正電荷リポソームによる粘膜免疫賦活化機構の解明および経鼻投与型肺炎球菌ワクチンへの応用

第 四 項 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム の 取 り 込 み 経 路 第 五 項 FITC-OVA の 取 り 込 み 経 路 第 六 項 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム 併 用 時 の FITC-OVA 取 り 込 み 経 路 第 七 項 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム と FITC-OVA 併 用 時 の 取 り 込 み 状 態 3 ) 考 察 ---3 3 第 三 章 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム を 用 い た 経 鼻 粘 膜 投 与 型 肺 炎 球 菌 ワ ク チ ン の 開 発 1 ) 序 論 ---4 3 2) 実 験 結 果 ---44 第 一 節 感 染 実 験 第 一 項 肺 炎 球 菌 感 染 防 御 効 果 第 二 節 PspA と 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム 併 用 時 の 免 疫 応 答 第 一 項 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム と PspA 併 用 経 鼻 投 与 に よ る

IL-4、 IL-17 A、 IL-6、 IN F-の 産 生

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緒 論

高 度 に 発 達 し た 現 代 医 学 で あ る が 、感 染 症 に よ る 疾 患 の 治 療 は 困 難 を 伴 う 。そ の 証 拠 に 世 界 保 健 機 関 (World Health Organization; WHO)の 調 査 に よ る と 、2015 年 の 死 因 に お い て 感 染 症 が 第 2 位 (約 17％ )を 占 め る 1 )_{。こ れ ら 感 染 症 に よ る 死 亡 者} 数 は 、依 然 と し て 増 加 傾 向 に あ る 。そ の 背 景 と し て 、グ ロ ー バ ル 化 に よ る ヒ ト ・ モ ノ の 移 動 増 加 、急 速 な 人 口 増 加 に 伴 う 都 市 化 の 進 行 、開 発 に よ る 熱 帯 雨 林 帯 へ の ヒ ト の 侵 入 増 加 、お よ び 温 暖 化 を 代 表 と す る 気 候 変 動 な ど の 環 境 的 要 因 が 挙 げ ら れ る 1 , 2 )_{。 加 え て 、 感 染 症 の 増 加 に は 免 疫 抑 制 療 法 の 発 達 、 エ イ ズ 患 者 の 増 加} ま た は 薬 剤 耐 性 菌 の 増 加 な ど の 医 療 的 要 因 も 関 わ っ て い る と 考 え ら れ て い る 3 )_。 故 に 、感 染 症 の 撲 滅 に 向 け た 新 た な 機 構 を 有 す る 抗 生 剤 や 新 し い 視 点 か ら の 感 染 症 克 服 戦 略 の 開 発 が 望 ま れ て い る 。 こ れ ら の 中 に 粘 膜 ワ ク チ ン が あ り 、世 界 中 で 盛 ん に 研 究 が 行 わ れ て い る 。ワ ク チ ン は 人 類 最 大 の 発 明 の 1 つ と さ れ 、 1798 年 の エ ド ワ ー ド ・ ジ ェ ン ナ ー に よ る 天 然 痘 ワ ク チ ン と 1885 年 の ル イ ・ パ ス ツ ー ル に よ る 狂 犬 病 ワ ク チ ン を 始 ま り と す る 4 )_{。今 日 ま で に 多 く の 感 染 症 に 対 す る ワ ク チ ン が 開 発 さ れ 、感 染 症 予 防 に 多} 大 な 貢 献 を 果 た し て き た 5 - 7 )_{。ワ ク チ ン は 、① 病 原 体 そ の も の あ る い は 弱 毒 化 し} た 病 原 体 を 用 い た 生 ワ ク チ ン 、 ② ホ ル マ リ ン 等 で 不 活 化 し た 病 原 体 を 用 い た 不 活 化 ワ ク チ ン 、 お よ び ③ 病 原 体 自 体 で は な く 、 病 原 体 由 来 抗 原 を 利 用 し た サ ブ ユ ニ ッ ト ワ ク チ ン の 3 つ に 分 類 さ れ る 8 , 9 )_{(Tab le 1)。 生 ワ ク チ ン あ る い は 不 活 化} ワ ク チ ン は 病 原 体 そ の も の の 接 種 を 必 要 と す る た め 、副 作 用 な ど の 有 害 事 象 が 避 け ら れ な い 1 0 )_{。 し た が っ て 近 年 、 安 全 性 の 問 題 を 解 決 す べ く 、 サ ブ ユ ニ ッ ト ワ} ク チ ン の 研 究 開 発 が 必 要 と さ れ て い る 。

Tab le 1. Classif icatio n of vaccines

2 型 ま た は 皮 下 注 射 型 )の ワ ク チ ン は 、 全 身 性 (即 ち 血 中 循 環 中 )の 抗 原 特 異 的 な 免 疫 応 答 を 誘 導 す る こ と で 、感 染 に 伴 う 病 原 微 生 物 の 体 内 か ら の 排 除 と 病 態 悪 化 の 抑 制 を 可 能 と し て い る 1 1 )_{。 し か し な が ら 、 従 来 型 ワ ク チ ン は 多 く の 病 原 微 生 物} の 侵 入 経 路 あ る い は 感 染 部 位 で あ る 粘 膜 面 で の 抗 原 特 異 的 免 疫 誘 導 能 が 低 い た め 、病 原 微 生 物 の 侵 入 を 阻 害 、つ ま り 感 染 そ の も の を 抑 え る と い う 観 点 で の 防 御 効 果 は 期 待 で き な い 。言 い 換 え る と 、既 存 の ワ ク チ ン は 感 染 成 立 後 の 防 御 効 果 し か 期 待 で き な い と い う 重 大 な 欠 陥 を 内 包 し て い る 1 1 )_。 こ の よ う な 背 景 か ら 、粘 膜 面 に お い て 抗 原 特 異 的 な 免 疫 応 答 を 誘 導 可 能 な 粘 膜 ワ ク チ ン が 次 世 代 の 感 染 症 克 服 法 と し て 有 望 視 さ れ て い る 。粘 膜 ワ ク チ ン は 、経 口 、経 鼻 、経 肛 門 、舌 下 ま た は 点 眼 な ど 様 々 な 経 路 を 用 い て 経 粘 膜 的 に ワ ク チ ン を 接 種 す る シ ス テ ム で あ り 、全 身 面 だ け で な く 粘 膜 面 に お い て も 免 疫 応 答 を 誘 導 可 能 な 利 点 を 有 し て い る 。 従 っ て 粘 膜 ワ ク チ ン は 、 従 来 型 の ワ ク チ ン と 比 較 し 、 粘 膜 面 を 介 し て 感 染 が 成 立 す る 多 く の 病 原 体 に 対 し て 絶 大 な 効 果 が 期 待 で き る 1 1_{。ま た 、注 射 型 の ワ ク チ ン と は 異 な り 注 射 針 が 不 要 な 非 侵 襲 的 投 与 法 で あ る た} め 、医 師 で な く と も 接 種 が 可 能 で あ る 。さ ら に 、医 療 廃 棄 物 が 少 な い な ど 実 用 面 か ら も 利 点 が 多 い 1 2 )_{(Table 2 )。}

Tab le 2. Comparison of co nventio nal vac cine with muco sal vaccine.

3

連 リ ン パ 組 織 (gut-associated lymphoid tissue; GALT) や 鼻 腔 関 連 リ ン パ 組 織 (nasop harynx -asso ciated lymp hoid tissue; N ALT) な ど が 知 ら れ て い る 1 4 )_{。 こ れ ら} MALT 上 皮 細 胞 層 に は 管 腔 に 存 在 す る 分 子 の 取 込 を 担 う M 細 胞 が 存 在 し 、 粘 膜 基 底 膜 側 に 存 在 す る 樹 状 細 胞 へ 抗 原 を 受 け 渡 す こ と で 抗 原 特 異 的 免 疫 応 答 が 誘 導 さ れ る 。 こ こ で は 、 レ チ ノ イ ン 酸 、 interleukin (IL)-4 や transforming growth facto r (TG F) - な ど に よ り IgA 陽 性 B 細 胞 へ の ク ラ ス ス イ ッ チ が 誘 導 さ れ る 。 こ の IgA 陽 性 B 細 胞 は 、 粘 膜 免 疫 循 環 帰 巣 経 路 (common mucosal immune system; CM IS) に よ り 腸 間 膜 リ ン パ 節 を 介 し 血 液 循 環 に 移 行 を 経 て 全 身 の 粘 膜 固 有 層 へ 分 布 さ れ る 。粘 膜 固 有 層 に 達 し た IgA 陽 性 B 細 胞 は 、IL-5 や IL-6 な ど に よ り IgA 陽 性 形 質 細 胞 へ 分 化 し 、 粘 膜 面 に IgA を 産 生 す る 1 5 )_{。 こ れ ら の 特 徴 的 な 性 質 に} よ り 、例 え ば 経 鼻 投 与 ワ ク チ ン で あ っ て も 全 身 の 粘 膜 面 に 抗 原 特 異 的 免 疫 応 答 を 誘 導 で き る 。

Figure 1. Ind uctio n of IgA antibod y o n muco sa.

4

Escherichia coli (E. coli) heat-labile toxin が あ り 、 強 力 に 粘 膜 免 疫 を 賦 活 化 す る こ

と が 知 ら れ て い る 1 8 - 2 0 )_{。 こ れ ら は 病 原 体 由 来 の 毒 素 で あ る た め 、 そ の 毒 性 を 回} 避 す る た め の 変 異 体 が 開 発 さ れ て い る 1 8 , 1 9 )_{。 ま た 、 代 表 的 な 自 然 免 疫 受 容 体 で} あ る toll-like receptors (TLRs)リ ガ ン ド を 粘 膜 ア ジ ュ バ ン ト と し て 応 用 し た も の に CpG oligodeoxynucleotides (CpG ODN) 、 polyinosinic-polycytidylic acid sodium salt (poly(I:C ))、 f lagellin な ど が 報 告 さ れ て い る 2 1 , 2 2 )_{。 一 方 、 粘 膜 樹 状 細 胞 へ の} 抗 原 送 達 を 利 用 し た 粘 膜 ワ ク チ ン シ ス テ ム で は 、病 原 体 が 粘 膜 下 へ 侵 入 す る 際 に 用 い る 分 子 を 利 用 す る 方 法 が 考 案 さ れ て い る 。 例 え ば 、 Clostridium perfringens enterotox in を 抗 原 と の 融 合 蛋 白 質 と し て 発 現 さ せ 、 経 粘 膜 投 与 す る こ と に よ り 、 粘 膜 樹 状 細 胞 へ の 抗 原 送 達 を 介 し た 粘 膜 免 疫 更 新 作 用 が 報 告 さ れ て い る 2 3 )_{(Tab le 3)。 し か し な が ら 、 こ れ ら 両 者 の 方 法 論 は 共 に 、 病 原 体 由 来 の 分 子 を 利} 用 し て い る が た め 、臨 床 応 用 を 考 え た 際 に 抗 原 性 あ る い は 副 作 用 等 の 問 題 が 懸 念 さ れ て い る 。こ の よ う な 背 景 か ら 、サ ブ ユ ニ ッ ト 型 粘 膜 ワ ク チ ン の 開 発 は 難 し い の が 現 状 で あ る 。従 っ て 、安 全 か つ 効 果 的 な 粘 膜 ワ ク チ ン シ ス テ ム の 開 発 は 、感 染 症 予 防 あ る い は 治 療 の 観 点 か ら 社 会 的 な ニ ー ズ が 高 い 。

Tab le 3. Vario us m uco sal adjuvant

5 び 全 身 の 両 面 に お い て 抗 原 特 異 的 な 免 疫 応 答 を 誘 導 可 能 で あ る こ と を 明 ら か に し て き た 。 こ の 粘 膜 ワ ク チ ン シ ス テ ム は 、 マ ウ ス in vivo に お い て 顕 著 な 炎 症 あ る い は 体 重 減 少 な ど の 毒 性 を 示 さ な い な ど 安 全 性 も 担 保 さ れ る こ と を 確 認 し て い る 2 4 , 2 5 )_{(Figure 2 )。} し か し な が ら 、正 電 荷 リ ポ ソ ー ム の 有 す る 粘 膜 ア ジ ュ バ ン ト 活 性 の 詳 細 は 活 性 発 現 機 構 お よ び 実 際 に 本 粘 膜 ワ ク チ ン シ ス テ ム が 感 染 防 御 能 を 有 す る か に つ い て は 未 解 明 で あ る 。し た が っ て 、正 電 荷 リ ポ ソ ー ム の 有 す る 粘 膜 ア ジ ュ バ ン ト 活 性 の 発 現 機 構 を 解 明 す る こ と で 、非 病 原 体 成 分 を 用 い た 効 果 的 か つ 高 安 全 性 を 併 せ も っ た サ ブ ユ ニ ッ ト 型 粘 膜 ワ ク チ ン シ ス テ ム の 感 染 症 へ の 臨 床 応 用 へ の 道 が 拓 け る と 考 え ら れ る 。 そ こ で 本 研 究 で は 、正 電 荷 リ ポ ソ ー ム の 経 鼻 投 与 に よ る 粘 膜 お よ び 全 身 免 疫 の 賦 活 化 機 構 の 解 明 を 目 指 し 、自 然 免 疫 の 活 性 化 お よ び 抗 原 分 子 の 抗 原 提 示 細 胞 へ の 送 達 効 率 の 両 面 か ら の 検 討 を 行 っ た 。さ ら に 、正 電 荷 リ ポ ソ ー ム を 用 い た 粘 膜 ワ ク チ ン シ ス テ ム の 感 染 症 へ の 有 用 性 を 明 ら か に す る こ と を 目 的 と し た 。 本 博 士 論 文 は 、第 一 章「 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム の 有 す る 粘 膜 ア ジ ュ バ ン ト 活 性 に お け る 障 害 関 連 性 分 子 の 関 与 」、 第 二 章 「 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム に よ る 抗 原 提 示 細 胞 へ の 抗 原 送 達 効 率 の 増 強 効 果 」お よ び 第 三 章「 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム を 用 い た 経 鼻 粘 膜 投 与 型 肺 炎 球 菌 ワ ク チ ン の 開 発 」 に よ り 構 成 さ れ て い る 。

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略 語 一 覧

ABC ; ATP -bind ing cassette BSA; Bo vine serum alb um in CLR s; C -typ e lectin recepto r s

CM IS; Commo n m uco sal imm une system CpG-ODN ; CpG o ligod eox ynucleotid e

DAMPs; D am age-associated molecular pattern s

DC-cholesterol; 3β-[N -(N ',N '-d im ethylam inoethane) -carb amo yl] DOTAP ; 1,2-d ioleo yl-3 -trim ethylamm onium -p ropane

E.coli; E scherichia coli

ELISA; Enzym e-linked imm unoso rb ent assay FITC; Fluo rescein iso thio cyanate

GALT; G ut-associated lymp hoid tissue dsDN A; Do uble-stranded D N A

IFN; Interf eron

Irf3 ; Interfero n respo nse f acto r 3 IgA; Im muno globulin A

IgG; Im muno globulin G IL-4 ; Interleukin-4 IL-6 ; Interleukin-6 IL-17 A; Interleukin-17 A

MALT; M uco sa-associated lymp hoid tissue MMP; Matrix m etallop roteinase

NALT; N asal -asso ciated lympho id tissue

NLR s; N ucleo tid e -bind ing domain leucine -rich repeat p rotein OVA; O valbum in

PBS; P hosp hate -b uffered saline

poly (I: C); Po lyino sinic -polycytid ylic acid sod ium salt PRRs; P attern recognitio n recep to r

Psp A; Pneumo co ccal surface antigen A

RLR s; R etinoic acid -ind ucib le gene I l ike Recep tor Tf h ; T follicular helper

TLR s; Toll-like recep tor

7 実 験 の 部 1) 実 験 材 料 1-1) 実 験 動 物 ・ SPF 雌 性 BALB/c マ ウ ス は 、 日 本 SLC よ り 購 入 し 実 験 に 使 用 し た 。 1-2) 細 胞 種 ・ DC2.4 は 、 医 科 学 研 究 所 か ら 購 入 し 実 験 に 使 用 し た 。 1-3) 試 薬 1-3-1 ) 抗 体

・ Goat anti-mouse IgG(H+L), human ads-HRP（ Southern Biotech） ・ Goat anti-mouse IgG1, human ads-HRP（ Southern Biotech） ・ Goat anti-mouse IgG2a, human ads-HRP（ Southern Biotech） ・ Goat anti-mouse IgA-HRP（ Southern Biotech）

・ Anti-CD11c antibody (BD Biosciences)

1-3-2 ) 各 種 試 薬

・ DOTAP (Avanti Polar Lipids)

・ DC-Cholesterol (Avanti Polar Lipids) ・ Sodium nitroprusside (Sigma-Aldrich) ・ ク ロ ロ ホ ル ム (WAKO)

・ D-PBS (-) (WAKO)

・ オ ボ ア ル ブ ミ ン 低 エ ン ド ト キ シ ン (WAKO) ・ DNaseⅠ (Roche)

・ TMB microwell peroxidase substrate (KPL Inc.) ・ 生 理 食 塩 水 (大 塚 製 薬 )

・ ポ リ オ キ シ エ チ レ ン (20) ソ ル ビ タ ン モ ノ オ レ エ ー ト (Tween 20) (WAKO) ・ 10× Red blood cell lysis buffer (BioLe gend)

・ 注 射 用 水 (大 塚 製 薬 )

・ 7-AAD viability staining solution (Biolegend)

・ Fc block reagent (anti-mouse CD16/CD32) (TONBO) ・ 分 子 生 物 学 的 用 水 (Merck)

8 ・ ミ ダ ゾ ラ ム （ サ ン ド ） ・ ブ ト ル フ ァ ノ ー ル 酒 石 酸 塩 （ WAKO） ・ ア ン チ セ ダ ン (日 本 全 薬 工 業 ) ・ 塩 化 ナ ト リ ウ ム (WAKO) ・ 塩 化 カ リ ウ ム (関 東 化 学 ) ・ リ ン 酸 二 水 素 カ リ ウ ム (WAKO) ・ リ ン 酸 水 素 ナ ト リ ウ ム (VETEC) ・ 炭 酸 水 素 ナ ト リ ウ ム (WAKO) ・ 炭 酸 ナ ト リ ウ ム (WAKO)

・ Albumin from bovine serum, cohn fraction V, pH 7.0 (BSA) (WAKO) ・ リ ン 酸 (WAKO)

・ Chlorpromazine (Sigma-Aldrich ) ・ ゲ ニ ス テ イ ン (WAKO)

・ Methyl--cyclodextrin (Sigma-Aldrich) ・ Amiloride (Cayman Chemical Company) ・ Cytochalasin D (Sigma-Aldrich )

・ FITC-I (DOJINDO)

・ Alexa fluor 488-OVA (Life Technologies) ・ HW55 カ ラ ム (TOSOH)

・ 無 水 DMSO (WAKO)

1-3-3 ) そ の 他

・Nunc™ cell-culture treated m ultidishes (Thermo scientific)

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2) 実 験 方 法

2-1 第 一 章 の 実 験 方 法

2-1-1 ) 投 与 用 5 mg/m L OVA ス ト ッ ク 溶 液 の 調 整

OVA (Sigm a-Aldrich)を 秤 量 し 、 D-P BS ( -) (WAKO） 上 に 移 し 、 4°C で 一 晩 静 置 し た 。 そ の 後 、 0.22 µm シ リ ン ジ フ ィ ル タ ー (Membrane Solutions)で フ ィ ル タ ー 滅 菌 し 、 使 用 前 ま で -20°C で 保 管 し た 。

2-1-2 ) 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム お よ び DiI 修 飾 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム 調 整 方 法

10 2-1-5 ) 鼻 腔 洗 浄 液 回 収 法 及 び 調 整 法 マ ウ ス を ジ エ チ ル エ ー テ ル に て 屠 殺 し 、 断 頭 し 下 顎 を 切 除 し た 。 気 道 部 よ り 26G 注 射 針 (TERUMO )を つ け た 1 mL 注 射 筒 内 の PBS 250 µl を 流 出 し 、エ ッ ペ ン に 回 収 し た 。 回 収 し た 溶 液 を 3000 g、 10 分 遠 心 し 、 上 清 を 回 収 し 、 鼻 腔 洗 浄 液 と し た 。 2-1-6 ) 肺 胞 洗 浄 液 回 収 法 及 び 調 整 法 マ ウ ス を ジ エ チ ル エ ー テ ル に て 屠 殺 し 、 頸 部 を 切 開 し 、 気 道 を 漏 出 さ せ た 後 、 気 道 に 切 り 込 み を 入 れ た 。先 端 に 1000 µl 用 チ ッ プ の 上 か ら 200 µl 用 チ ッ プ を 装 着 し た ピ ペ ッ タ ー を 切 り 込 み に 挿 入 し 、 1 ml PBS で 10 回 ピ ペ ッ テ ィ ン グ し 、 エ ッ ペ ン に 回 収 し た 。 回 収 し た 溶 液 を 3000 g、 10 分 遠 心 し 、 上 清 を 回 収 し 、 肺 胞 洗 浄 液 と し た 。 2-1-7 ) 膣 洗 浄 液 回 収 法 及 び 調 整 法 マ ウ ス を ジ エ チ ル エ ー テ ル に て 屠 殺 し 、 膣 に 200 µl 用 チ ッ プ を 装 着 し た ピ ペ ッ タ ー を 挿 入 し 、 PBS 100 µl で 10 回 ピ ペ ッ テ ィ ン グ し エ ッ ペ ン に 回 収 し た 。 こ れ を 2 回 繰 り 返 し た 。 回 収 溶 液 を 14000 rpm、 5 分 、 4°C で 遠 心 し 、 上 清 を 回 収 し 、 膣 洗 浄 液 と し た 。

2-1-8 ) E LISA 法 に よ る 抗 原 特 異 的 IgG, IgA 産 生 の 測 定

Sodium b icarbo nate b uffer (pH 9.5 ) で そ れ ぞ れ 25 µg/m l に 希 釈 し た OVA を ELISA 用 プ レ ー ト の 各 well に 50 µl ず つ 加 え 、4°C で 1 晩 放 置 し 、抗 原 を プ レ ー ト に 固 相 化 し た 。 各 well を PBST で 3 回 洗 浄 し 、 過 剰 の 抗 原 を 除 去 後 、 1% BSA-PB ST 200 µl で 37°C に て 1 時 間 以 上 ブ ロ ッ キ ン グ し た 。 各 well を PBST で 3 回 洗 浄 後 、 1% BSA-PB ST で 段 階 希 釈 し た 血 清 ま た は 粘 膜 洗 浄 液 を 50 µl 加 え 、 4°C で 1 晩 放 置 し 、 抗 原 特 異 的 な 抗 体 を プ レ ー ト に 固 定 し た 抗 原 と 反 応 さ せ た 。 各 well を PBST で 4 回 洗 浄 後 、1% BSA-PBST で 4000 倍 希 釈 し た goat anti-mouse IgG, human ad s -HRP、 も し く は goat anti -mo use IgG1, h um an ad s-H RP、 も し く は go at anti-mo use IgG2 a, human ad s-HRP 、 も し く は goat anti-mouse IgA, hum a n ads-HR P の い ず れ か を 50 µl ず つ 加 え 、37°C で 1 時 間 反 応 さ せ た 。各 well を PB ST で 5 回 洗 浄 後 、 TMB 試 薬 を 50 µl 加 え 、 10 分 間 反 応 さ せ た 後 、 1 N リ ン 酸 溶 液 を 50 µl ず つ 加 え 反 応 を 停 止 し 、 450 nm お よ び 650 nm の 吸 光 度 を 測 定 し た 。

11 BALB /c マ ウ ス 1 匹 あ た り 200 µl の 三 種 混 合 麻 酔 を 腹 腔 内 投 与 し た 。片 鼻 に つ き 5 µl (200 nmol) ず つ 、計 10 µl (400 nmol) の 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム ま た は コ ン ト ロ ー ル と し て D-PBS (-) を 経 鼻 投 与 し た 。 そ の 直 後 に 片 鼻 に つ き 1.5 µl (1.25 µg)ず つ 、 計 3 µl (2.5 µg) の OVA を 経 鼻 投 与 し た 。 投 与 終 了 後 、 メ デ ト ミ ジ ン 拮 抗 薬 を 200 µl ず つ 腹 腔 内 投 与 し た 。 2-1-10 ) 鼻 粘 膜 組 織 の 回 収

マ ウ ス を 頸 椎 脱 臼 で 屠 殺 し 、 NALT 及 び nasal Passage を 5 ml の PBS が 入 っ た 60 mm dish (Thermo )に 採 取 し た 。 ア ル ミ メ ッ シ ュ で 濾 過 し 15 ml チ ュ ー ブ に 回 収 し た 。 再 度 PBS 5 ml で dish を 洗 浄 し 、 同 様 な 方 法 で チ ュ ー ブ に 回 収 し 、 鼻 腔 粘 膜 組 織 溶 液 と し て 実 験 に 用 い た 。

2-1-11 ) flo w cytom etry を 用 い た 鼻 腔 粘 膜 組 織 中 の 死 細 胞 測 定

15 ml チ ュ ー ブ に 回 収 し た 鼻 腔 粘 膜 組 織 溶 液 を 4°C, 1500 g で 5 分 間 遠 心 分 離 後 、 上 清 を 捨 て た 。 タ ッ ピ ン グ し 、 ACK lysing buffer を 1 ml 加 え た 直 後 に PBS を 加 え た 。 4°C, 1500 g で 5 分 間 遠 心 分 離 後 、 上 清 を 捨 て た 。 タ ッ ピ ン グ し 、 10 ml の PBS を 加 え 、 4°C, 1500 g で 5 分 間 遠 心 分 離 後 、 上 清 を 捨 て た 。 タ ッ ピ ン グ し 、 500 l の PB S で 再 懸 濁 し た の ち 、 ナ イ ロ ン メ ッ シ ュ を 用 い て 濾 液 を エ ッ ペ ン に 回 収 し た 。 7-AAD を 5 l 加 え 、 5 分 後 に FACS canto II (BD Biosciences)を 用 い て 死 細 胞 を 測 定 し た 。

2-1-12 ) Ho echst 33258 を 用 い た ゲ ノ ム DNA の 定 量 法

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に て 屠 殺 し 、 断 頭 し 下 顎 を 切 除 し た 。 気 道 部 よ り 26G 注 射 針 (TERUMO)を つ け た 1 mL 注 射 筒 内 の PBS 250 µl を 流 出 し 、エ ッ ペ ン に 回 収 し た 。回 収 し た 溶 液 を 3000 g、10 分 遠 心 し 、上 清 を 回 収 し 、鼻 腔 洗 浄 液 と し 、15 ml チ ュ ー ブ に 1 g/m l と な る よ う 1 mg/ml hoechst、 10×tris-EDTA-natrium buffer、 分 子 生 物 学 的 用 水 を 入 れ た 。 こ の 溶 液 を 1 well あ た り 200l 添 加 し た 。 ス タ ン ダ ー ド と し て 付 属 の 標 品 DNA を 20 ng, 50 ng, 100 ng, 200 ng, 500 ng, 1000 ng と な る よ う 添 加 し た 。 2-2-5 )の 方 法 で 回 収 し た 鼻 腔 洗 浄 液 を 1 well あ た り 10 l 添 加 し た 。 遮 光 し 1 時 間 振 盪 後 、 460 nm に お け る 吸 光 度 を マ イ ク ロ プ レ ー ト リ ー ダ ー で 測 定 し 、 ゲ ノ ム DNA の 定 量 を 行 っ た 。

2-1-14 ) N ucleo Sp in Tissue を 用 い た ゲ ノ ム DNA 精 製

13 気 道 部 よ り 26G 注 射 針 (TERUMO)を つ け た 1 mL 注 射 筒 内 の PBS 250 µl を 流 出 し 、エ ッ ペ ン に 回 収 し た 。回 収 し た 溶 液 を 3000 g、10 分 遠 心 し 、上 清 を 回 収 し 、 鼻 腔 洗 浄 液 と し た 。ま た 、頸 部 を 切 開 し 、気 道 を 漏 出 さ せ た 後 、気 道 に 切 り 込 み を 入 れ た 。先 端 に 1000 µl 用 チ ッ プ の 上 か ら 200 µl 用 チ ッ プ を 装 着 し た ピ ペ ッ タ ー を 切 り 込 み に 挿 入 し 、 1 ml PBS で 10 回 ピ ペ ッ テ ィ ン グ し 、 エ ッ ペ ン に 回 収 し た 。 回 収 し た 溶 液 を 3000 g、 10 分 遠 心 し 、 上 清 を 回 収 し 、 肺 胞 洗 浄 液 と し た 。 ま た 、 マ ウ ス を ジ エ チ ル エ ー テ ル に て 屠 殺 し 、 膣 に 200 µl 用 チ ッ プ を 装 着 し た ピ ペ ッ タ ー を 挿 入 し 、PBS 100 µl で 10 回 ピ ペ ッ テ ィ ン グ し エ ッ ペ ン に 回 収 し た 。 こ れ を 2 回 繰 り 返 し た 。 回 収 溶 液 を 14000 rpm、 5 分 、 4°C で 遠 心 し 、 上 清 を 回 収 し 、 膣 洗 浄 液 と し た 。 回 収 し た 血 清 及 び 粘 膜 洗 浄 液 中 の IgG 抗 体 及 び IgA 抗 体 の 抗 体 価 を 算 出 し た 。 2-1-16 ) DN ase I 処 理 併 用 時 の 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム と OVA 経 鼻 投 与 に お け る 血 清 中 の IgG 抗 体 産 生 及 び 各 粘 膜 洗 浄 液 中 の IgA 抗 体 産 生

2-1-9 )の 方 法 で 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム を 経 鼻 投 与 し た 。 こ れ を day 0, day 7, day 14 で 行 い 、day 21 に マ ウ ス を ジ エ チ ル エ ー テ ル に て 屠 殺 し 、心 臓 採 血 に よ り 血 液 を 回 収 し た 。回 収 し た 血 液 を 、室 温 で 30 分 、氷 上 で 60 分 静 置 後 、3000 g、10 分 遠 心 し 、 上 清 を 回 収 し 、 血 清 サ ン プ ル と し た 。 ま た 、 気 道 部 よ り 26G 注 射 針 (TERUMO )を つ け た 1 m L 注 射 筒 内 の PBS 250 µ l を 流 出 し 、エ ッ ペ ン に 回 収 し た 。 回 収 し た 溶 液 を 3000 g、10 分 遠 心 し 、上 清 を 回 収 し 、鼻 腔 洗 浄 液 と し た 。ま た 、 頸 部 を 切 開 し 、 気 道 を 漏 出 さ せ た 後 、 気 道 に 切 り 込 み を 入 れ た 。 先 端 に 1000 µl 用 チ ッ プ の 上 か ら 200 µl 用 チ ッ プ を 装 着 し た ピ ペ ッ タ ー を 切 り 込 み に 挿 入 し 、1 ml PB S で 10 回 ピ ペ ッ テ ィ ン グ し 、エ ッ ペ ン に 回 収 し た 。回 収 し た 溶 液 を 3000 g、 10 分 遠 心 し 、 上 清 を 回 収 し 、 肺 胞 洗 浄 液 と し た 。 ま た 、 マ ウ ス を ジ エ チ ル エ ー テ ル に て 屠 殺 し 、 膣 に 200 µl 用 チ ッ プ を 装 着 し た ピ ペ ッ タ ー を 挿 入 し 、 PBS 100 µl で 10 回 ピ ペ ッ テ ィ ン グ し エ ッ ペ ン に 回 収 し た 。 こ れ を 2 回 繰 り 返 し た 。 回 収 溶 液 を 14000 rpm、 5 分 、 4°C で 遠 心 し 、 上 清 を 回 収 し 、 膣 洗 浄 液 と し た 。 回 収 し た 血 清 及 び 粘 膜 洗 浄 液 中 の IgG 抗 体 及 び IgA 抗 体 の 抗 体 価 を 算 出 し た 。 2-1-17 ) 有 意 差 検 定

抗 体 産 生 の 有 意 差 は the Kruskal-Wallis with Dunn’s post -hoc test を 用 い て 検 定 し た 。 死 細 胞 、 dsDNA 産 生 の 有 意 差 は pair t-test を 用 い て 検 定 し た 。

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2-2-1 ) FITC-O VA の 精 製

pH 9 に 調 製 し た 炭 酸 バ ッ フ ァ ー に 50 mg/ml で 溶 解 さ せ た OVA (sigm a) と 無 水 DMSO に 5 m g/ml で 溶 解 さ せ た FIT C-I (DOJ INDO )を 10:1 と な る よ う に 混 合 し 、 4°C で 一 晩 静 置 し た 。そ の 後 、HW55 カ ラ ム (TO SOH )を 用 い て サ イ ズ 排 除 ク ロ マ ト グ ラ フ ィ ー に て 未 結 合 の OVA と FITC 結 合 OVA を 分 離 精 製 し た 。

2-2-2 ) フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー を 用 い た in vitro に お け る 抗 原 取 り 込 み

DC2.4 細 胞 を 5× 104 _{cells/m l で 24 well plate に 播 種 し 、 1 日 後 、 正 電 荷 リ ポ ソ} ー ム 20 nmol/ml 添 加 し た の ち 、 1 分 後 に FITC-OVA 50 µg/ml で 添 加 し 、 37°C、 CO2 5%で 1 時 間 相 互 作 用 さ せ た 。 そ の 後 、 100 µg/m l heparin in PB S 5 00 µl で 2 回 洗 浄 し た 後 、 0.1 mM EDTA in PBS を 1 分 間 反 応 さ せ 、 細 胞 を シ ン グ ル セ ル と し た 。 そ の 後 、 RPMI 1640 1ml 加 え 、 細 胞 を 回 収 し た 。 回 収 し た 細 胞 を 4°C で 、 1500 rpm、5 分 間 遠 心 し 、上 清 を 取 り 除 き 、タ ッ ピ ン グ 後 、再 度 100 µg/ml hep arin in PB S 500 µ l 加 え 、 4°C で 、 1500 rpm、 5 分 間 遠 心 し た 。 こ れ を 2 回 繰 り 返 し 、 PBS 500 µl に 再 懸 濁 し 、FAC S canto II (B D Bio sciences )に て 蛍 光 強 度 を 測 定 し た 。

2-2-3 ) 共 焦 点 顕 微 鏡 に よ る 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム と 抗 原 の 局 在

DC2.4 細 胞 を 4× 104 _{cells/m l で 24 well p late 内 の PLL コ ー ト ガ ラ ス プ レ ー ト 上} に 播 種 し 、 1 日 後 、 で 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム 20 nmol/ml 添 加 し た の ち 、 1 分 後 に FITC-OVA 50 µg/m l で 添 加 し 、 37°C、 CO2 5%で 1 時 間 相 互 作 用 さ せ た 。 そ の 後 、 100 µg/m L hep arin in PB S 500 µ l で 2 回 洗 浄 し た 後 、 4% PFA 1m l 加 え 、 4°C で 1 時 間 固 定 し た 。再 度 、100 µg/ml heparin in PBS で 2 回 洗 浄 し 、ス ラ イ ド ガ ラ ス に 1 g/m l D AP I co nta ining 90% glycerol in PB S で 核 を 染 色 し 、 ト ッ プ コ ー ト で 固 定 し 、 共 焦 点 レ ー ザ ー 顕 微 鏡 (FV1000D; Olympus)で 観 察 し た 。

2-2-4 ) 阻 害 剤 を 用 い た 取 り 込 み 経 路 の 特 定

15 ま た 、 細 胞 の 活 動 を 停 止 さ せ る た め 4°C で 1 時 間 同 様 に 作 用 さ せ た 。 そ の 後 、 100 µg/m l heparin in PB S 500 µl で 2 回 洗 浄 し た 後 、 0.1 mM EDTA in PBS を 1 分 間 反 応 さ せ 、 細 胞 を シ ン グ ル セ ル と し た 。 そ の 後 、 RPMI 1640 1ml 加 え 、 細 胞 を 回 収 し た 。 回 収 し た 細 胞 を 1500 rpm、 4°C、 5 分 遠 心 し 、 上 清 を 取 り 除 き 、 タ ッ ピ ン グ 後 、 再 度 100 µg/ml heparin in PBS 500 µl 加 え 、 4°C で 、 1500 rpm、 5 分 間 遠 心 し た 。 こ れ を 2 回 繰 り 返 し 、 PBS 500 µl に 再 懸 濁 し 、 FACS canto II (BD)に て 各 蛍 光 強 度 を 測 定 し た 。 2-2-5 ) フ ロ ー サ イ ト メ ト リ ー を 用 い た 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム と 抗 原 の 存 在 状 況 に よ る 抗 原 取 り 込 み 増 強 効 果 の 変 化

DC2.4 細 胞 を 5× 104 _{cells/m L で 24 well p late に 播 種 し 、 1 日 後 、 正 電 荷 リ ポ ソ} ー ム と OVA 非 共 存 在 下 条 件 と し て 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム を 20 nmol/ml で 添 加 し 、 37°C、 CO2 5%で 4 時 間 相 互 作 用 さ せ 、 培 地 交 換 し て か ら FITC-OVA 5 0 µg/m l で 添 加 し 37°C、CO2 5%で 4 時 間 相 互 作 用 さ せ た 。 ま た 、 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム と OVA 共 存 在 下 条 件 と し て PBS を 添 加 し 37°C、CO2 5%で 4 時 間 相 互 作 用 さ せ 、培 地 交 換 し て か ら 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム 20 nmol/ml で 添 加 し た の ち 、1 分 後 に FITC-OVA 50 µg/m L で 添 加 し 、 37°C、 CO2 5%で 4 時 間 相 互 作 用 さ せ た 。 そ の 後 、 100 µg/m L heparin in PB S 500 µl で 2 回 洗 浄 し た 後 、0.1 mM EDTA in PB S を 1 分 間 反 応 さ せ 、 細 胞 を シ ン グ ル セ ル と し た 。 そ の 後 、 RPMI 1640 1ml 加 え 、 細 胞 を 回 収 し た 。 回 収 し た 細 胞 を 4°C で 、 1500 rpm、 5 分 遠 心 し 、 上 清 を 取 り 除 き 、 タ ッ ピ ン グ 後 、 再 度 100 µg/mL heparin in PBS 500 µl 加 え 、 4°C で 、 1500 rpm、 5 分 間 遠 心 し た 。 こ れ を 2 回 繰 り 返 し 、 PBS 500 µl に 再 懸 濁 し 、 FACS canto II (BD Biosciences)に て 蛍 光 強 度 を 測 定 し た 。 各 取 り 込 み 量 を OVA 単 独 群 で 割 っ た 値 を 算 出 し 、 評 価 し た 。

2-2-6 ) 共 焦 点 顕 微 鏡 を 用 い た 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム と 抗 原 の 存 在 状 況 に よ る 抗 原 取 り 込 み 増 強 効 果 の 変 化

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1ml 加 え 、4°C で 1 時 間 固 定 し た 。再 度 、100 µg/m l hep arin in PB S で 2 回 洗 浄 し 、 ス ラ イ ド ガ ラ ス に 1 g/ml DAPI containing 90% glycerol in PBS で 核 を 染 色 し 、 ト ッ プ コ ー ト で 固 定 し 、 共 焦 点 レ ー ザ ー 顕 微 鏡 (FV1000D; Olympus)で 観 察 し た 。

2-2-7 ) 有 意 差

毒 性 検 討 は 、 one-way ANOVA with Bonferroni’s post -hoc test を 用 い 、 細 胞 内 取 り 込 み に 関 す る 検 討 は 、 unpaired t-test with Welch’s correction を 用 い て 有 意 差 を 算 定 し た 。

2-3 第 三 章 の 実 験 方 法 2-3-1 )感 染 実 験

肺 炎 球 菌 は 、 PspA フ ァ ミ リ ー 1 の ク レ ー ド 1、 2 を 発 現 し た A66.1 セ ロ タ イ プ 3 の 肺 炎 連 鎖 球 菌 を 用 い 、PBS で 希 釈 し た 。PBS 群 、Psp A 単 独 群（ Psp A 5g/ mo use）、 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム (400 nmol/ mouse)の 経 鼻 投 与 を day 0, day 7, day 14 で 行 い 、day 21 に 5.0 × 106 _{CFU / mo use で 上 気 道 感 染 さ せ 、 マ ウ ス の 生 存 率 を 14 日 間 観 察 し} た 。 2-3-2 ) 脾 臓 細 胞 回 収 マ ウ ス か ら 脾 臓 を 摘 出 し 、 5 ml の RPMI 1640 の 入 っ た 60 mm dish 内 で ス テ ン レ ス メ ッ シ ュ を 用 い て シ ン グ ル セ ル に し た 。そ の 後 、別 の ス テ ン レ ス メ ッ シ ュ を 通 し て 、 15 ml チ ュ ー ブ に 移 し た 。 再 度 、 60 mm dish に RPMI 1640 を 5 ml 加 え よ く 、ピ ペ ッ テ ィ ン グ し 、ス テ ン レ ス メ ッ シ ュ を 用 い て 同 じ 15 ml チ ュ ー ブ に 移 し た 。 1500 rpm、 4°C で 5 分 間 遠 心 し 、 上 清 を 捨 て 、 タ ッ ピ ン グ し た 。 赤 血 球 を 溶 血 さ せ る た め 、 ACK lysing buffer を 1 ml 加 え 、 1 分 後 に 9 ml の RPMI 1640 を 加 え た 。 次 に 、 1500 rpm、 4°C で 5 分 間 遠 心 し 、 上 清 を 捨 て 、 タ ッ ピ ン グ し 、 10 ml の RPM I 1640 を 加 え た 。再 度 、1500 rpm、4°C で 5 分 間 遠 心 し 、上 清 を 捨 て 、 タ ッ ピ ン グ し 、 5 ml の RPMI 1640 を 加 え 細 胞 懸 濁 液 を 、 脾 臓 細 胞 回 収 液 と し 実 験 に 使 用 し た 。

2-3-3 ) E LISA 法 を 用 い た サ イ ト カ イ ン 定 量

17 PBST で 4 回 洗 浄 し た 後 に 、 200 倍 に 希 釈 し た 各 detectio n antibod y を 25 l ず つ プ レ ー ト に 加 え 、室 温 で 1 時 間 反 応 さ せ た 。PBST で 4 回 洗 浄 し 、10% FCS in PBS で 1000 倍 に 希 釈 し た avidin-HRP を 25 l ず つ 加 え 、室 温 で 30 分 反 応 さ せ た 。そ の 後 、 PBST で 5 回 洗 浄 し 、 TMB 溶 液 を 50 l ず つ 加 え 、 遮 光 状 態 で 20-30 分 間 反 応 さ せ 、1N リ ン 酸 で 反 応 を 止 め た 。プ レ ー ト リ ー ダ ー を 用 い て 450 nm と 570 nm の 吸 光 度 を 測 定 し 、 定 量 し た 。

2-3-4 ) 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム と PspA 併 用 経 鼻 投 与 に よ る IL-4、 IL-17 A、 IL-6、 IN F-の 産 生

BALB /c マ ウ ス 一 匹 に 対 し 、200 l の 三 種 混 合 麻 酔 を 腹 腔 内 投 与 し た 。片 鼻 に つ き 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム を 5l (200 nmol) ず つ 、計 10 µl (400 nmol) ま た は コ ン ト ロ ー ル と し て D-PBS (-) を 経 鼻 投 与 し た 。 そ の 直 後 に 片 鼻 に つ き 1.5 l (2.5 µg) ず つ 、計 3 l (5 g) の PspA を 経 鼻 投 与 し た 。投 与 終 了 後 、メ デ ト ミ ジ ン 拮 抗 薬 を 200l ず つ 腹 腔 内 投 与 し た 。こ れ を 、day 0, day 7, day 14 で 行 い 、day 21 に 2-3-2) の 方 法 を 用 い て 脾 臓 細 胞 を 回 収 し た 。 脾 臓 細 胞 を 10％ FCS in RPMI 1640 で 4.4 ×106 _{cells /ml に 調 製 し 48 well p late に 450 µl で 播 種 し た 。 20 分 後 に 、 Psp A を 0} µg/ml, 0.5 µ g/ml, 1 µ g/m l, 10 µ g/m l と な る よ う 50 µl で 添 加 し た 。 そ の 後 、 37°C、 CO2 5%で 72 時 間 培 養 し 、1500 rpm、4°C で 5 分 間 遠 心 し た 細 胞 上 清 を 回 収 し た 。 回 収 し た 細 胞 上 清 を 2-3-3)の 方 法 で IL-4、 IL-17A、 IL-6、 INF-を 定 量 し た 。

18 回 収 し 、肺 胞 洗 浄 液 と し た 。ま た 、マ ウ ス を ジ エ チ ル エ ー テ ル に て 屠 殺 し 、膣 に 200 µl 用 チ ッ プ を 装 着 し た ピ ペ ッ タ ー を 挿 入 し 、 PBS 100 µl で 10 回 ピ ペ ッ テ ィ ン グ し エ ッ ペ ン に 回 収 し た 。 こ れ を 2 回 繰 り 返 し た 。 回 収 溶 液 を 14000 rpm、 5 分 、4°C で 遠 心 し 、上 清 を 回 収 し 、膣 洗 浄 液 と し た 。 回 収 し た 血 清 及 び 粘 膜 洗 浄 液 中 の IgG 抗 体 及 び IgA 抗 体 の 抗 体 価 を 算 出 し た 。 2-3-6 ) CD11 c+_{樹 状 細 胞 に お け る 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム 併 用 時 の PspA の 取 り 込 み} BALB /c マ ウ ス 一 匹 に 対 し 、200 l の 三 種 混 合 麻 酔 を 腹 腔 内 投 与 し た 。片 鼻 に つ き 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム を 5l (200 nmol) ず つ 、計 10 µl (400 nmol) ま た は コ ン ト ロ ー ル と し て D-PBS (-) を 経 鼻 投 与 し た 。 そ の 直 後 に 片 鼻 に つ き 3.2 l (25 µg) ず つ 、 計 6.4 l (50 g) の PspA を 経 鼻 投 与 し た 。 投 与 終 了 後 、 メ デ ト ミ ジ ン 拮 抗 薬 を 200l ず つ 腹 腔 内 投 与 し た 。 投 与 か ら 6 時 間 後 に 、 鼻 腔 組 織 を PBS の 入 っ た 60 mm dish 中 で 、 ス テ ン レ ス メ ッ シ ュ を 用 い て シ ン グ ル セ ル と し た 。 そ の 回 収 液 を 、ナ イ ロ ン メ ッ シ ュ を 通 し 、15 ml チ ュ ー ブ へ と 移 動 し た 。1500 rpm、4° C で 5 分 間 遠 心 し 、 上 清 を 除 去 後 、 タ ッ ピ ン グ し た 。 そ こ へ 、 ACK lysing b uffer を 1 ml 加 え 、 1 分 後 、 9 ml の PBS を 加 え た 。 1500 rpm、 4°C で 5 分 間 遠 心 し 、 上 清 を 除 去 後 、タ ッ ピ ン グ し た 。500 µl の 2% FBS and 0.09% azide in PBS を 加 え 、 1.5 ml チ ュ ー ブ へ 移 動 し た 。 1500 rpm、 4°C で 5 分 間 遠 心 し 、 上 清 を 除 去 後 、 タ ッ ピ ン グ し た 。 100 µl の 2% FBS and 0.09% azide in PBS で 再 懸 濁 し 、anti-mouse

CD16/CD32 を 1 µl 加 え 、 4°C で 30 分 反 応 さ せ た 。 そ の 後 、 50 µl ず つ に 分 け 、 そ

れ ぞ れ に APC-anti-mouse CD11c あ る い は APC armenian Hamster IgG を 1 µl 加 え た 。 4°C で 30 分 反 応 さ せ た 後 、 1500 g、 4°C で 30 秒 遠 心 し 、 上 清 を 除 去 し タ ッ ピ ン グ し た 。 2% FBS and 024424.09% azide in PBS を 500 µl 加 え 、 1500 g、 4°C で 30 秒 遠 心 し 、 上 清 を 除 去 し タ ッ ピ ン グ し た 。 こ れ を 3 回 繰 り 返 し た 細 胞 懸 濁 液 を FACS canto II (BD)を 用 い て 測 定 し た 。

2-3-7 ) 統 計 処 理

マ ウ ス 生 存 率 は 、 t-test with Welch's correctio n, and Mantel-Cox test を 用 い 、 サ イ ト カ イ ン 産 生 及 び 抗 体 産 生 の 検 討 で は 、Kruskal-Wallis with Dunn’s post-hoc test を 用 い て 、 PspA の 取 り 込 み は 、 student t test で 有 意 差 を 検 定 し た 。

2-4) 本 研 究 に よ る 法 令 等 の 遵 守 へ の 対 応

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22 第 三 節 ゲ ノ ム DNA 経 鼻 投 与 時 の 抗 体 産 生 第 一 項 血 清 中 IgG 抗 体 産 生 及 び 各 粘 膜 洗 浄 液 中 IgA 抗 体 産 生 BALB / c マ ウ ス に ゲ ノ ム DNA を 経 鼻 投 与 後 の 抗 体 産 生 に つ い て 検 証 し た 。 そ の 結 果 、ゲ ノ ム DNA 併 用 時 に お い て OVA 単 独 投 与 群 に 比 べ 抗 体 価 の 上 昇 が 認 め ら れ た が 、 ゲ ノ ム DNA の 増 加 と 比 例 し た 抗 体 価 の 上 昇 は 見 ら れ な か っ た 。 ゲ ノ ム DNA に よ る ア ジ ュ バ ン ト 効 果 は 、5ng と わ ず か な 量 で OVA 特 異 的 抗 体 価 の 誘 導 が 可 能 で あ っ た (Figure 6)。 第 四 節 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム の ア ジ ュ バ ン ト 効 果 に お け る ゲ ノ ム DNA の 関 与

第 一 項 DNase I 処 理 併 用 時 の 血 清 中 IgG 抗 体 産 生 及 び 各 粘 膜 洗 浄 液 中 IgA 抗 体 産 生

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Figure 3. Ind uctio n of OVA -specific serum IgG and m uco sal IgA respo nses in BALB /c mice im munized intranasally with OVA and catio nic liposom es.

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Figure 4. Ind uctio n of cell d eath in BALB /c m ice administered intranasally with catio nic liposom es after 6 hr.

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Figure 5. Tim e dep end ent change in leakage of genom ic DN A after intranasal catio nic lipo som es.

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Figure 6. Ind uctio n of OVA -specific serum IgG and m uco sal IgA respo nses in BALB /c mice im munized intranasally with OVA and genomic DN A (gDN A).

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Figure 7. Ind uctio n of OVA -specific serum IgG and nasal tissue IgA responses in BALB /c m ice imm unized intranasally with OVA and cationic lipo som e with DNase I.

28 3) 考 察 本 章 で は 、免 疫 学 的 な 観 点 か ら 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム が 持 つ ア ジ ュ バ ン ト 効 果 の 機 序 解 明 を 試 み た 。 第 一 節 で は 、 モ デ ル 抗 原 と し て OVA を 用 い 、 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム が 持 つ ア ジ ュ バ ン ト 効 果 に つ い て 確 認 し た 。 こ れ ま で の 研 究 と 同 様 に 、 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム と OVA の 併 用 経 鼻 投 与 に お い て 、 OVA 特 異 的 な 抗 体 産 生 の 上 昇 が 確 認 さ れ た 。 加 え て 、 投 与 部 位 と は 異 な る 肺 及 び 膣 に お い て も OVA 特 異 的 な IgA 抗 体 産 生 の 上 昇 が 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム と OVA の 併 用 経 鼻 投 与 群 に お い て 認 め ら れ た (Figure 3)。 投 与 部 位 と は 異 な る 部 位 で の IgA 抗 体 の 産 生 は 、粘 膜 免 疫 の 特 徴 の 一 つ で あ る 粘 膜 免 疫 帰 巣 経 路 を 介 し て 行 わ れ た と 考 え ら れ る 。鼻 腔 で は 、抗 原 の 取 り 込 み 部 位 で あ る 誘 導 組 織 と IgA 抗 体 を 産 生 す る 部 位 で あ る 実 行 組 織 が 別 々 の 場 所 に 存 在 す る 。そ の た め 、誘 導 組 織 で 抗 原 情 報 を 受 け 取 っ た 免 疫 担 当 細 胞 は 、パ イ エ ル 板 や 扁 桃 に お い て IgA+_{細 胞 を 刺 激 し 、 各 粘 膜 組 織 へ の ホ ー ミ ン グ に 必 要 な}47 イ ン テ グ リ ン を 発 現 し た 細 胞 へ と 変 化 し 、 各 粘 膜 の 実 行 組 織 へ と ホ ー ミ ン グ す る 。 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム を ア ジ ュ バ ン ト と し て 用 い た 場 合 に お い て も 、粘 膜 帰 巣 経 路 を 介 す る こ と が 可 能 で あ る と 示 さ れ た こ と で 、侵 襲 性 が 低 く 投 与 が 簡 便 な 経 鼻 投 与 を 用 い る こ と で 、鼻 腔 に お け る 感 染 を 防 ぐ だ け で な く 、膣 感 染 症 に 対 し て も 有 効 な 手 段 と な り う る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 第 二 節 で は 、 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム 経 鼻 投 与 に よ り ゲ ノ ム DNA が 誘 導 さ れ る の か に つ い て 検 討 し た 。 ア ジ ュ バ ン ト 効 果 を 示 す 投 与 量 で あ る 400 nmol で 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム を 経 鼻 投 与 す る と 6 時 間 後 に は 僅 か な 細 胞 死 が 誘 導 さ れ る (Figure 4)。 ま た 、 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム 投 与 後 3 時 間 後 か ら 16 時 間 後 に か け て ゲ ノ ム DNA の 漏 出 が 認 め ら れ た (Figure 5)。 こ れ ら の 知 見 か ら 、 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム に よ り 鼻 腔 粘 膜 に ご く わ ず か な 細 胞 障 害 が 誘 導 さ れ 、 そ の 結 果 ゲ ノ ム DNA が 細 胞 外 に 漏 出 し て く る こ と が 示 唆 さ れ た 。 第 三 節 で は 、 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム を 経 鼻 投 与 す る と ゲ ノ ム DNA が 漏 出 し て く る こ と か ら 、 こ の 漏 出 し て き た ゲ ノ ム DNA が ア ジ ュ バ ン ト 活 性 を 持 っ て い る の で は な い か と 仮 定 し 、 ゲ ノ ム DNA の ア ジ ュ バ ン ト 活 性 に つ い て 評 価 し た 。 ゲ ノ ム DNA を 経 鼻 投 与 す る と 血 清 中 IgG 抗 体 産 生 及 び 各 粘 膜 組 織 中 IgA 抗 体 産 生 も 共 に OVA 単 独 投 与 群 に 比 べ て 上 昇 し て い た (Figure 6)。 こ れ ら の 知 見 か ら 、 ゲ ノ ム DNA は ア ジ ュ バ ン ト 効 果 を 持 ち 、 ご く わ ず か な 5 ng で も 十 分 な 抗 体 産 生 を 誘 導 で き る こ と が 明 ら か と な っ た 。

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Figure 9. C ytotox icity of the catio nic liposom es o n DC2.4 cells.

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Figure 10. Antigen uptake b y D C2. 4 cells fo llo wing co -culture with the catio nic lipo som es.

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Figure 11. Effect of temp erature o n enhanced up take of FITC -OVA b y the cationic lipo som es.

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Figure 12. M echanism s of uptake of catio nic lipo som e by DC2.4 cells.

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Figure 13. M echanism s of uptake of FITC -OVA b y DC2.4 cells.

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Figure 14. Effect of various chemical inhibito rs of endocytic p athways o n enhancem ent

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Figure 15. Coex istence of FITC -OVA and the catio nic lipo som es is crucial for enhanced uptake of FITC -OVA.

44 2) 実 験 結 果 第 一 節 感 染 実 験 第 一 項 肺 炎 球 菌 感 染 防 御 効 果 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム と 肺 炎 球 菌 由 来 抗 原 で あ る PspA に よ る ワ ク チ ン 効 果 に つ い て 検 討 し た 。そ の 結 果 、あ ら か じ め 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム と PspA を 経 鼻 投 与 し た 群 に お い て 、 マ ウ ス 生 存 率 の 上 昇 が 認 め ら れ た (Figure 16)。 第 二 節 PspA と 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム 併 用 時 の 免 疫 応 答 第 一 項 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム と PspA 併 用 経 鼻 投 与 に よ る IL-4、IL-17A、IL-6、INF- の 産 生 肺 炎 球 菌 由 来 抗 原 で あ る PspA と 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム に よ る サ イ ト カ イ ン 誘 導 に つ い て 検 討 し た 。 そ の 結 果 、 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム と PspA を 経 鼻 投 与 し た 群 に お い て 、 IL-4、 IL-17A、 IL-6、 INF-の 産 生 上 昇 が 認 め ら れ た (Figure 17)。

第 二 項 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム と PspA 併 用 経 鼻 投 与 に よ る 血 清 中 IgG 抗 体 及 び 各 粘 膜 洗 浄 液 中 IgA 抗 体 産 生

正 電 荷 リ ポ ソ ー ム を 用 い て モ デ ル 抗 原 に 対 す る IgG 及 び IgA 抗 体 産 生 に つ い て 検 討 を 行 っ た 。 BALB/c マ ウ ス に PspA (5 g)と 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム (400 nmol) を day 0, 7, 14 に そ れ ぞ れ 経 鼻 投 与 し 、 day 21 に 、 血 清 及 び 鼻 腔 洗 浄 液 を 回 収 し た 。各 回 収 液 中 の PspA 特 異 的 抗 体 を ELISA 法 で 測 定 し 、endpoint 法 に て 抗 体 価 を 算 出 し た 。そ の 結 果 、正 電 荷 リ ポ ソ ー ム 併 用 群 に お い て 高 い 抗 体 産 生 が 認 め ら れ た (Figure 18)。

第 三 節 PspA の 樹 状 細 胞 へ の 取 り 込 み

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CD11c 陽 性 細 胞 に お け る FITC -P sp A の 取 り 込 み を flow cytom etry を 用 い て 評 価 し た 。 そ の 結 果 、 PspA 単 独 群 で は FITC-PspA 陽 性 の 細 胞 が 0.945%で あ っ た が 、 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム と PspA 併 用 群 で は 3.365%と 有 意 に 上 昇 し て い た (Figure 19 )。 3) 考 察 本 章 に お い て 、正 電 荷 リ ポ ソ ー ム と PspA を 併 用 す る こ と に よ り 疾 患 モ デ ル へ の 応 用 が 可 能 で あ る こ と が 示 さ れ た 。 第 一 節 に お い て 、 肺 炎 球 菌 感 染 モ デ ル に お い て 十 分 な 防 御 的 効 果 を 発 揮 し た 。 第 二 節 に お い て は 、Th1 サ イ ト カ イ ン の み な ら ず Th2 サ イ ト カ イ ン の 誘 導 も 増 強 さ せ る こ と が 明 ら か と な っ た 。正 電 荷 リ ポ ソ ー ム と PspA の 経 鼻 投 与 に よ り 誘 導 さ れ た IL-4 は 、 Th0 細 胞 を Th2 細 胞 へ の 分 化 を 誘 導 す る サ イ ト カ イ ン で あ り 、 IgA 産 生 を 増 強 さ せ 、 ま た 、 濾 胞 性 ヘ ル パ ー T 細 胞 （ T follicular help er cell ; Tf h 細 胞 ） に 対 し て エ フ ェ ク タ ー 分 子 と し て 働 く 。 そ の 結 果 と し て B 細 胞 の ク ラ ス ス イ ッ チ 、 記 憶 B 細 胞 へ の 分 化 、 形 質 細 胞 へ の 分 化 を 誘 導 す る こ と が 知 ら れ て い る サ イ ト カ イ ン で あ る 。ま た 、IL-17A は 、ナ イ ー ブ T 細 胞 が IL-6、TGF-、IL-23 と い っ た サ イ ト カ イ ン 刺 激 を 受 け た Th17 細 胞 か ら 産 生 さ れ る 3 7 , 3 8 )_{。 そ の 結 果 、} matrix m etallop roteinase (MMP )や 抗 菌 ペ プ チ ド の 発 現 3 9 , 4 0 )_{を 誘 導 し 細 菌 感 染 防 御} や 真 菌 感 染 防 御 に 関 与 し て い る サ イ ト カ イ ン と し て も 知 ら れ て い る 。 IL-6 は 、 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン で あ り 、IL-17A の 産 生 に 関 与 す る Th17 細 胞 へ の 分 化 を 誘 導 し て い る こ と が 知 ら れ て い る 。 IFN-も 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン で あ り 、 他 の サ イ ト カ イ ン と は こ と な り Th0 細 胞 を Th1 細 胞 へ の 分 化 を 誘 導 す る 。

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Figure 16. P neumo coccal vaccine b y P sp A and cationic lipo som es.

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Figure 17. Ind uctio n of IL -4, IN F-, IL-17 A and IL-6 in B ALB /c mice immunized intranasally with P sp A and catio nic lip osom es.

BALB /c m ice were imm unized intranasally with PB S, P sp A (5 μg/mo use) alo ne, o r OVA (2.5 μg/mouse) plus cationic liposomes (400 nmol/mouse) on days 0, 7 and 14. Sp leen cells were co llected on d ay 21 by mice. Spleen cells were stim ulated Psp A (0 , 0.5, 1, 10 μg/m l). After 72 hrs, supernatant were co llected and detected by E LIS A assay.

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Figure 18. Ind uction of OVA-sp ecif ic serum IgG, serum IgG1, serum IgG2 a and nasal IgA, B ALF IgA and vaginal IgA resp onses in B ALB /c m ice imm unized intranasall y with P sp A and catio nic liposom es.

BALB /c m ice were imm unized intranasal ly with PB S, P sp A (5 μg/mo use) alo ne, or Psp A (5 μg/mo use) p lus cationic lipo som es (400 nmo l/mo use) on d ays 0, 7 and 14. Serum, nasal washes, B ALF and vaginal washes were collected o n day 21. Th e anti-OVA IgG levels in serum and anti -OVA IgA level in nasal washes, BALF and vaginal wash were d etected by E LISA assay.

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Figure 19. Antigen uptake b y C D11c+ _{DCs in N ALTs follo wing intranasal} adm inistratio n of FITC -Psp A p lus the catio nic liposom e s.

50 総 括 医 療 技 術 が 進 化 し た 現 代 に お い て も 、高 齢 化 社 会 の 進 行 に よ り 感 染 症 や 悪 性 腫 瘍 に よ る 死 因 が 増 加 し て い る 。悪 性 腫 瘍 や 感 染 症 は 、ワ ク チ ン に よ り 予 防 、治 療 が 可 能 な 疾 患 で あ る 。こ れ ら 疾 患 の 罹 患 率 が 高 い 高 齢 者 や 乳 幼 児 は 、副 反 応 が 起 こ り や す く 、ま た 、十 分 な 免 疫 応 答 を 誘 導 で き ず 、ワ ク チ ン 効 果 が 不 十 分 と な り や す い 。 こ の た め 、 安 全 で 有 効 な ワ ク チ ン の 開 発 が 必 要 と さ れ て い る 。 中 で も 、粘 膜 を 介 し た 粘 膜 ワ ク チ ン が 注 目 さ れ て い る 。し か し 、粘 膜 は 抗 原 認 識 力 が 低 い た め 抗 原 単 独 で は 十 分 な 効 果 は 発 揮 で き な い 。そ こ で 、ア ジ ュ バ ン ト が 必 要 と さ れ 、 開 発 さ れ て き た 。 当 研 究 室 で は 、 DOTAP と DC-cholesterol を 用 い た 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム が 、 モ デ ル 抗 原 で あ る OVA に 対 し て ア ジ ュ バ ン ト 効 果 を 持 つ 事 2 8_{を 示 し て き た 。 正 電 荷} リ ポ ソ ー ム の 粒 子 サ イ ズ に 関 係 な く ア ジ ュ バ ン ト 効 果 を 発 揮 す る が 、粒 子 自 体 は 正 電 荷 で な け れ ば ア ジ ュ バ ン ト 効 果 を 発 揮 す る こ と は な か っ た 。 し か し な が ら 、 詳 細 な 機 序 に つ い て は 明 ら か と な っ て い な い 。 そ こ で 、本 研 究 で は 、正 電 荷 リ ポ ソ ー ム の も つ ア ジ ュ バ ン ト 効 果 の 機 序 と そ の 応 用 に つ い て 検 討 し た 。 第 一 章 で は 、 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム の ア ジ ュ バ ン ト 効 果 に ゲ ノ ム DNA が 関 与 し て い る の か に つ い て 明 ら か と す る べ く 、正 電 荷 リ ポ ソ ー ム 経 鼻 投 与 に よ る 鼻 腔 内 へ の ゲ ノ ム DNA 漏 出 評 価 及 び ゲ ノ ム DNA の ア ジ ュ バ ン ト 活 性 の 評 価 を 行 い 、 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム の ア ジ ュ バ ン ト 効 果 に ゲ ノ ム DNA が 関 与 し て い る の か 検 証 し 以 下 の 知 見 を 得 た 。 1. 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム に よ る ア ジ ュ バ ン ト 効 果 は 、 鼻 腔 だ け で な く 、 膣 や 肺 に お い て も IgA 抗 体 を 産 生 す る こ と を 明 ら か と し た 。 2. 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム を 経 鼻 投 与 す る こ と で 軽 度 の 細 胞 障 害 が 起 り 、 ゲ ノ ム DNA が 鼻 腔 内 に 漏 出 す る こ と を 明 ら か と し た 。

3. ゲ ノ ム DNA を 経 鼻 投 与 す る と 、IgG 抗 体 及 び IgA 抗 体 産 生 を 誘 導 す る ア ジ ュ バ ン ト 効 果 を 示 し た 。

4. 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム に よ る ア ジ ュ バ ン ト 効 果 は 、DNase I 併 用 時 に 低 下 す る こ と を 明 ら か と し た 。

51 こ と が 示 唆 さ れ た 。 第 二 章 で は 、正 電 荷 リ ポ ソ ー ム の 樹 状 細 胞 へ の 抗 原 取 り 込 み 効 果 に つ い て 明 ら か と し た 。 1. In vitro に お い て 、 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム は 抗 原 の 取 り 込 み を 増 強 し た 。 2. 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム は ク ラ ス リ ン 介 在 性 エ ン ド サ イ ト ー シ ス 及 び 脂 質 ラ フ ト 介 在 性 エ ン ド サ イ ト ー シ ス に よ り 取 り 込 ま れ て い る こ と が 明 ら か と な っ た 。 3. 抗 原 は ク ラ ス リ ン 介 在 性 エ ン ド サ イ ト ー シ ス を 介 し て 取 り 込 ま れ て い る こ と が 明 ら か と な っ た 。 4. 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム 添 加 に よ る 抗 原 の 取 り 込 み は 、 ク ラ ス リ ン 介 在 性 エ ン ド サ イ ト ー シ ス 及 び 脂 質 ラ フ ト 介 在 性 エ ン ド サ イ ト ー シ ス を 介 し て い る こ と が 明 ら か と な っ た 。 5. 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム と 抗 原 は 相 互 作 用 し 、 細 胞 内 に 取 り 込 ま れ て い る こ と が 示 さ れ た 。 以 上 か ら 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム は 、抗 原 の 取 り 込 み を 増 強 し 、正 電 荷 リ ポ ソ ー ム が 取 り 込 ま れ る 経 路 を 介 し て 抗 原 の 取 り 込 み が 誘 導 さ れ て い る こ と が 明 ら か と な っ た 。ま た 、抗 原 と 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム が 相 互 作 用 し 細 胞 内 に 取 り 込 ま れ て い る こ と が 明 ら か と な っ た 。本 研 究 と は 異 な る 正 電 荷 脂 質 を 用 い た リ ポ ソ ー ム に お い て 、 抗 原 提 示 細 胞 へ の 抗 原 取 り 込 み が 増 加 し 、そ の 結 果 、抗 原 提 示 能 が 増 強 さ れ た と 報 告 が あ っ た 4 0_{。本 研 究 で 用 い た 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム も 同 様 に 抗 原 の 取 り 込 み を 増} 加 さ せ た 結 果 、抗 原 提 示 能 を 増 強 し た と 考 え ら れ る 。し か し な が ら 、抗 原 は 今 回 用 い た OVA の よ う な 負 電 荷 の 抗 原 ば か り で は な い 。 今 後 の 課 題 と し て 、 正 電 荷 の 抗 原 を 効 率 的 に 抗 原 提 示 細 胞 へ 取 り 込 ま せ る シ ス テ ム を 構 築 す る こ と で よ り よ い ア ジ ュ バ ン ト 開 発 へ つ な が る と 考 え ら れ る 。 第 三 章 で は 、正 電 荷 リ ポ ソ ー ム の ア ジ ュ バ ン ト 効 果 の 機 序 に つ い て 明 ら か と な っ た た め 、正 電 荷 リ ポ ソ ー ム の 疾 患 モ デ ル へ の 応 用 を 目 的 と し 、肺 炎 球 菌 感 染 症 モ デ ル に 対 し 、 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム の ア ジ ュ バ ン ト と し て の 有 用 性 を 評 価 し た 。 1. 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム に よ り 肺 炎 球 菌 感 染 が 抑 制 さ れ た 。

2. 正 電 荷 リ ポ ソ ー ム と PspA の 併 用 経 鼻 投 与 に よ り 、IL-4、IL-17 A、IL-6、IN F- の 産 生 が 誘 導 さ れ た 。

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研 究 成 果 の 掲 載 誌

本 博 士 学 位 申 請 論 文 は 、以 下 の 論 文 及 び 未 発 表 結 果 の 内 容 を 総 括 し た も の で あ る 。

第 一 章

Rui Tad a, Akihiro O hshim a, Yuya Tanasawa, Akari O hm i, Saeko Takahashi, Yo ichi Negishi, H iroshi K iyo no, Jun K unisaw a, Yukihiko Aram aki,

Essential role of do uble -strand ed ho st DN A released f rom dying cells b y catio nic lipo som es in the m ucosal adjuvant activity.

in prep aration.

第 二 章

Saeko Takahashi, Rui Tad a, Yoichi N egishi, Yukihiko Ara m aki.

Mechanism s of enhanced antigen d elivery to m urine dend ritic cells b y the catio ni c lipo som es

Open Journal of Imm uno lo gy. 7 (4); 85 -101, (2017 )

第 三 章

Rui Tad a, H id ehiko Suzuki, Saeko Takahashi, Yoichi N egishi, Hiro shi K iyo no, J un Kunisawa, Yukihi ko Aram aki.

Nasal vaccinatio n with Pneumo co ccal Surface Pro tein A in comb inatio n with catio nic lipo som es co nsisting of DO TAP and DC -chol co nfers antigen -m ediated protectiv e imm unity against Strep toco ccus pneumoniae infections in m ice.

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