- ATPas e 阻害薬PBI - 05204 による 脳虚血傷害後の治療効果の検討

Na

, K

- ATPas e 阻害薬PBI - 05204 による 脳虚血傷害後の治療効果の検討

井筒美和，工藤雅哉，川前金幸

山形大学医学部麻酔科学講座

（平成29年２月14日受理）

【緒言】

　Na

, K

- ATPas e は、中枢神経系においてイオン勾配 を維持する重要な役割を果たしているが

、脳虚血に よりエネルギー代謝とATP 産生が中断されることに よって、ATP を必要とする酵素機能が傷害されること が あ る。Na

, K

- ATPas e 活 性 は、中 大 脳 動 脈 閉 塞

（MCAO ）において低下し

、再灌流2 4時間後に活性 は8 0％であったとの報告がある。Na

, K

- ATPas e 活 性は、生理学的レベルでの遊離細胞内Ca

とNa

濃度

を維持するNa

/ Ca

交換体

および虚血再灌流後の生 理的Ca

の回復

に関連しており、強心配糖体のひと つであるOuabai n が誘導するNa

, K

- ATPas e 阻害は、

細胞内Ca

の増加と培養皮質ニューロン内のアポトー シスを引き起こし

、虚血後のNa

, K

- ATPas e 活性の 薬理学的回復は、神経保護的であると報告されてい る

。し た が っ て、傷 害 さ れ た 脳 に お い てNa

, K

- ATPas e レベルを一定に保つことは、組織生存に重 要であるとされている

。

　一方で、Na

, K

- ATPas e 阻害薬の脳保護作用を示唆 し た 報 告 が あ る。Wang ら

は、Hi gh t hr ough put

【背景】脳虚血障害においてNa⁺

, K

- ATPas e 活性は低下することが知られている。Na

/ Ca

交換系も障 害されるため、細胞内Ca

濃度の上昇から神経細胞死が誘発されると考えられている。一方で、Na

, K

- ATPas e 阻害薬であるPBI - 05204 ( PBI ) やその主要成分が高い脳血管関門通過性をもち、脳由来神経 栄養因子( BDNF )を上昇させ、脳神経細胞保護効果を示すことが報告された。PBI は抗腫瘍薬として既 に臨床応用の可能性が示唆されている薬物である。今回、我々はPBI による脳虚血障害後の神経保護作 用を成熟ラット中大脳動脈虚血再還流（MCAO ) モデルを用いて詳細に検討した。

【方法】MCAO

モデルは雄性成熟Wi s t e r ラットを用いて、右外頸動脈よりフィラメントを挿入し、右中大 脳動脈を閉塞させることにより作成した。フィラメントは7 0分留置した後に抜去し、血流を再開させ た。PBI は腹腔内投与にて治療効果の検討を開始したが、連続投与で腹腔内癒着が認められたため、経 口投与に変更して実験を行った。 PBI （0, 40, 100, 200 mg/ kg/ day ) は再灌流9 0分後に初回の投与を行 い、その後６日間連続投与した。 虚血７日後に神経学的、 組織学的評価を行った。また正常ラットに おけるPBI 投与後の非観血的動脈圧測定と、脳中BDNF の測定を行った。

【結果】100

および200 mg/ kg/ day 群において、対照群と比較して2 4時間後に神経学的所見の改善を認め た( P = 0. 0005, 0. 004 )が、7 日後では神経学的、 組織学的所見の改善に有意差はなかった。正常ラット において、高用量PBI 群でコントロール群、低用量群と比較して血圧低下を認めたが、血圧は正常域で あった。また有意ではないが、PBI の用量依存性に脳中BDNF の上昇を認めた。

【結論】本研究において

PBI の経口投与では脳虚血障害に対して長期的な神経保護作用を得るのが困難 であることを明らかにした。その原因としてPBI の 含有成分が投与経路や吸収を制限していることが考 えられる。しかし、PBI の主要成分を用いて投与時期/経路を検討することにより効果が得られる可能 性は高いと考えられ、本研究によって今後検討すべき方向を示すことができた。

キーワード ：

Na

, K

- ATPas e i nhi bi t or , mi ddl e c e r e br al ar t e r y oc c l us i on, BDNF , r at

s c r e e ni ng pl at f or mを用いて、脱酸素・脱グルコース

（OGD ）にさらされた新生児ラット大脳皮質スライス でニューロン生存能力を保存することのできる薬理学 的物質を特定し、その中で特にNe r i i f ol i n が非常に有 効であると報告した。Ne r i i f ol i n は、Na

, K

- ATPas e 阻害薬として働くことによって、うっ血性心不全や 不整脈に用いられる強心配糖体と構造的類似性を 持つ、キバナキョウチクトウ（The ve t i a pe r uvi ana 。 The ve t i a ne r i i f ol i a としても知られている）に由来する 植物二次代謝産物である

。Ne r i i f ol i n の有効性は、

新生児ラット低酸素虚血モデルと成熟ラットMCAO の急性転帰モデルでさらに調査され、両ケースで病変 量が減少した。以前にOuabai n で報告されているよう に、虚血回復中のある程度のNa

, K

- ATPas e 阻害は、

潜在的にα2 およびα3 Na

, K

- ATPas e アイソフォー ムとの相互作用を介して、ATP の需要を減少させるこ とにより治療効果を持つ可能性があると仮定されてい る

。さらに、虚血中の細胞内へのCa

流入は、虚血 の有害反応と広範囲に関連しているが、虚血細胞の回 復に少なくともある程度は、Ca

のレギュレーション が依存している

。

　Ne r i i f ol i n は、血液脳関門（BBB ）を通過しにくいた め、臨床開発は難しいと考えられている

。しかし脳 虚血傷害の治療薬としての強心配糖体の研究への論理 的根拠を提供したといえる。予備実験において我々は 最初に、臨床使用経験が豊富なNa

, K

- ATPas e 阻害薬 であるジゴキシンの神経保護作用を検討した。低用量 のOuabai n とジゴキシンは、 OGD にさらされたラット 培養海馬スライスにおいてNa

, K

- ATPas e 活性を増 加させ

、i n vi vo での神経学的転帰を改善したと報告 がある

。我々は、ラットの周産期低酸素虚血転帰モ デルにおいて、さまざまな低毒性用量のジゴキシンで 実験を行った。しかしジゴキシンの低いBBB 透過性 のため、脳梗塞巣を減少させる効果は見られなかった

（未発表データ）。

　我々はその研究結果を受けて、同じくキョウチクト ウの強心配糖体であるNa

, K

- ATPas e 阻害薬、PBI - 05204 について調査した。PBI - 05204 は高いBBB 透過 性を有し、新生児ラットの大脳皮質スライスOGD アッセイへの投与と、新生児ラットへ虚血前全身投与 の両方で有効性が証明されている

。また抗がん剤と し て 臨 床 開 発 中 で あ る

。さ ら に、PBI - 05204 は、

OGD によって損傷を受けたラットの脳スライスにお いて、標準的な神経成長因子と関連している脳由来神 経栄養因子（BDNF ）を増加させた

。

　本試験は限局性虚血性脳卒中に対するPBI - 05204 の

脳神経保護効果を７日間にわたり検討した始めての研 究である。本研究で提示された段階的なスタディーデ ザインは、PBI - 05204 の治療効果の可能性を追求する ため、さらなる包括的な前臨床試験が必要かどうかと いう基準で設定された。 我々はまた、PBI - 05204 によ る心血管系への影響が脳虚血の悪化に寄与する可能性 を調査するため正常ラットにおけるPBI - 05204 投与後 の平均動脈圧（MAP ）の測定を行い、i n vi vo における BDNF への効果についても検討したので報告する。

【対象と方法】

　こ れ ら の 試 験 は デ ュ ー ク 大 学 のAni mal Car e and Us e Commi t t e e によって承認された。中大脳動脈閉塞

（MCAO ）試験で使用する成熟オスウィスターラット

（250 ～300 g ）をHar l an Spr ague Dawl e y , I nc . 社（イン ディアナポリス）から購入した。

中大脳動脈閉塞 （MCAO）

　我々は実証されたラット一過性MCAO モデルを利

用した

。ラットは手術前夜に絶食とした。５％イ

ソフルランで麻酔を導入し、気管挿管した。1 . 3～

２％のイソフルランで麻酔を維持し、手術中は3 0％O

で機械換気とし、尾動脈カテーテルと頭蓋骨膜温度 サーミスタを留置した。凝血を防止するために50 I U の ヘ パ リ ン を 尾 動 脈 よ り 投 与 し た。平 均 動 脈 圧

（MAP ）を継続的にモニターして、血液ガス（pH, PaO

, PaCO

）とグルコースを測定するために、動脈血 を採取した。体表面の加温と冷却によって頭蓋骨膜温 度を3 7 . 5℃ ± 0 . 2℃に調整した。

　過去に提唱されている修正型MCAO を用いて

、 ラットにMCAO の準備をした。頸部腹側正中切開を 行い、右総頸動脈を同定した。外頸動脈（ECA ）を露 出し、結紮、分離した。内頸動脈（I CA ）を、翼突口 蓋動脈起始部が見えるようになるまで遠位で切断し、

総頸動脈を一時的に閉塞した。ナイロンモノフィラメ ント（直径0. 25 mm ）の遠位0. 5 c m をシリコンで被覆 したもの（直径0. 38 mm ）をECA 断端に挿入し、わず かな抵抗が感じられるまで挿入して、7 0分間I CA に留 置 し た（頸 動 脈 分 岐 部 か ら 約19 ～20 mm ）。7 0分 の MCAO の後で、潅流を回復させるためにフィラメント を引き抜いて、創傷を縫合糸で閉鎖して、0. 1 ml の 0 . 2 5％ブピバカインを創部に染み込ませた。閉創後、

尾動脈カテーテルを取り外した。 イソフルランを中

止して、頭蓋骨膜サーミスタを取り外した。麻酔から

回復した後に、抜管した。その後ラットは3 0％ O

の

２L のアクリルボックスに8 5分間留置したのちに、

ホームケージに戻してエサと水に自由にアクセスでき るようにした。

神経機能の測定

　MCAO ラットに対し、過去に報告されている標準神 経学的評価を行った

。この評価システムでは４ つの異なる機能（全身状態、単純運動障害、複雑運動 障害、感覚障害）を評価した。各ラットに与えられた スコアは、４つすべての個々のスコアの合計で、０が 最小（最良）スコアで4 8が最大（最悪）スコアであっ た。この評価システムは、脳梗塞サイズとよく相関し ていることが示されている

。神経機能の評価は群の 割り付けに盲検化された観察者がおこなった。

ロー タロッド

　実験３と４において、MCAO の１日前と７日後に ロータロッドの測定をおこなった。回転速度が５分間 かけて４から40 r pmに加速するロータロッド試験機 器（ENV- 577, Me d As s oc i at e s I nc . 社、バ ー モ ン ト 州 ジョージア）をもちいて、ラットが加速するロータ ロッドに留まり続けることができる時間（秒で測定）

を過去の報告のように記録した

。各試験日に、1 5 分の試験間隔で、３試験を行った。各日の最良成績を 記録した。

脳梗塞量の測定

　脳梗塞は過去に報告されている方法を用いて測定を

行った

。神経学的評価後に、ラットの体重を測定

し、イソフルランで麻酔して、脳組織の摘出を行った。

実験１、３、４では脳組織を－2 0℃の2- メチルブタン の中で急速凍結し、 Swans on らの方法を用いて脳梗 塞量を測定した

。梗塞の吻側-尾側範囲にわたって 720 µm の間隔で、クリオトームを用いて、連続した４ つ一組の20 µm 厚の冠状切片を採取した。切片を乾燥 させて、 HE 染色 をほどこした。各720- µm 間隔からの 代 表 的 な 切 片 を、画 像 分 析 器（MCI D El i t e

， I nt e r f oc us I magi ng 社，英国リントン）で制御されたビ デオカメラでデジタル化した。各切片の画像を1280 X 960- ピクセルマトリックスとして保存して、ビデオ モニター上に表示した。実験条件に盲検化された観察 者が以下の領域の測定を行った：非梗塞部同側大脳皮 質、非梗塞部同側皮質下部、対側大脳皮質および対側 皮質下部。各領域の面積（mm

）を領域内に含まれる 較正ピクセルの自動計測によって決定した。非梗塞部 同側大脳皮質および皮質下部面積を、対応する対側領

域値から差し引いて、梗塞量（mm

）を、差し引かれ た梗塞領域に正射形として計算された梗塞の吻側－尾 側範囲にわたる切片間の既知の間隔（例えば720 µm ） を乗じた累積和として計算した

。

　実験５と６では2, 3, 5- 塩化トリフェニルテトラゾリ ウム（TTC ）を用いて、脳梗塞量を評価した。MCAO からの再灌流の3 0時間後に、新鮮脳を2 mm 厚の冠状 連続切片に切り分けて、色の変化が安定するまで（<

30 分）、3 7 . 5℃で２％のTTC で染色した。その後、脳 スライスを1 0％のホルマリンで保存した。上述のよう に、脳梗塞量を平面画像化と減法分析を用いて測定し た。

実験１：ラットMCAO におけるPBI - 05204 腹腔内投与 の効果

　ラットに7 0分間のMCAO を行った。再灌流開始の 8 5分後に旋回行動を示さなかったラットは、さらなる 試験から除外した。その後、ジメチルスルホキシド/

ポリエチレングリコール、50: 50 v/ v に溶かしたPBI - 05204 の各容量群（0, 5, 10 または20 mg/ kg/ 日）にラッ トを無作為に割り付けた

。Ve hi c l e 群の総注入量はす べての実験で0. 3 ml （約0. 5 mg/ kg ジメチルスルホキシ ド）であった。各投与量は、以前の報告で新生児ラッ トに投与された量を参考に規定した

。再灌流開始の 9 0分後に投与を開始し、その後さらに６日間、同一用 量で毎日腹腔内投与を行った（１群につきn = 18 ）。体 重を終日測定した。MCAO の2 4時間後と７日後に、群 の割り付けに盲検化された観察者が神経学的スコアを 測定した。

実験２：PBI - 05204 腹腔内投与によって誘発された腹 部炎症

　実験１においてPBI - 05204 を腹腔内投与されたラッ

トで体重減少を観察したため、我々は、これがPBI -

05204 の腹腔内投与によって引き起こされたか調査し

た。正常ラットを、７日間、１日１回20 mg/ kg のPBI -

05204 腹腔内投与群、またはVe hi c l e 腹腔内投与群に無

作為に割り付けた（１群につきn = 4 ）。体重を終日測

定した。８日目に開腹し腹腔内を調査して、標準評価

システムを用いて癒着を測定した

。腹部を４つの領

域：肝臓と大綱、大綱と腸壁、腸と腹壁および腸と胃

の間に分けた。スコア 0 =癒着なし、 1 = １～３個の分

離した癒着、2 =３個以上の明瞭な分離した癒着、3 =

広範なシート状の癒着で総計最大1 2のスコア化を行っ

た。

実験３：ラットMCAO におけるPBI - 05204 経口投与の 用量依存効果

　実験２の結果をふまえて、我々はPBI - 05204 の投与 経路を腹腔内投与から経口投与に変更して試験を行っ た。PBI - 05204 の相対的経口バイオアベイラビリティ は約3 0％と計算されていた

。既知のバイオアベイラ ビリティを補うために、この実験ではPBI - 05204 の経 口投与用量を増量した。上述のように、ラットに7 0分 間のMCAO を行った。旋回行動確認後、MCAO 9 0分後 にPBI - 05204 （40, 100 mg/ kg/ 日）またはVe hi c l e の投与 を開始し、さらに続けて６日間連続投与した（１群に つきn = 20 ）。MCAO の2 4時間後と７日後に神経機能 を評価した。MCAO の１日前と７日後にロータロッ ドを行い、MCAO の７日後に、脳梗塞巣の測定を行っ た。MCAO の2 4時間後の神経学的検査を除いて、実験 条件に盲検化された観察者が、すべての測定を行っ た。

実験４：ラットMCAO における高用量PBI - 05204 の効 果

　実験３で100 mg/ kg/ 日のPBI - 05204 を投与されたラ ットにおいて、2 4時間後の神経学的所見に統計的有意 な改善効果を観察した。７日目の神経学的スコアに ve hi c l e 群との統計的差違はなかったが、PBI - 05204 100 mg/ kg/ 日群での改善傾向は明らかに認められた。

これは潜在的なPBI - 05204 の有効性を示唆しており、

高用量はより有効である可能性があると考え、我々 は、経口投与量を100 mg/ kg/ 日から200 mg/ kg/ 日に増 量して、実験３と同様の調査を行った。

実験５：PBI - 05204 の急性期の効果

　この時期に、OGD 下脳皮質スライスの介在研究で、

短期のPBI - 05204 治療のみが長期回復パラダイムにお いて有効であることが分かった（Donal d Lo , 未発表）。

持続的なPBI - 05204 投与は毒性をもつ可能性があると いうことも明らかになり、その所見とともに、実験３ と４で急性期にのみの非盲検下で神経学的スコアの改 善がみられたという結果から、盲検下に2 4時間後の神 経学的スコアと脳梗塞巣を評価する実験５を行った。

7 0分のMCAO を施行したのち、その9 0分後および2 0時 間 後 に、PBI - 05204 （50 ま た は100 mg/ kg ）ま た は Ve hi c l e を 経口投与した（１群につきn = 15 ）。 MCAO の2 6時間後に、盲検化された観察者が標準神経学的検 査を行った。その後、上述のように脳梗塞量を測定す るために、脳組織を摘出してTTC で染色した。

実験６：PBI - 05204 前投与の急性期の効果

　その後、我々は、虚血前にPBI - 05204 が投与された 場合の急性転帰について評価した。MCAO の2 4時間 前 お よ び ２ 時 間 前 に、50 ま た は100 mg/ kg のPBI - 05204 、Ve hi c l e または0 . 9％生理食塩水群を無作為に 割り付けたラットに経口投与した（１群につきn = 10 。 0 . 9％生理食塩水群は、ジメチルスルホキシドの神経 保護効果の可能性を検討するために、コントロールと し て 設 け た。）。MCAO は こ れ ま で と 同 様 に 行 い、

MCAO の6 0分 後 に 旋 回 が な い 場 合 は 除 外 し た。

MCAO の2 4時間後に、神経機能と脳梗塞量を評価し た。

実験７：平均動脈圧（MAP ）と脳由来神経栄養因子

（BDNF ）へのPBI - 05204 の効果

　MAP を測定するために、非侵襲的テールカフシス テ ム を 使 用 し た（MRBP 血 圧 シ ス テ ム、I I TC Li f e Sc i e nc e 社、カリフォルニア州ウッドランドヒルズ）。

正常ラットを３日間、血圧測定の刺激に慣れさせてか ら、PBI - 05204 （100 ま た は200 mg/ kg/ 日）ま た は Ve hi c l e を２日間経口投与した（１群につきn = 4 ）。そ れぞれ投与開始３時間前と投与２時間後にMAP を測 定した（図１）。

　その後、脳を摘出して、－8 0℃で保存した。大脳半 球を氷の上で解凍して、Compl e t e Mi ni プロテアーゼ インヒビターカクテル錠（Roc he 社、インディアナ州 インディアナポリス）と17 µg/ ml のPMSF が補充され た100 mMの ト リ ス/ HCl pH 7 、２ ％ のBSA 、1 Mの NaCl 、4 mMのEDTA 、２％のトリトンX- 100 および

- 05204

mg/ kg/

hi c l e

= 4

各治療日に、治療の３時間前と治療の２時間後にMAPを 測定した。最終測定後に、ラットを安楽死させて、BDNF 分析のために、脳組織を摘出した。

0 . 1％のアジ化ナトリウムを含有する冷たい溶解バッ ファーの中で均質化した。14, 000 x g での3 0分間の遠 心分離後上澄みを採取し、 BDNF ELI SA （Che mi Ki ne BDNF s andwi c h ELI SA ki t ；EMD Mi l l i por e 社，マ サ チューセッツ州ビレリカ）で分析した。Abs ol ut e l y RNA mi ni pr e p ki t s （Agi l e nt Te c hnol ogi e s / St r at age ne 社、カリフォルニア州ラホヤ）を用いてRNA も採取し た。一定分量（500 ng ）のRNA を、オリゴdT プライ マーとSupe r s c r i pt I I （I nvi t r oge n 社、カリフォルニア 州カールスバッド）での逆転写に使用した。得られた c DNA 試料を、Vi i A 7 リアルタイムPCR 機器（Appl i e d Bi os ys t e ms 社）上 でBul l s e ye EvaGr e e n- l ow ROX

（Mi dSc i 社、ミズーリ州セントルイス）とイントロン スパニングBDNF プライマーを用いて、遺伝子転写 物の定量PCR に使用した

。各試料を３回測定し GAPDH を用いてRNA 回収とサンプル処理を標準化し た。

統計解析

　実験群への割り付けはマイクロソフト・エクセルの 乱数表を用いて無作為に行った。BDNF 発現、生理学 的データ、神経学的スコア、ロータロッドおよび脳梗 塞巣は、一元配置ANOVA で比較した。有意差が認め られた場合や、２つを超える実験条件が使用されたと きには、事後解析で群間差に対してBonf e r r oni の多重 比較検定を行った。連続体重とMAP 値は、反復測定

ANOVA で比較した。P < 0. 05 を統計的有意と見なし た。統計解析はPr i s m 5. 0a ソフトウェア（カリフォル ニア州ラホヤ）を用いて行った。

【結果】

実験１：ラットMCAO におけるPBI - 05204 腹腔内投与 の効果

　虚血前後の体重、MAP 、体温、血液ガス分析結果等 生理学的検査値に群間差はなかった（表１、n = 14 ～ 17 ）。Bonf e r r oni の多重比較検定では時間経過と群間 の両方で体重が有意に低下していたが（P < 0. 0001 ）、

７日目の体重に関して事後一元配置ANOVA を実施し たところ、群間差は認めなかった（P = 0. 66 ） （図２Ａ）。

PBI - 05204 は、2 4時間（P = 0. 40 、図２Ｂ）および７日

　　　（虚血後の腹腔内PBI

- 05204

図 ２．ラットMCAO後腹腔内にPBI

- 05204

= 14- 17

<

0. 0001

< 0. 0001

７日目の体重に関して行った事後一元配置ANOVAで、群 間差は見られなかった（P

= 0. 66

MCAO

PBI - 05204

= 0. 40

= 0. 41

± SD

目（P = 0. 41 、図２Ｃ）の神経学的スコアを変化させな かった。そのため、脳梗塞量は測定しなかった。

実験２：PBI - 05204 腹腔内投与によって誘発された腹 部炎症

　実験１において、反復腹腔内 PBI - 05204 投与と関連 してラットの体重が減少したため、我々はこれが注入 液への腹腔内反応に起因するかどうかを検討した。正 常 ラ ッ ト を 用 い た こ の 実 験 で、７ 日 間 の20 mg/ kg PBI - 05204 腹腔内投与は体重に有意な変化を引き起こ さなかった（P = 0. 61 、１群につきn = 4 ）。しかし、腹 部癒着が、PBI - 05204 で治療された４匹のラットのう ち３匹で見られ（平均癒着スコア = 2 ）、Ve hi c l e 投与 ラットでは見られなかった。これによって、我々は腹 腔内投与を中止し、その後の試験は経口投与で行うこ とを決定した。

実験３：ラットMCAO におけるPBI - 05204 経口投与の

用量依存効果

　生理学的検査値は、実験１で報告された値に類似し ており、群間差はなかった（データ未公開、１群につ きn = 20 ）。７日目のロータロッドの結果に群間差は なかった（P = 0. 71 、図３Ａ）。MCAO 2 4時間後の神経 学 的 検 査 の 結 果 で、Ve hi c l e 群 と 比 較 し て 経 口PBI - 05204 　100 mg/ kg 群 は 神 経 機 能 を 改 善 し た（P = 0. 0005 、図３Ｂ）。しかし、MCAO ７日後の結果には 群間差はなかった（P = 0. 27 、図３Ｃ）。同様に、皮質

（P = 0. 51 ）、皮質下（P = 0. 14 ）または総脳梗塞量（P

= 0. 37 ）に差はなかった（図３Ｄ）。

実験４：ラットMCAO における高用量PBI - 05204 の効 果

　生理学的所見に群間差は見られなかった（データ未 公表、１群につきn = 20 ）。実験３においてPBI - 05204 　100 mg/ kg/ 日 群 で 見 ら れ た よ う に、PBI - 05204 　

- 05204

存効果（１群につき

n = 20

A)

= 0. 71

± SD

B)

- 05204

mg/ kg/

ve hi c l e

= 0. 0005

C) MCAO

= 0. 27

D)

= 0. 37

B) ( C) ( D)

図 ４．ラットMCAOにおける高用量PBI

- 05204

= 20

A)

= 0. 41

±

SD

B)

- 05204

mg/ kg/

hi c l e

=

0. 0004

C) MCAO

=

0. 66

D)

= 0. 37

B) ( C) ( D)

200 mg/ kg/ 日群は、Ve hi c l e 群と比較してMCAO 2 4時間 後に神経機能の改善を示した（P = 0. 004 、図４Ｂ）。し かし、７日後に測定された神経機能（P = 0. 66 ）、ロー タロッド（P = 0. 41 ）および皮質（P = 0. 45 ）、皮質下

（P = 0. 07 ）、総脳梗塞量（P = 0. 65 ）は、群間で差はな かった（図４Ａ，Ｃ，Ｄ）。

実験５：MCAO 後のPBI - 05204 の急性期の効果 　生理学的所見は実験１で報告された値に類似して、

群間で差は見られなかった（データ未公表、１群につ きn = 15 ）。い ず れ のPBI - 05204 用 量（50 ま た は100 mg/ kg ）も、神 経 学 的 ス コ ア（P = 0. 25 ）、皮 質（P = 0. 14 ）、皮質下（P = 0. 49 ）や総脳梗塞量（P = 0. 11 ） を変化させなかった。図５を参照。

実験６：PBI - 05204 前投与の急性期の効果

　生理学的所見ではMCAO 1 5分後のMAP で群間差が 認められたが（Ve hi c l e = 80 ± 6 、生理食塩水 = 79 ± 9 mg/ kg 、 50 mg/ kg = 89 ± 10 mm Hg 、 100 mg/ kg = 87

± 7 mm Hg 、 P = 0. 03 、１群につきn = 10 ）、その他の生 理学的所見に群間差はなかった（データ未公表）。

PBI - 05204 の前治療は、神経学的スコア（P = 0. 84 ）、

皮質（P = 0. 24 ）、皮質下（P = 0. 59 ）や総脳梗塞量（P

= 0. 34 ）を変化させなかった。Ve hi c l e （メチル・スル

ホキシド/ポリエチレン・グリコール、50: 50 v/ v ）の効 果も認められなかった（図６Ａ，Ｂ）。

実験７：平均動脈圧（MAP ）と脳由来神経栄養因子

（BDNF ）へのPBI - 05204 の効果を判定 　PBI - 05402 200 mg/ kg 群のMAP は、 Ve hi c l e 群とPBI - 05204 100 mg/ kg 群よりも低値であった（P < 0. 05 ，図 ７Ａ）。Ve hi c l e 群 とPBI - 05204 100 mg/ kg 群 と の 間 に 有 意 差 は 認 め ら れ な か っ た。BDNF に お い て は mRNA とタンパク質へのPBI - 05204 の用量依存性の効 果が認められたが、群間に統計学的有意差はなかっ た。（それぞれP = 0. 54 と= 0. 10 ，図７Ｂ，Ｄ）。１群につ きn = 4 。

【考察】

　キョウチクトウの抽出物（Ol e ande r e xt r ac t ）である Na

, K

- ATPas e 阻害薬PBI - 05204 は、2 0 0 7年９月に FDA から“bot ani c al dr ug （植物薬）”として入手され た

。マウスの薬物動態試験において、キョウチクト ウの主な活性成分だけを精製したOl e andr i n と比較し て、Ol e ande r e xt r ac t はBBB 透過性が高くより長く脳 内にとどまることが示されたため

、PBI - 05204 を用 いた実験を計画した。本剤は治療域が狭いといわれて

- 05204

n = 10

MCAO

A)

= 0. 84

B)

= 0. 34

図 ５．MCAO後のPBI

- 05204

n = 15

A)

= 0. 25

B)

=

0. 11

いる強心配糖体であるため、ジギタリス中毒に代表さ れるような心循環毒性の可能性が考えられるものの、

実験では中毒域を下回る用量を用いて行われた。

　PBI - 05204 の腹腔内投与を用いた最初の実験で我々 は、PBI - 05204 内の精製されていない植物抽出物性の 化学物質が腹部炎症を引き起こし、持続的な腹腔内投 与が腹部癒着を誘発するため、正常な消化管機能に影 響を及ぼすことを認めた。BBB 通過性を調査するた めに腹腔内注射を用いたPBI - 05204 の全身投与の研究 では

、PBI - 05204 投与が単回注射であったために腹 腔には影響を与えなかった。そこで、我々は、本研究 における投与経路を腹腔から経口に変更して実験を継 続した。実際、有効性を示したPBI - 05204 での今日ま での前臨床研究のほとんどは、経口投与で行われてい る

。

　本研究において我々はまず臨床応用を考えて虚血9 0 分後にPBI - 05204 投与する実験を行った。連続投与７ 日目のアウトカムにおいて数値的には用量依存性に神 経学的スコアおよび脳梗塞量の減少を認めたが、統計

学的に有意ではなかった。さらに、虚血前の短期治療 の実験を行ったが、神経学的および組織学的転帰の改 善を認めることができなかった。虚血再灌流モデルは 再灌流後のフリーラジカル産生等による細胞障害が虚 血による障害の大きなウエイトを占めると考えられて おり、Sakamot o らはフリーラジカル産生が再灌流５ 分後にピークをむかえ、その程度は虚血時間と相関す ると報告している

。虚血前から虚血後におけるPBI - 05204 投与のタイミングとその量については更に工夫 する必要があるかもしれない。

　実験７において、高用量PBI - 05204 群が他の群と比 較してMAP を低下させるものの、低下時の血圧は正 常範囲内にあったことを認めた。この結果は、PBI - 05204 の心血管系への影響は軽度であり、虚血組織へ の側副血流を損なうことでMCAO 傷害後の転帰に関 与する可能性は低いことを示唆している。その実験内 で我々は、mRNA とタンパク質の両レベルにおける BDNF を測定したが、最高用量を用いたときでさえ も、BDNF の有意な上昇は認めなかった。BDNF は、

神経可塑性と神経機能の改善に重要な役割を果たすこ とが示されている

。２つの別々のグループが、脳の 可塑性を促進し脳卒中後の機能的回復を増進するため に、虚血性傷害後にBDNF が増加すると報告してい る

。さらに、Na

, K

- ATPas e 阻害薬Ouabai n の海 馬内投与がNF- κB の活性化を誘発して、BDNF の増 加を引き起こすとの報告もある

。また、最近の試験 において、PBI - 05204 はBDNF の増強に関連しており、

OGD によって損傷を受けた脳スライスに神経保護作 用をもたらしたと報告されている

。本研究では実験 に正常ラットを用いたことでPBI - 05204 によるBDNF への影響が少なかった可能性があり、脳梗塞ラットを 用いた実験においては異なる結果を示すかもしれな い。

　総合すると、PBI - 05204 は実験的脳卒中および低酸 素状態にさらされた脳スライスにおいて神経保護作用 をもたらす可能性があるが、この有効性は限定的であ ると言える。そしてPBI - 05204 の中枢神経系への治療 応用に対する主な障害は、植物抽出物の有効成分とは 別の化学物質であるかもしれないと推測される。その 化学物質のために、腹腔内投与や経口投与において、

有効成分が十分な高濃度に到達しなかった可能性があ る。

　近年の研究においてOl e andr i n によりPBI - 05204 で 見られたような脳スライス内でのBDNF 増加を示す可 能性が明らかになった

。Ol e andr i n は腹腔内および 静脈内へも投与が可能であり、PBI - 05204 と比較する

へ のPBI

- 05204

= 4

- 05204

- 05204

< 0. 05

A)

BDNF mRNA( B)

C)

A) ( B) ( C)

± SD

とその程度は弱いものの、脳組織へスムーズに移行 し、長く残存する可能性は高い。加えてOl e andr i n は、

抗がん剤としての治療可能性も有し、 Na

, K

- ATPas e のα- 3 サブユニットへの作用によってヒトのがん細胞 増殖を有意に減少させることが示されている

。さら に、Ol e andr i n は抗HI V 療法の新しい候補としても大 きな注目を集めている

。これら様々な疾患に対する ポジティブな前臨床試験の結果は、ヒトへの適応を進 める上で有望であると考えている。

　厳密なプロトコール下のi n vi t r o データにもかかわ らず、我々の治療設定においてはPBI - 05204 の脳神経 保護効果を示すことができなかった。しかしながらこ の結果は、 Na

, K

- ATPas e 阻害の脳虚血に対する治療 効果を否定するものではなく、Ol e andr i n をはじめと したPBI - 05204 の主な活性成分に関しては、脳虚血障 害の治療上有用である可能性を残しており、BDNF 発 現に関連したさらなる調査が必要であると考える。

【謝辞】

　本試験は、一部Phoe ni x Bi ot e c hnol ogi e s , I nc . 社の支 援を受けている。

　本 論 文 の 作 成 に あ た り、ご 指 導 い た だ き ま し た Duke 大学Davi d S. War ne r 先生、また調査にご協力い ただきましたWar ne r l ab の先生方（Donal d C. Lo 先生、

Mi c hae l Van Kane gan 先生、Huaxi n She ng 先生、

He r c i l l a M. Homi 先生、佐々木俊弘先生、谷西秀紀先 生、Raf ae l . E. Chapar r o 先生）に、深く感謝申し上げ ます。

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Met hods: Wi s t e r r at s unde r we nt i nt r al umi nal mi ddl e c e r e br al ar t e r y oc c l us i on ( MCAO) f or 70 mi n.

I nt r ape r i t one al or or al PBI - 05204 t r e at me nt was be gun 90 mi n af t e r r e pe r f us i on ons e t . The pos t - t r e at me nt e f f e c t s we r e as s e s s e d at 24 hour s and 7 days af t e r MCAO. Al s o, t he pr e - t r e at me nt e f f e c t of or al PBI - 05204 was e val uat e d at 24 hour s af t e r MCAO. I n addi t i on, we i nve s t i gat e d whe t he r bl ood pr e s s ur e and BDNF we r e af f e c t e d by PBI - 05204 i n nor mal r at .

Resul t s: I nt r ape r i t one al PBI - 05204 i nduc e d abdomi nal i nf l ammat i on. 100 and 200 mg/ kg/ day of or al PBI - 05204 i mpr ove d ne ur ol ogi c al out c ome at 24 hour s pos t - MCAO ( P = 0. 0005, 0. 004, r e s pe c t i ve l y) . Howe ve r , t he di f f e r e nc e be t we e n PBI - 05204 and c ont r ol at 7 days di d not r e ac h s t at i s t i c al s i gni f i c anc e . Pr e - t r e at me nt of PBI - 05204 di d not al t e r t r e at me nt out c ome s . BDNF was s l i ght l y i nc r e as e d by PBI - 05204, but not s i gni f i c ant .

Concl usi on: We f ound s mal l e f f e c t s of PBI - 05204 on 7- day f oc al i s c he mi c out c ome and BDNF . Di f f e r e nt r e s ul t s mi ght be obt ai ne d f r om t he pur i f i e d pr i nc i pal c ompone nt of PBI - 05204 t hat al l ows c ur r e nt l y as s e s s e d admi ni s t r at i ons .

Key wor ds : Na

, K

- ATPas e i nhi bi t or , mi ddl e c e r e br al ar t e r y oc c l us i on, BDNF , r at

ABSTRACT