患 者 対 象 はCMV肺 炎 患 者17例,非CMV感 染 症 患 別 刷 請 求 先:(〒879-55)大 分 県大 分郡 挟 間 町 大 ケ丘 1-1 大 分 医科 大 学 第2内 科 時 松 一 成
Table 1 Characteristics of study subjects by PCR assay
*ATL=adult T -cell leukemia
, LC=lung cancer, NHL=non Hodgikin's lymphoma, MH=malignant histocytosis, NS=nephrotic syndrome, IPF=idiopathic pulmonary fibrosis.
者15例 と健 常 人24例 で あ り,全 例 補 体 結 合 反 応 法 に よ るCMV抗 体 は 陽 性 で あ っ た(Table1). CMV肺 炎 患 者 とは,(1)臨 床 的 お よ び レ ン トゲ ン 学 的 に問 質 性 肺 炎 の所 見 が あ り,(2)病 理 組 織 学 的 に 明 瞭 な ハ ロー で 囲 まれ た"owl eye"と 呼 ば れ る 大 型 の 好 塩 基 性 核 内封 入 体 が 認 め られ,そ の封 入 体 が,(3)CMV初 期 抗 原 に対 す る モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 用 い た 免 疫 染 色 陽 性 の 症 例 で あ る9).非 CMV感 染 症 患 者 と は,剖 検 が行 わ れ,全 て の 臓 器 に お い てCMV感 染 細 胞 を認 め な い易 感 染 性 宿 主 (ATL患 者 と抗 癌 剤 投 与 後 の肺 癌 患 者)で あ る. CMV肺 炎 の発 症 日 は 抗 生 物 質 投 与 に反 応 し な い発 熱 が あ り,急 激 に呼 吸 困 難 が 出現,あ る い は 動 脈 血 酸 素 分 圧 が 低 下 した 日,ま た は胸 部 レ ン ト ゲ ン写 真 に び まん性 問 質 性 陰影 が 出 現 した 日 とし た. 2. 血 漿 検 体 の 調 整. 患 者 群 か ら入 院 中 約1週 間 隔 に てEDTA加 末 梢 血 液 を採 血 し,800×9に て30分 遠 心 して血 漿 を 分 離 後,0.22μmの フ ィル タ ー(Millipor社)に て 濾 過 した後,-70℃ に て保 存 した. 血 漿 中 のDNAはIshigakiら10)の 方 法 に よ り 抽 出 した.即 ち,血 漿100μ1に 抽 出 緩 衝 液(100mM KC1,20mMTris HC1(pH8.3),5mMMgCl2, 0.2mg/mlgelatin,0.9%Tween20,60μg/ml proteinaseK(SigmaChemical社))100μ1を 加 え,55℃ で1時 間 反 応 さ せ た.そ の 後proteinase Kを10分 間 の 煮 沸 処 理 に て 失 活 さ せ,12,000×g, 10分 の 遠 心,そ の 上 清 をPCR検 体 と し た. 3. NestedPCR法 検 体 中 のCMVDNAの 増 幅 は,2セ ッ トの プ ラ イ マ ー を 用 い たnestedPCR法 に よ り行 っ た. 外 側 プ ラ イ マ ー はCMV前 初 期 抗 原 遺 伝 子1(IE-1)の435bpを 増 幅 す る よ う に11),内 側 プ ラ イ マ ー は さ ら に 内 側 の159bpを 増 幅 す る よ う に12)設 定 し た. PCR反 応 液 の 組 成 は,50mMKC1,10mM
Tris-HC1(pH8.8),1.5mMMgC12,TritonX-100,400μMdNTPと1unit Taq DNA
polymer-ase(和 光 純 薬 社)と し,singlePCR段 階 で は 各 50pmoleの 外 側 プ ラ イ マ ー とPCR検 体5μlを 加 え て 全 量 を50μ1と し た.自 動thermalcycler(岩 城 硝 子 社)を 用 い て,熱 変 成94℃1分,ア ニ ー リ ン グ55℃2分,伸 長 反 応 を72℃2分 で に よ り35回 のDNA増 幅 反 応 を 行 っ た.NestedPCR段 階 で は,各50pmoleの 内 側 プ ラ イ マ ー とsinglePCR 増 幅 産 物5μlを 新 し い 反 応 液 に 加 え,上 記 の 方 法 に て35回 の 増 幅 反 応 を 行 っ た. PCR産 物 は エ チ ジ ウ ム ブ ロ マ イ ド を 含 む4% ア ガ ロ ー ス ゲ ル で 電 気 泳 動 し,紫 外 線 下 で 写 真 撮 感染症学雑誌 第69巻 第9号
血 漿PCR法 に よ るCMVDNAの 検 出 965
Fig. 1 Sensitivity of PCR assay. Serial dilutions of plasmid DNA containing the immediate-early antigen gene 1 of CMV were amplified by single PCR and nested PCR. Lane 1, 700fg; lane 2, 70fg; lane 3, 7fg; lane 4, 0.7fg; lane 5, 0.07 fg ; lane 6, 0.007fg; lane 7, 0.0007fg; lane 8, negative control; lane M, DNA molecular size marker (1,174/Hae III digest).
影 を行 い,増 幅 の 有 無 を 確 認 し た. 4.NestedPCR法 の 感 度 の 検 討 と 血 漿CMV DNAの 半 定 量 化 CMVのIE-1を 含 む プ ラ ス ミ ド溶 液 を 作 成 し, 吸 光 度 よ り プ ラ ス ミ ド溶 液 のDNA濃 度 を 測 定 し た 。 こ の プ ラ ス ミ ド溶 液 をCMV抗 体 陰 性 の 血 漿 で 段 階 希 釈 し,nestedPCR法 を 行 い そ の 感 度 を 検 討 し た. こ のnestedPCR法 の 感 度 を 基 に し て 血 漿 中 の CMVDNAの 半 定 量 化 を 行 っ た.即 ち,血 漿 検 体 を 滅 菌 蒸 留 水 に て10段 階 に 希 釈 し,nestedPCR に よ り検 出 可 能 な 最 終 希 釈 段 階 を求 め た.こ の 最 終 希 釈 段 階 よ り血 漿1m1あ た り のCMVDNAの コ ピ ー 数 を 算 出 し た.DNAの コ ピ ー 数 は,プ ラ ス ミ ド の 分 子 量 よ り算 出 し た. 成 績 1.NestedPCR法 の 感 度 SinglePCR法 で はCMVのIE-1は7.0fgま で 検 出 さ れ た.NestedPCR法 で は0.007fgま で 検 出 可 能 で あ り,singlePCRに く ら べ 約1,000倍 の 高 い 感 度 で あ っ た(Fig.1).本 条 件 下 で はnested PCR法 に よ り血 漿1mlあ た り 最 小 限103コ ピ ー の CMVDNAを 測 定 す る こ と が で き た. 2.血 漿 か ら のCMVDNAの 検 出 CMV肺 炎 患 者 で は17例 全 例,非CMV肺 炎 患 者 で は15例 中1例 の 血 漿 中 か らCMVDNAが 検
Table 2 CMV DNA in plasma in correlation with CMV pneumonia
*CMV DNA was detected by nested PCR. **CMV DNA became positive 2 days before death .
出 さ れ た.非CMV肺 炎 患 者 に お け るPCR陽1生 の1例 はATL患 者 で,死 亡 直 前(2日 前)の 血 漿 よ りCMVDNAが 検 出 さ れ た が,剖 検 に よ る 病 理 組 織 学 的 検 査 で は 活 動 性 のCMV感 染 症 は 認 め ら れ な か っ た.ま た 健 常 人24例 全 て に お い て 血 漿 中 にCMVDNAは 検 出 さ れ な か っ た(Table 2). 3.血 漿CMVDNA検 出 時 期 血 漿 中CMVDNAは 入 院 時 に は 全 例 陰 性 だ っ た が,16例 で 肺 炎 発 症 の28日 前 か ら1日(発 症 前 平 均!4日)前 に,1例(症 例11)で 肺 炎 発 症3日 後 に 血 漿PCRが 陽 転 し た(Fig.2). 4.血 漿CMVDNA量 の 推 移 血 漿 中CMVDNAの 量 は,CMV肺 炎 発 症 前 で は103∼105コ ピ ー/ml(平 均104.0コ ピ ー/ml)で あ り,CMV肺 炎 発 症 時 の 血 漿 中 のCMVDNA量 は 15検 体 で105コ ピ ー/ml以 上(平 均105.3コ ピ ー/ml)
Fig. 2 Follow-up of CMV DNA by nested PCR in plasma of 17 immunocom-promised patients with CMV pneumonia.
•› Negative for plasma CMV DNA,•œPositive for plasma CMV DNA,
t death, I IGanciclovir treatment
Fig. 3 CMV DNA titer in plasma.
に増 加 した(Fig.3).CMV肺 炎 で 死 亡 した 症 例 で は,死 亡 時 まで 血 漿PCRは 陽性 で,CMVDNA 量 の減 少 もみ られ な か っ た が,ganCiClOVirの 投 与 に よ り軽 快 した症 例(症 例10)で は106コ ピー/ml か ら103/コ ピー/mlへ と減 少 し,治 療 開 始 後2週 間 で 陰 性 化 した. 考 察 CMV肺 炎 の 最 も確 実 な 診 断 法 は,生 検 あ る い は 気 管 支 肺 胞 洗 浄 液 に よ り得 ら れ た 検 体 か ら CMV感 染 細 胞 を検 出 す る こ と で あ る が13),肺 局 所 か ら繰 り返 し検 体 を得 る こ とは 困 難 で あ る.末 梢 血 白 血 球 か ら ウ イ ル ス を 培 養 す る 方 法 (viremia)14)や,ウ イ ル ス 抗 原 を 検 出 す る 方 法 (antigenemia)5)6)15)は活 動 性CMV感 染 症 に対 す る特 異 性 の 高 い診 断 法 で あ る が,研 究 室 で の 組 織 培 養 系細 胞 の維 持 ・管 理 と,検 体 採 取 後 の速 や か な検 体 処 理 が 必 要 で あ る. PCR法 に よ り末 梢 血 白 血 球 か ら の ウ イ ル ス DNAを 検 出 す る方 法(DN Aemia)は 特 異 性 の 高 い 迅 速 診 断 法 で あ るが,極 め て感 度 が 高 い た め不 顕 性 感 染 で も陽 性 とな り7)8),活動 性CMV感 染 症 の 診 断 に は 不 適 で あ る. CMVの 感 染 様 式 は細 胞 間 伝 播 で あ る と考 え ら れ,通 常 血 漿 や 血 清 か ら は分 離 培 養 さ れ な い. Ishigakiら10)はCMV肺 炎 を発 症 した 骨 髄 移 植 患 者 の 血 清 か ら初 め てCMVDNAを 検 出 し,血 清 中 のCMVは 感 染 力 の な いdefective virionsの 状 態 で 存 在 す る と推 測 した.Bryttingら も16)PCR 法 に よ り活 動 性CMV感 染 症 患 者 の 血 清 か ら CMVDNAを 検 出 し,CMV感 染 細 胞 の 融 解 に よ り血 清 中 に遊 出 され たCMVDNAの 存 在 を想 定 した.し か し,Spectorら17)は0.2μmフ ィル タ ー で濾 過 したcellfreeの 血 漿 よ り,CMVDNAを 検 出 し,さ らに ウイ ル ス の分 離 培 養 に成 功 した. 即 ち,活 動 性CMV感 染 患 者 の 血 漿 中 に は感 染 性 感染症学雑誌 第69巻 第9号
血 漿PCR法 に よるCMVDNAの 検 出 967 CMVが 存 在 し,細 胞 間伝 播 だ け で な く,cell-free CMVに よ る ウ イル ス伝 播 の可 能 性 を示 唆 した. 本 研 究 で 我 々 は,PCR法 に よ る 血 漿 か ら の CMVDNAの 検 出 は,感 度 ・特 異 度 に優 れ て い る の み で は な く,CMV肺 炎 の 早 期 診 断 に 有 用 で あ る こ と を明 ら か に した.即 ち,CMV肺 炎 で は大 部 分 の症 例 で 胸 部 異 常 陰 影 の 出 現 以 前 に血 漿PCR は陽 転 化 して い た.し か し,CMV肺 炎 を認 め な い 症 例 や健 常 人 で は陰 性 で あ り,今 回 の 測 定 法 を用 いれ ば,血 漿PCR法 が 陽転 化 した 時 期 に抗 ウ イ ル ス 剤 の投 与 す べ きで あ る こ とが 示 唆 され た. 血 漿CMVDNAの 半 定 量 化 の検 討 で はCMV 肺 炎 発 症 時 にお け る ウ イ ル スDNA量 は発 症 前 に く らべ 増 加 し,治 療 反 応例 で は臨 床 所 見 の改 善 と 相 関 して減 少 し て お り,抗 ウ イ ル ス 剤 の 治 療 効 果 を判 定 す る う え に も役 立 っ もの と考 え られ た. 今 回検 討 した 方 法 で は,DNAの 抽 出 法 に フ ェ ノー ル 抽 出 ・エ タ ノ ー ル 沈 殿 や,DNAの 半 定 量 化 法 に放 射 線 性 同 位 元 素 ・ビオ チ ン プ ロ ー ブ の使 用 な ど,繁 雑 な 操 作 法 は用 い て い な い.こ の 簡 便 な 方 法 の 導 入 に よ り,検 査 の 短 時 間 化 や一 般 検 査 室 で の ル ー チ ン検 査 化 が 可 能 で あ る と思 わ れ た. 以 上 よ り,従 来 行 わ れ て い た 末 梢 血 白血 球 を用 い たPCR法 に比 べ,血 漿PCR法 は易 感 染 性 宿 主 に お け るCMV肺 炎 の診 断 とモ ニ タ リ ング に極 め て有 用 で あ り,ま た ウ イ ル スDNA量 は病 勢 と相 関 す る こ とが示 唆 され た.今 後 さ らに症 例 が 集 積 さ れ れ ば,血 漿PCR法 と血 漿CMVDNAの 定 量 化 が抗 ウ イル ス剤 投 与 の優 れ た 指 標 とな る もの と 考 え られ る. 謝辞:CMVAD169株,胎 児肺線維芽細胞を ご供与いた だいた宮崎医科大学微生物学講座,南 嶋洋一先生 に深謝い た します. 文 献 1) 沼 崎 義 夫: サ イ トメ ガ ロ ウ イ ル ス 感 染 症. 周 産 期 医 学, 17: 369-372, 1987.
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Detection and Quantitation of Cytomegalovirus DNA in Plasma from Patients with Cytomegalovirus Pneumonia
Iseei TOKIMATSU1), Takayoshi TASHIRO2), Yuriko YAMAKAMI1), Tohru YAMASAKII1), Hiroshi NAGAOKA1), Hiroyuki NAGAI1), Atsuro HASHIMOTO1), Yoichiro GOTO1),
Yoshio SABURI1), Hiroshi KIKUCHI3) & Masaru NASU1) 1) Second Department of Internal Medicine, Oita Medical University
2) The School of Allied Medical Sciences , Nagasaki University 3)Blood Transfusion Service , Oita Medical University
Detection and semiquantitation of cytomegalovirus (CMV) DNA in plasma from 17 im-munocompromised patients with CMV pneumonia diagnosed histopathologically, 15 CMV-seropositive patients without CMV pneumonia and 24 CMV-seropositive healthy volunteers were evaluated, using the polymerase chain reaction (PCR).
CMV DNA was detected in plasma from all of 17 patients with CMV pneumonia, from 1 of 15 patients without CMV disease, but from none of healthy volunteers. One patient without CMV disease exhibited positive CMV DNA by PCR 2 days before death. Plasma CMV DNA was negative at the time of admission in all patients, however, it became positive 1-28 days (mean, 14 days) before the onset of CMV pneumonia in 16 patients. The amount of viral DNA in plasma were 103-105 copies/ml (mean, 104.0 copies/ml) when first detected by PCR. At the onset of CMV pneumonia, they were 104-106 (mean, 105-3 copies/ml), and increased with disease progression and decreased with disease improvement because of treatment with antiviral agents.
We succeeded in detection of CMV DNA in plasma before the development of CMV pneumonia, and showed the amount of viral DNA reflected the extent of active CMV pneumonia.
Thus, PCR amplification of CMV DNA in plasma is a useful tool for early diagnosis and monitoring of immunocompromised patients.
