関節炎により誘導される乾燥皮膚発現のメカニズム解析

関 節 炎 に よ り 誘 導 さ れ る 乾 燥 皮 膚 発 現 の メ カ ニ ズ ム 解 析

2020

五 藤 健 児

Mechanistic analysis of dry skin induced by arthritis

2020

Kenji Goto

目 次

緒 論 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・

1

第

1 章 関 節 炎 モ デ ル マ ウ ス に お け る マ ス ト 細 胞 が も た ら す 乾 燥 皮 膚 へ

の 影 響

第

1 節 緒 言 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 4

第

2 節 実 験 方 法 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 5

第

3 節 結 果 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 8

第

4 節 考 察 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 15

第

5 節 小 括 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 16

第

2 章 関 節 炎 モ デ ル マ ウ ス に お け る マ ス ト 細 胞 を 介 し た Reactive

Oxygen Species お よ び ス ト レ ス ホ ル モ ン の 乾 燥 皮 膚 へ の 影 響

第

1 節 緒 言 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 17

第

2 節 実 験 方 法 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 18

第

3 節 結 果 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 21

第

4 節 考 察 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 27

第

5 節 小 括 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 29

第

3 章 関 節 炎 モ デ ル マ ウ ス に お け る 乾 燥 皮 膚 発 現 に Th2 細 胞 お よ び

Th17 細 胞 が 及 ぼ す 影 響

第

1 節 緒 言 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 30

第

2 節 実 験 方 法 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 31

第

3 節 結 果 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 34

第

4 節 考 察 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 40

第

5 節 小 括 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 42

結 論 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・

43

引 用 文 献 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・

45

謝 辞 ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・

48

Abstract・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ ・ 49

略 号 一 覧

ACTH: adrenocorticotropic hormone CCL17: chemokine (C-C motif) ligand 17 DMSO: dimethyl sulfoxide

ELISA: enzyme-linked immunosorbent assay HE: hematoxylin and eosin

IL: interleukin JAK: janus kinase

JNK: c-jun N-terminal kinase LDS: lithium dodecyl sulfate MMP: matrix metalloproteinase NAC: N-acetyl cysteine

PBS: phosphate buffered salts QOL: quality of life

RORγt: retinoid-related orphan receptor gamma t ROS: reactive oxygen species

STAT: signal transducers and activator of transcription TEWL: transepidermal water loss

Th: T helper

TNF-α: tumor necrosis factor-α TSLP: thymic stromal lymphopoietin

緒 論

皮 膚 は 、 最 外 層 に て 上 皮 組 織 を 形 成 す る 表 皮 、 そ の 下 層 に お い て 結 合 組 織 か ら な る 真 皮 、 さ ら に 深 部 に 存 在 す る 皮 下 組 織 か ら 主 に 形 成 さ れ る 人 体 最 大 の 臓 器 で あ る 。 皮 膚 の 機 能 と し て 、 体 内 と 外 界 を 隔 て 、 生 体 内 の 水 分 保 持 や 外 部 刺 激 か ら 諸 器 官 を 守 る 働 き 、 侵 入 し た 異 物 や 細 菌 な ど を 排 除 す る こ と で 体 を 守 る 働 き が あ る 。 表 皮 の 最 内 層 で あ る 基 底 層 で 産 生 さ れ た ケ ラ チ ノ サ イ ト （ 角 化 細 胞 ） は 、 角 化 と 呼 ば れ る 細 胞 分 裂 を 繰 り 返 し な が ら 外 層 へ 移 動 し 、 最 終 的 に は 外 界 に 触 れ る 最 外 層 で あ る 角 層 を 形 成 し 、 身 体 を く ま な く 覆 っ て い る 。 角 層 で は 、 ケ ラ チ ノ サ イ ト が レ ン ガ 様 の 構 造 を と り 、 ケ ラ チ ノ サ イ ト の 間 隙 （ 細 胞 間 質 ） に 存 在 す る 細 胞 間 脂 質 で あ る セ ラ ミ ド や 天 然 保 湿 因 子 で あ る ヒ ア ル ロ ン 酸 な ど が 角 層 の 水 分 量 を 保 ち 、 表 皮 か ら の 水 分 の 喪 失 を 防 い で い る 。 ま た 、 真 皮 に お い て は コ ラ ー ゲ ン を 代 表 と す る 結 合 組 織 が 豊 富 に 存 在 し 、 エ ラ ス チ ン と 共 に 皮 膚 の 弾 性 を 保 っ て い る 。 こ れ ら の 結 合 組 織 の 間 隙 に は ヒ ア ル ロ ン 酸 も 蓄 え ら れ 、 水 分 が 一 定 量 保 持 さ れ て い る(Fig. 1)。 Fig. 1 皮 膚 構 造 の 模 式 図 皮 膚 は 、 外 部 環 境 の 変 化 や 生 体 内 の 異 常 が 起 こ る と 、 バ リ ア 機 能 が 低 下 す る 。 そ の 結 果 、 皮 膚 中 の 水 分 が 保 持 で き ず 、 喪 失 す る こ と で 乾 燥 皮 膚 が 引 き 起 こ さ れ る 。 乾 燥 皮 膚 を 生 じ る 要 因 と し て は 、 炎 症 に よ っ て コ ラ ー ゲ ン を 生 成 す る 線 維 芽 細 胞 が 障 害 を 受 け る こ と や 、 マ ス ト 細 胞 に 存 在 す る ト リ プ タ ー ゼ に よ っ て コ ラ ー ゲ ン 分 解 酵 素 で あ る Matrix metalloproteinase (MMP)が 活 性 化 さ れ る こ と が 挙

げ ら れ る[Ref. 1, 2]。 乾 燥 皮 膚 の 所 見 と し て は 、 経 表 皮 水 分 喪 失 量

(Transepidermal water loss: TEWL)の 上 昇 や 角 層 水 分 量 の 低 下 が み ら れ る こ と が 知 ら れ て い る[Ref. 3]。 そ の よ う な 状 態 に 陥 れ ば 、 掻 痒 を 生 じ る き っ か け と な り う る 。 掻 痒 に よ り 皮 膚 が 障 害 を 受 け る と 、 表 皮 細 胞 か ら interleukin (IL)-1 や tumor necrosis factor (TNF)-α な ど の 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン が 放 出 さ れ 、 そ れ ら が 原 因 と な り 再 び 痒 み を 生 じ る こ と と な る 。 結 果 と し て 、 皮 膚 症 状 を 悪 化 さ せ る itch scratch cycle の よ う な 慢 性 化 を 引 き 起 こ す こ と も あ る [Ref. 4]。 痒 み が 酷 く な れ ば 傷 を 生 じ 、 皮 膚 感 染 症 の 発 症 や 、 睡 眠 障 害 の 誘 発 な ど 精 神 的 に 与 え る 影 響 も 大 き い[Ref. 5]。 こ れ ら は 患 者 の Quality of life (QOL)を 著 し く 低 下 さ せ る 要 因 と な り う る た め 、 掻 痒 の 原 因 と な る 乾 燥 皮 膚 を 防 ぐ こ と は 大 変 重 要 で あ る 。 こ れ ま で に 小 腸 炎 や 大 腸 炎 、 肝 炎 な ど の 消 化 器 疾 患 モ デ ル マ ウ ス で は 、 乾 燥 皮 膚 を 引 き 起 こ す と い う 報 告 が な さ れ て い る[Ref. 6-8]。 そ の 際 に は 、 皮 膚 に お け る ア セ チ ル コ リ ン な ど の 神 経 系 シ グ ナ ル や マ ス ト 細 胞 な ど の 免 疫 担 当 細 胞 の 関 与 が 認 め ら れ て お り 、 内 臓 器 官 の 障 害 は 遠 隔 臓 器 で あ る 皮 膚 の 状 態 に 影 響 を 及 ぼ す こ と を 示 し て い る 。 本 論 文 で は 、 消 化 器 官 以 外 の 炎 症 性 疾 患 に お い て も ど の よ う な 因 子 が 乾 燥 皮 膚 に 影 響 を 及 ぼ す の か に つ い て 検 討 す る こ と と し 、 炎 症 性 自 己 免 疫 疾 患 で あ る 関 節 リ ウ マ チ に 着 目 し た 。 関 節 リ ウ マ チ は 遺 伝 的 な 要 因 や 微 生 物 感 染 、 ス ト レ ス 、 ホ ル モ ン バ ラ ン ス の 異 常 な ど の 様 々 な 因 子 が 原 因 と な っ て 発 症 す る 自 己 免 疫 疾 患 で あ る[Ref. 9]。 関 節 の 炎 症 と 進 行 性 関 節 破 壊 を 主 症 状 と し 、 血 管 、 肺 、 腎 臓 、 皮 下 組 織 な ど の 関 節 外 に も 病 巣 が 広 が る 。 世 界 人 口 の 約 1%が 罹 患 し 、 本 邦 に お い て は 現 在 お よ そ 80 万 人 の 罹 患 者 が い る と さ れ て お り 、 さ ら に 高 齢 化 の 影 響 も 相 ま っ て そ の 数 は 年 々 増 加 の 傾 向 に あ る 。 関 節 リ ウ マ チ 患 者 が 掻 痒 を 呈 す る こ と や 乾 燥 皮 膚 を 発 現 す る こ と は 、 臨 床 で は 既 知 の 事 実 と し て 症 例 報 告 さ れ て い る が 、 そ の 誘 導 に 関 す る メ カ ニ ズ ム は 明 ら か に さ れ て い な い[Ref. 10, 11]。 関 節 リ ウ マ チ の 病 態 を 網 羅 し た モ デ ル 動 物 は 存 在 し な い が 、 主 徴 で あ る 関 節 炎 を 模 倣 し た モ デ ル 動 物 は 多 数 存 在 す る 。 基 礎 研 究 に て 用 い ら れ る 代 表 的 な モ デ ル と し て は 、 ア ジ ュ バ ン ト 惹 起 ラ ッ ト 、II 型 コ ラ ー ゲ ン 誘 導 関 節 炎 マ ウ ス な ど が 挙 げ ら れ る[Ref. 12]。 な か で も 、 コ ラ ー ゲ ン 誘 導 関 節 炎 モ デ ル は 1977 年 に Trentham ら が 発 表 し 、 現 在 で は 関 節 リ ウ マ チ の 動 物 モ デ ル と し て 薬 理 試 験 な ど に 頻 用 さ れ て い る モ デ ル で あ る[Ref. 13]。 接 種 す る 動 物 と は 異 な る 種 の II 型 コ ラ ー ゲ ン を 注 射 す る こ と で 、 動 物 体 内 で 抗 原 抗 体 反 応 が 起 こ り 、 抗 原 に 対 す る 抗 体 が 大 量 に 産 生 さ れ る 。 産 生 さ れ た 抗 体 は 異 種 II 型 コ ラ ー ゲ ン を 抗 原 と し て 認 識 ・ 排 除 す る 一 方 で 、 自 身 の II 型 コ ラ ー ゲ ン も 抗 原 と し て 認 識 し 、 主 に II 型 コ ラ ー ゲ ン を 構 成 成 分 と す る 関 節 軟 骨 が 破 壊 さ れ る 。 コ ラ ー ゲ ン 誘 導 関 節 炎 モ デ ル は メ ト ト レ キ サ ー ト を は じ め と し た リ ウ マ チ 治 療 薬 の 承 認 時 に お け る 薬 理 試 験 の

際 に 用 い ら れ 、 関 節 炎 の 改 善 お よ び 治 療 効 果 を 得 る な ど 実 績 豊 富 で あ る[Ref. 14]。 本 論 文 で は 、 ヒ ト 慢 性 関 節 リ ウ マ チ に 酷 似 し 、 使 用 実 績 も 多 い コ ラ ー ゲ ン 誘 導 関 節 炎 マ ウ ス を 用 い 、 乾 燥 皮 膚 発 現 の メ カ ニ ズ ム を 明 ら か に す る こ と を 目 的 と し た 。 第 1 章 で は 関 節 リ ウ マ チ を 模 倣 し た 関 節 炎 モ デ ル マ ウ ス を 用 い て 、 乾 燥 皮 膚 の 再 現 性 と マ ス ト 細 胞 の 乾 燥 皮 膚 へ の 影 響 を 検 討 し た 。 第 2 章 で は 、 同 マ ウ ス を 用 い て マ ス ト 細 胞 の 活 性 化 因 子 に つ い て 検 討 を 行 っ た 。 第 3 章 で は 、 マ ス ト 細 胞 以 外 の 免 疫 担 当 細 胞 が 乾 燥 皮 膚 へ 及 ぼ す 影 響 に つ い て 検 討 し 、 関 節 リ ウ マ チ に お い て 乾 燥 皮 膚 の 発 現 が 誘 導 さ れ る 模 式 図 を 作 成 し た 。

第

1 章

関 節 炎 モ デ ル マ ウ ス に お け る マ ス ト 細 胞 が も た ら す

乾 燥 皮 膚 へ の 影 響

第

1 節 緒 言

乾 燥 皮 膚 は 、 経 表 皮 水 分 喪 失 量 (Transepidermal water loss: TEWL) の 上 昇 が 所 見 と し て 現 れ 、 表 皮 に お け る 皮 脂 の 欠 乏 や 真 皮 に 存 在 す る 天 然 保 湿 因 子 で あ る ヒ ア ル ロ ン 酸 お よ び 細 胞 外 マ ト リ ッ ク ス で あ る コ ラ ー ゲ ン の 減 少 に よ り 引 き 起 こ さ れ る[Ref. 6]。 皮 膚 に お け る コ ラ ー ゲ ン は 主 に I型 お よ び IV型 が 存 在 し 、 I型 コ ラ ー ゲ ン は 細 胞 外 マ ト リ ッ ク ス を 構 成 す る 主 要 な 成 分 と し て 、 皮 膚 に 弾 力 性 を 持 た せ た り 、 水 分 を 保 持 し た り す る 働 き が あ る 。IV型 コ ラ ー ゲ ン は 基 底 膜 を 構 成 す る 成 分 で あ り 、 特 に 表 皮 と 真 皮 の 結 合 に 役 立 つ 。 こ れ ら の コ ラ ー ゲ ン は 、 皮 膚 や 関 節 の 組 織 修 復 に 必 須 な 酵 素 で あ るMatrix metalloproteinase (MMPs)に よ っ て 分 解 さ れ て お り 、I型 コ ラ ー ゲ ン は 主 と し て MMP-1に 、 IV型 コ ラ ー ゲ ン は MMP-9に よ っ て 分 解 さ れ る 。 皮 膚 炎 症 の 惹 起 に よ り 、 こ れ ら MMPsが 過 剰 に 発 現 し 、 コ ラ ー ゲ ン の 低 下 を 招 い て し ま う た め 、 皮 膚 水 分 量 を 低 下 さ せ る こ と が 報 告 さ れ て い る[Ref. 15]。 関 節 リ ウ マ チ に お け る 皮 膚 症 状 は 、 全 身 性 の 強 皮 症 や リ ウ マ チ 結 節 、 皮 膚 潰 瘍 な ど 様 々 で あ り 、 乾 燥 皮 膚 発 現 も 症 例 報 告 が な さ れ て い る[Ref. 9, 10]。 乾 燥 皮 膚 発 現 の メ カ ニ ズ ム を 解 明 す る 基 礎 的 研 究 は 不 十 分 で あ る が 、 関 節 リ ウ マ チ 患 者 に お け る 滑 膜 組 織 で は マ ス ト 細 胞 が 増 加 し 、 滑 液 中 の ト リ プ タ ー ゼ お よ び ヒ ス タ ミ ン 濃 度 が 増 加 し た と の 報 告 が あ る こ と か ら[Ref. 16]、 関 節 リ ウ マ チ の 病 態 に は マ ス ト 細 胞 が 関 与 し て い る こ と が 示 唆 さ れ て い る 。 マ ス ト 細 胞 は 炎 症 や ア レ ル ギ ー 反 応 な ど の 生 体 防 御 に 重 要 な 役 割 を 持 つ 免 疫 担 当 細 胞 で あ り 、 ト リ プ タ ー ゼ や 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン で あ るtumor necrosis factor (TNF)-α、 interleukin (IL)-6、 特 異 顆 粒 で あ る ヒ ス タ ミ ン な ど を 放 出 す る[Ref. 17]。 こ の う ち 、 ト リ プ タ ー ゼ や TNF-αは MMPsを 活 性 化 す る こ と が 報 告 さ れ て い る [Ref. 18]。 マ ス ト 細 胞 を ノ ッ ク ア ウ ト さ せ る こ と で 小 腸 炎 モ デ ル マ ウ ス に お け る 乾 燥 皮 膚 が 改 善 し た こ と や [Ref. 6]、 蕁 麻 疹 治 療 に マ ス ト 細 胞 を 標 的 と し た 治 療 法 が 期 待 さ れ て い る こ と な ど か ら[Ref. 19]、 マ ス ト 細 胞 の 皮 膚 疾 患 へ の 関 与 が 示 唆 で き 、 関 節 リ ウ マ チ に お

け る 乾 燥 皮 膚 発 現 に も 関 係 す る 可 能 性 が あ る 。 コ ラ ー ゲ ン 誘 発 関 節 炎 モ デ ル マ ウ ス は 抗 リ ウ マ チ 薬 の 薬 理 試 験 の 際 に 用 い ら れ る モ デ ル 動 物 で あ る が 、 乾 燥 皮 膚 の 評 価 に 適 し た モ デ ル で あ る か に つ い て は 定 か で は な い 。 し た が っ て 本 章 で は 、 関 節 リ ウ マ チ モ デ ル で あ る コ ラ ー ゲ ン 誘 発 関 節 炎 モ デ ル マ ウ ス の 乾 燥 皮 膚 発 現 の 再 現 性 に つ い て 確 認 し 、 関 節 炎 に お け る 乾 燥 皮 膚 発 現 へ の マ ス ト 細 胞 の 影 響 を 明 ら か に す る こ と を 目 的 と し た 。

第

2 節 実 験 方 法

1. 実 験 動 物 と そ の 飼 育 お よ び 処 置 関 節 リ ウ マ チ の 病 態 を 模 倣 し た モ デ ル マ ウ ス と し て 、DBA/1Jコ ラ ー ゲ ン 誘 導 関 節 炎 マ ウ ス(関 節 炎 マ ウ ス )を 使 用 し た 。 こ の マ ウ ス は 、 日 本 エ ス エ ル シ ー 株 式 会 社 に て 関 節 炎 処 置 を 施 さ れ た10週 齢 の マ ウ ス で あ る 。 コ ラ ー ゲ ン 誘 導 関 節 炎 処 置 と し て 、DBA/1Jマ ウ ス に II型 コ ラ ー ゲ ン 抗 体 を 1回 目 は 耳 介 基 部 、 21日 後 の 2 回 目 は 尾 根 部 に 皮 内 投 与 す る こ と で 作 製 さ れ た 。 本 モ デ ル は 、 リ ウ マ チ 治 療 薬 の 承 認 時 に お け る 薬 理 試 験 の 際 に 用 い ら れ 、 関 節 炎 の 改 善 お よ び 治 療 効 果 を 得 る な ど 使 用 頻 度 ・ 実 績 共 に 豊 富 で あ る 。 性 周 期 を 有 す る 雌 性 マ ウ ス の 使 用 は 、 性 ホ ル モ ン の 影 響 を 考 慮 す る 必 要 が あ り 、 関 節 炎 の 発 症 に 性 ホ ル モ ン が 関 与 す る と の 報 告 が あ る た め[Ref. 20]、 本 研 究 を 行 う 上 で 正 確 な 結 果 を 得 ら れ な い 可 能 性 が あ る 。 し た が っ て 、 本 研 究 で は 雄 性 マ ウ ス を 用 い た 。 コ ラ ー ゲ ン 誘 導 処 置 を 行 わ な いDBA/1Jマ ウ ス を コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス (n = 5)と し た 。 購 入 し た マ ウ ス は 温 度 23±2°C、 湿 度 55±10%， 照 度 サ イ ク ル 12時 間 (light: 8:00-20:00)の 環 境 下 、 固 形 飼 料 お よ び 水 を 自 由 に 摂 取 さ せ 、 い ず れ も1週 間 の 馴 化 飼 育 を 実 施 し た 。 馴 化 後 、1日 1回 4日 間 連 続 に て 21 µg/kgの 抗 c-kit抗 体 (マ ス ト 細 胞 の 増 殖 抑 制 ) (Lifespan Biosciences Inc., Seattle, WA) を 関 節 炎 マ ウ ス の 腹 腔 内 に 投 与 し た [Ref. 21]。 抗 c-kit抗 体 投 与 最 終 日 に 、 ペ ン ト バ ル ビ タ ー ル ナ ト リ ウ ム (5

mg/mL)(Nacalai tesque, Kyoto, Japan)を 50 mg/kgと な る よ う に 腹 腔 内 投 与 し て マ ウ ス に 麻 酔 し た の ち 、 背 部 の 刈 毛 を 行 い 、 さ ら に 除 毛 ク リ ー ム(Veet Hair Removal Cream Fit Sensitive; Reckitt Benckiser, Slough, UK)を 用 い て 、 背 部 を 除 毛 し 、 皮 膚 を 露 出 さ せ た 。 す べ て の 動 物 実 験 は 、 鈴 鹿 医 療 科 学 大 学 動 物 実 験 委 員 会 に よ る 研 究 計 画 書 の 承 認 を 得 た 後 に 、 総 理 府 の 「 実 験 動 物 の 飼 養 及 び 保 管 等 に 関 す る 基 準 」 、 な ら び に 「 鈴 鹿 医 療 科 学 大 学 動 物 実 験 指 針(承 認 番 号 :第 66 号)」 に 従 っ て 実 施 し た 。

2. マ ウ ス 後 肢 容 積 の 測 定 除 毛 処 置 の24時 間 後 、 ペ ン ト バ ル ビ タ ー ル ナ ト リ ウ ム の 腹 腔 内 投 与 に て マ ウ ス を 麻 酔 し 、Cosgroveら の 方 法 に 則 り 、 水 を 満 た し た ビ ー カ ー を 電 子 天 秤 に 載 せ 、 マ ウ ス 後 肢 の 指 先 か ら 脛 骨 ま で を 浸 す こ と で 、 後 肢 容 積 を 測 定 し た[Ref. 22]。 3. マ ウ ス 背 部 皮 膚 の TEWLの 測 定 手 順2終 了 後 、 麻 酔 下 に お け る マ ウ ス 背 部 皮 膚 の TEWLの 測 定 を 行 っ た 。 TEWLは 皮 膚 か ら 時 間 あ た り に 体 外 喪 失 す る 水 分 量 の 測 定 値 で あ り 、 皮 膚 の バ リ ア 機 能 を 反 映 し て い る 。Barelら の 方 法 に 基 づ い て 、 Tewameter®_TM300

(Courage + Khazaka Electronic GmbH, Cologne, Germany) を 用 い て 、 TEWLを 測 定 し た[Ref. 23]。 測 定 値 は 測 定 開 始 後 お よ そ 10秒 が 経 過 し 、 数 値 が 安 定 し た 状 態 で 読 み 取 り 、3回 測 定 し た 値 の 平 均 値 を 算 出 し た 。 4. マ ウ ス の 血 液 お よ び 皮 膚 組 織 の 採 取 手 順2お よ び 3終 了 後 、 心 臓 か ら 約 1 mLの 血 液 を 採 取 し た 。 ま た 、 縦 1.5 cm×横 0.8 cm四 方 の 背 部 皮 膚 組 織 を 採 取 し 、 － 80°Cで 凍 結 保 存 し た 。 5. 皮 膚 組 織 の 染 色 採 取 し た 皮 膚 組 織 の 一 部 は 免 疫 組 織 学 的 評 価 に 用 い る た め 、 パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド 溶 液(4%, Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan ) に て 固 定 し た 。 固 定 し た 皮 膚 組 織 はTissue-Tek O.C.T. Compound (Sakura Finetek, Tokyo, Japan)を 用 い て 凍 結 包 埋 し 、 5 μmの 厚 さ で ミ ク ロ ト ー ム (Leica Biosystems, Nussioch, Germany)に て 薄 切 を 行 っ た 。 薄 切 し た 切 片 は

hematoxylin and eosin (HE)に よ っ て 染 色 し た 後 、 光 学 顕 微 鏡 に て 組 織 学 的 評 価 を 行 い 、 無 作 為 に 抽 出 し た10枚 の 画 像 に お け る 表 皮 か ら 皮 下 組 織 に 至 る ま で の 厚 さ を 測 定 し た 。 ま た 、 ト ル イ ジ ン ブ ル ー 染 色 を 行 い 、 マ ス ト 細 胞 数 をImage Jソ フ ト ウ ェ ア(National Institutes of Health, Bethesda, MD, USA)を 用 い て 計 測 し た 。 無 作 為 に3か 所 の エ リ ア を 抽 出 し 、 単 位 面 積 (mm2_{)あ た り の マ ス ト 細 胞 数 の}

平 均 値 を 算 出 し た 。

6. ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ に よ る 皮 膚 組 織 中 の タ ン パ ク 質 の 発 現 解 析 採 取 し た 背 部 の 皮 膚 組 織100 mgを 剪 刀 で 細 か く 刻 ん だ 後 、 組 織 用 懸 濁 試 薬 (KURABO, Osaka, Japan)に 浸 漬 し 、 氷 上 に て ハ ン ド ミ キ サ ー (POLYTRON PT 1200 CL; Kinematica AG, Littau, Switzerland)を 用 い て 、 ホ モ ジ ナ イ ズ (20,000 rpm, 60秒 )し た 。 懸 濁 液 を 8,000 ×gで10分 間 遠 心 分 離 し た の ち 、 上 清 を 抽 出 し 、

解 析 に 用 い る ま で －80°Cで 保 存 し た 。 上 清 サ ン プ ル を 溶 解 後 、 Lowry法 に よ り 総 タ ン パ ク 質 量7.85 μgと な る よ う lithium dodecyl sulfate (LDS) sample buffer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) お よ び sample reducing agent (Thermo Fisher Scientific)に 懸 濁 さ せ て 調 整 し 、 煮 沸 後 、 4-12% BIS-TRIS Bolt gel (Thermo Fisher Scientific)を 用 い て 200Vの 定 電 圧 で 18分 間 電 気 泳 動 を 行 っ た 。 電 気 泳 動 さ れ た タ ン パ ク 質 はiBlot 2 Dry blotting system (Thermo Fisher Scientific)を 用 い て 、 25Vの 定 電 圧 を 6分 間 か け て ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜 (Thermo Fisher Scientific)に 転 写 し 、 4°Cで 一 晩 、 5%ス キ ム ミ ル ク (Megmilk Snow Brand Company, Tokyo, Japan)に て ブ ロ ッ キ ン グ を 行 っ た 。 ブ ロ ッ キ ン グ 後 、 25°Cで 1時 間 、 1次 抗 体 と し て 抗 I型 コ ラ ー ゲ ン 抗 体 (1:1,000, EMD Chemicals Inc., Gibbstown, NJ, USA)、 抗 IV型 コ ラ ー ゲ ン 抗 体 (1:1,000, Abcam,

Cambridge, MA, USA)、 抗 MMP-1抗 体 (1:1000, Santa Cruz Biotechnology Inc., CA, USA)、 抗 MMP-9抗 体 (1:1000, Abnova, Taipei, Taiwan)、 抗 β-ア ク チ ン 抗 体 (1:5,000, Sigma, St. Louis, MO, USA) で そ れ ぞ れ 反 応 さ せ た の ち 、

horseradish peroxidaseで 標 識 さ れ た 2次 抗 体 (Thermo Fisher Scientific)で 処 理 を 行 っ た 。 免 疫 複 合 体 は 化 学 発 光 試 薬 で あ る イ ム ノ ス タ ー ゼ ー タ(Healthcare Bio-Sciences, Piscataway,NJ, USA)で 処 理 し た の ち に 、 lumino-image analyzer (LAS-4000, FUJIFILM, Greenwood, SC, USA)を 用 い て 検 出 し た 。

7. 血 中 ヒ ス タ ミ ン 濃 度 の 測 定

心 臓 か ら 採 取 し た 血 液 サ ン プ ル を4°C、 3,000 ×gで10分 間 遠 心 分 離 し 、 上 清 部 分(血 漿 )を 採 取 し た 。 血 漿 中 の ヒ ス タ ミ ン 濃 度 は enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) kit (Histamine: Bertin Pharma, Montigny le Bretonneux, France)の プ ロ ト コ ル に 従 い 、 マ イ ク ロ プ レ ー ト リ ー ダ ー (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA)を 用 い て 、 405 nmの 波 長 に て 測 定 し た 。

8. 統 計 解 析

全 て の デ ー タ は 平 均 値±標 準 偏 差 (SD)値 で 示 し た 。 2群 間 の 比 較 に は Student’s

t-test、 3群 間 の 比 較 に は Tukey’s testを 用 い た 。 危 険 率 が 5%未 満 の 場 合 を 統 計 学 的 に 有 意 と 判 断 し た 。 統 計 解 析 はIBM SPSS Statistics24に て 実 施 し た 。

第

3 節 結 果

1. マ ウ ス の 後 肢 容 積 関 節 の 腫 れ は 関 節 の 炎 症 状 態 を 評 価 す る 指 標 の1つ で あ る 。 マ ウ ス の 後 肢 容 積 を 測 定 し た こ ろ[Ref. 22]、 関 節 炎 マ ウ ス で は コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス に 比 べ て 約 3倍 増 加 し て お り 、 本 研 究 に 使 用 す る マ ウ ス が 関 節 炎 を 発 症 し て い る こ と が 確 認 で き た(Fig. 2)。 Fig. 2 コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス と 関 節 炎 マ ウ ス と の 後 肢 容 積 の 比 較 コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス と 関 節 炎 マ ウ ス と の 後 肢 の 比 較 写 真 。 後 肢 を 蒸 留 水 に て 満 た し た ビ ー カ ー に 浸 け る こ と で 容 積 を 測 定 し た 。 測 定 値 は 平 均 値±標 準 偏 差 (SD)値 と し て 示 し た 。 Student’s t-test (n = 5)。 * p < 0.05。 2. マ ウ ス 背 部 皮 膚 の TEWLお よ び 組 織 学 的 検 討 関 節 炎 マ ウ ス の 乾 燥 皮 膚 の 状 態 を 確 認 す る た め 、TEWLの 測 定 お よ び 皮 膚 の 組 織 学 的 な 検 討 を 行 っ た 。 除 毛 処 置 の 翌 日 、 各 マ ウ ス のTEWLの 測 定 を 実 施 し た 。 関 節 炎 マ ウ ス のTEWLは コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス に 比 し て 、 約 2倍 上 昇 し て い た (Fig. 3A)。 ま た 、 皮 膚 の 切 片 を HE染 色 に よ り 評 価 し た 。 表 皮 か ら 皮 下 組 織 に 至 る ま で の 厚 さ を 測 定 し た と こ ろ 、 関 節 炎 マ ウ ス で は コ ン ト ロ ー ル と 比 較 し て 、 約1.5倍 厚 く な っ て い た(Fig. 3B)。

Fig. 3 関 節 炎 マ ウ ス に お け る 皮 膚 状 態 の 変 化

A) 除 毛 処 置 を し た 翌 日 に 背 部 皮 膚 に お け る Transepidermal water loss (TEWL) を 測 定 し た 。 測 定 値 は 平 均 値±SD値 と し て 示 し た 。 B) Hematoxylin and eosin (HE)染 色 を 実 施 し た 皮 膚 切 片 を 顕 微 鏡 に て 観 察 し 、 無 作 為 に 抽 出 し た10枚 の 画 像 に お け る 表 皮 か ら 皮 下 組 織 に 至 る ま で の 厚 さ を 測 定 し た 。Scale bar = 200 μm。 Student’s t-test (n = 5)。 * p < 0.05。

3. 皮 膚 中 の I型 コ ラ ー ゲ ン 、 IV型 コ ラ ー ゲ ン 、 MMP-1お よ び MMP-9の 変 化 他 の 疾 患 に よ り 生 じ た 乾 燥 皮 膚 で は 、MMPに よ る コ ラ ー ゲ ン の 分 解 が 増 加 し て い た た め[Ref. 6]、 本 研 究 に お い て も ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ に よ り 、 MMP や コ ラ ー ゲ ン の 発 現 を 解 析 し た 。 関 節 炎 マ ウ ス に お け る 皮 膚 中 のI型 コ ラ ー ゲ ン お よ びIV型 コ ラ ー ゲ ン の 発 現 量 は 、 コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス に 比 し て 約 0.5倍 減 少 し た 。 ま た 、I型 コ ラ ー ゲ ン を 分 解 す る 酵 素 で あ る MMP-1、 お よ び IV型 コ ラ ー ゲ ン を 分 解 す る 酵 素 で あ るMMP-9の 発 現 量 は 関 節 炎 マ ウ ス で は コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス に 比 し て 約4倍 か ら 5倍 増 加 し た (Fig. 4)。

Fig. 4 皮 膚 に お け る I型 コ ラ ー ゲ ン 、 IV型 コ ラ ー ゲ ン 、 MMP-1お よ び MMP-9の 発 現 量 ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ テ ィ ン グ に よ り 皮 膚 中 のI型 コ ラ ー ゲ ン 、 IV型 コ ラ ー ゲ ン 、 MMP-1お よ びMMP-9の 発 現 を lumino-image analyzerを 用 い て 検 出 し 、 数 値 化 し た 。 値 は β-actinに よ り 標 準 化 し 、 平 均 値±SD値 で 示 し た 。 Student’s t-test (n = 5)。 * p < 0.05。 4. 皮 膚 中 マ ス ト 細 胞 の 発 現 数 マ ス ト 細 胞 が 関 節 リ ウ マ チ の 病 態 や 他 の 疾 患 に よ り 生 じ る 乾 燥 皮 膚 に 関 わ っ て い る と 報 告 さ れ て い る こ と か ら[Ref. 6, 16]、 本 研 究 で は 皮 膚 中 の マ ス ト 細 胞 の 発 現 数 を 計 測 し た 。 ト ル イ ジ ン ブ ル ー 染 色 の 結 果 、 コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス の 皮 膚 中 に 比 べ て 、 関 節 炎 マ ウ ス の 皮 膚 中 で は マ ス ト 細 胞 の 発 現 数 が 約4倍 増 加 し て い た (Fig. 5)。

Fig. 5 関 節 炎 マ ウ ス の 皮 膚 に お け る マ ス ト 細 胞 の 発 現 数

皮 膚 切 片 に お け る マ ス ト 細 胞 を ト ル イ ジ ン ブ ル ー 染 色 に よ り 検 出 し た 後 、 発 現 数 を 計 測 し た 。Scale bar = 200 μm。 Student’s t-test (n = 5)。 * p < 0.05。

5. 血 漿 中 の ヒ ス タ ミ ン 濃 度 ヒ ス タ ミ ン は マ ス ト 細 胞 か ら 特 異 的 に 脱 顆 粒 さ れ る 因 子 で あ り 、 関 節 リ ウ マ チ 患 者 の 滑 膜 に て 増 加 し て い る と 報 告 さ れ て い る[Ref. 16]。 し た が っ て 、 乾 燥 皮 膚 の 発 現 に 関 わ っ て い る 可 能 性 が あ り 、 本 研 究 に お い て は 血 漿 中 の ヒ ス タ ミ ン 濃 度 をELISAに よ り 、 測 定 し た 。 ヒ ス タ ミ ン は コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス と 比 べ て 、 関 節 炎 マ ウ ス で は 約2倍 増 加 し た (Fig. 6)。 Fig. 6 血 漿 中 の ヒ ス タ ミ ン 濃 度

6. 抗 c-kit抗 体 投 与 に よ る 影 響

上 記 の よ う に 関 節 炎 に よ り 発 現 し た 乾 燥 皮 膚 に お い て も マ ス ト 細 胞 数 の 増 加 が 観 察 で き た 。 し か し な が ら 、 マ ス ト 細 胞 数 の 増 加 が 関 節 炎 に お け る 乾 燥 皮 膚 発 現 の 要 因 か は 明 ら か で は な い た め 、 マ ス ト 細 胞 の 増 殖 に 関 わ る 因 子 で あ るc-kitの 抗 体 を 投 与 し た[Ref. 21]。 抗 c-kit抗 体 を 投 与 し た 関 節 炎 マ ウ ス で は 、 後 肢 容 積 に 変 化 は 無 か っ た が(Fig. 7A)、 無 投 与 の 関 節 炎 マ ウ ス で 上 昇 し た TEWLを コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス と 同 程 度 に 低 下 さ せ 、 ま た 、 皮 膚 の 厚 さ も コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス と 同 程 度 で あ っ た(Fig. 7B, 7C)。 本 モ デ ル マ ウ ス に お い て も 乾 燥 皮 膚 発 現 に はMMPに よ る コ ラ ー ゲ ン の 分 解 や ヒ ス タ ミ ン の 増 加 が 見 ら れ た た め 、 こ れ ら が マ ス ト 細 胞 の 増 加 に よ っ て 起 こ る こ と を 確 認 す る た め に 、 そ れ ら の 増 減 を 抗c-kit抗 体 を 投 与 し た 関 節 炎 マ ウ ス 、 無 投 与 の 関 節 炎 マ ウ ス 、 コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス で 比 較 し た 。 抗c-kit抗 体 の 投 与 に よ り 、 皮 膚 中 のI型 コ ラ ー ゲ ン 発 現 の 減 少 は 無 投 与 の 関 節 炎 マ ウ ス よ り 抑 え ら れ 、 コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス と 同 程 度 で あ っ た ほ か 、MMP-1発 現 の 増 加 も 抑 制 さ れ 、 コ ン ト ロ ー ル の 値 ま で 近 づ け ら れ た(Fig. 7D)。 皮 膚 中 の マ ス ト 細 胞 数 お よ び 血 中 ヒ ス タ ミ ン は 減 少 し て お り 、 マ ス ト 細 胞 数 に 関 し て は コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス と 同 程 度 で あ っ た が 、 ヒ ス タ ミ ン は コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス の 値 ま で は 抑 え ら れ て い な か っ た (Fig. 7E, 7F)。

Fig. 7 関 節 炎 マ ウ ス に お け る 乾 燥 皮 膚 に お け る 抗 c-kit抗 体 投 与 に よ る 効 果

A) 抗 c-kit抗 体 投 与 に よ る 後 肢 容 積 を 比 較 し た 。 B) 背 部 皮 膚 に お け る TEWLを 測 定 し た 。 C) HE染 色 を 実 施 し た 皮 膚 切 片 を 顕 微 鏡 に て 観 察 し 、 無 作 為 に 抽 出 し た 10枚 の 画 像 に お け る 表 皮 か ら 皮 下 組 織 に 至 る ま で の 厚 さ を 測 定 し た 。Scale bar = 200 μm 。 D) 皮 膚 に お け る I型 コ ラ ー ゲ ン お よ びMMP-1の 発 現 を 検 出 し 、 数 値 化 し た 。 値 は β-actinに よ っ て 標 準 化 し 、 平 均 値±SD値 で 示 し た 。 E) 皮 膚 切 片 に お け る マ ス ト 細 胞 を ト ル イ ジ ン ブ ル ー 染 色 に よ り 検 出 し た 後 、 発 現 数 を 計 測 し た 。Scale bar = 200 μm 。 F) 血 漿 中 の ヒ ス タ ミ ン を ELISAに よ り 測 定 し た 。 測 定 値 は 平 均 値±SD値 と し て 示 し た 。 Tukey's test (n = 5)。 * p < 0.05。

第

4 節 考 察

コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス に 比 べ て 後 肢 容 積 が 増 加 し た 関 節 炎 マ ウ ス で は 、TEWLお よ び 皮 膚 中MMPs発 現 が 上 昇 し 、 I型 お よ び IV型 コ ラ ー ゲ ン は 減 少 し た (Fig. 3A, 4)。 こ れ ら の こ と か ら 、 コ ラ ー ゲ ン 誘 発 関 節 炎 モ デ ル マ ウ ス は 臨 床 報 告 に 合 致 す る 乾 燥 皮 膚 の 発 現 を 認 め た の で 、 関 節 リ ウ マ チ に お け る 乾 燥 皮 膚 の 評 価 に 適 し た モ デ ル で あ る と 考 え ら れ た 。

コ ラ ー ゲ ン の 分 解 に は マ ス ト 細 胞 よ り 放 出 さ れ る ト リ プ タ ー ゼ やTNF-αに よ っ て 活 性 化 さ れ たMMPsに よ る 分 解 、 Reactive oxygen species (ROS)に よ る 直 接 的 な 分 解 や 線 維 芽 細 胞 の 変 性 に よ る コ ラ ー ゲ ン 新 生 の 阻 害 な ど が あ る[Ref. 24]。 乾 燥 皮 膚 お よ び 関 節 炎 の 各 々 の 発 症 に マ ス ト 細 胞 の 関 わ り が 報 告 さ れ て い る[Ref. 6, 16]。 本 研 究 に お い て も 関 節 炎 マ ウ ス の 皮 膚 で の マ ス ト 細 胞 数 、 MMP-1お よ び MMP-9の 発 現 が 増 加 し て い た ほ か (Fig. 4, 5)、 血 液 中 の ヒ ス タ ミ ン に つ い て も 関 節 炎 マ ウ ス で 増 加 し て い た(Fig. 6)。 マ ス ト 細 胞 の 増 殖 を 抑 制 す る 抗 c-kit抗 体 を 関 節 炎 マ ウ ス 投 与 す る こ と で 、 関 節 炎 に よ る 後 肢 容 積 は 増 加 し た ま ま で あ っ た が 、TEWLの 上 昇 が 抑 制 さ れ た 。 ま た 、 抗 c-kit抗 体 投 与 を 投 与 し た 関 節 炎 マ ウ ス で は 、 皮 膚 中 の マ ス ト 細 胞 数 の 増 加 やMMP-1の 増 加 が 抑 制 さ れ 、 皮 膚 中 の I型 コ ラ ー ゲ ン の 減 少 も 抑 制 さ れ た ほ か 、 血 中 の 血 中 ヒ ス タ ミ ン 量 の 減 少 が 確 認 で き た (Fig. 7)。 こ れ ら の 報 告 と 本 研 究 の 結 果 か ら 、 マ ス ト 細 胞 に よ っ て 活 性 化 さ れ た MMPsが コ ラ ー ゲ ン 分 解 を 導 き 、 関 節 炎 に よ る 乾 燥 皮 膚 を 招 く 可 能 性 が 考 え ら れ た 。 ま た 、 ヒ ス タ ミ ン は 皮 膚 に 炎 症 を 起 こ す こ と や 、 マ ス ト 細 胞 か ら 脱 顆 粒 さ れ た ヒ ス タ ミ ン が マ ス ト 細 胞 を さ ら に 活 性 化 さ せ 、 マ ス ト 細 胞 中 の 顆 粒 の 成 熟 を 促 進 さ せ る こ と 、 抗 ヒ ス タ ミ ン 薬 の 投 与 に よ り 、TEWLの 上 昇 が 抑 え ら れ た と の 報 告 が あ る こ と か ら[Ref. 25, 26]、 本 章 に お け る 関 節 炎 モ デ ル の 乾 燥 皮 膚 発 現 に ヒ ス タ ミ ン の 増 加 も 関 わ る こ と が 示 唆 で き た 。

Fig. 8 関 節 炎 に よ り 誘 導 さ れ る 乾 燥 皮 膚 発 現 に お け る マ ス ト 細 胞 の 役 割

第

5 節 小 括

本 章 の 結 果 は 、 コ ラ ー ゲ ン 誘 導 関 節 炎 マ ウ ス に お け る 乾 燥 皮 膚 発 現 の 再 現 性 を 確 認 し 、 そ の 発 現 の メ カ ニ ズ ム に は マ ス ト 細 胞 が 関 与 し て い る こ と を 示 し た(Fig. 8)。マ ス ト 細 胞 の 増 殖 に 関 わ る c-kit の 抗 体 を 投 与 す る こ と で 、関 節 炎 マ ウ ス に お け る 乾 燥 皮 膚 の 症 状 が 改 善 さ れ た こ と は 、こ の 結 果 を 支 持 し て い る 。し た が っ て 、 マ ス ト 細 胞 の 増 加 を 防 ぐ こ と が 関 節 炎 に よ る 乾 燥 皮 膚 の 発 現 を 軽 減 す る 1 つ の 手 段 に な る こ と を 示 し て い る 。

第

2 章

関 節 炎 モ デ ル マ ウ ス に お け る マ ス ト 細 胞 を 介 し た

Reactive

Oxygen Species お よ び ス ト レ スホ ル モ ン の 乾 燥皮 膚 へ の 影 響

第

1 節 緒 言

第 1 章 で は 、 関 節 炎 モ デ ル マ ウ ス で 乾 燥 皮 膚 を 確 認 し 、 そ の 発 症 に マ ス ト 細 胞 の 活 性 化 が 関 わ っ て い る こ と を 明 ら か に し た 。 し か し な が ら 、 乾 燥 皮 膚 に お い て マ ス ト 細 胞 を 活 性 化 し 、 増 加 さ せ る 因 子 に つ い て は 明 ら か と な っ て い な い 。 し た が っ て 本 章 で は 、 マ ス ト 細 胞 の 活 性 化 に 関 わ る 因 子 の 候 補 を 選 出 し 、 そ れ ら の 影 響 に つ い て 検 討 し た 。 最 近 の 研 究 に お い て 、 皮 膚 バ リ ア 機 能 低 下 を 引 き 起 こ す ア ト ピ ー 性 皮 膚 炎 で は 、thymic stromal lymphopoietin (TSLP)が 関 わ っ て い る と の 報 告 が あ る [Ref. 27]。 TSLP は 上 皮 細 胞 よ り 放 出 さ れ 、 マ ス ト 細 胞 や 樹 状 細 胞 な ど の 免 疫 担 当 細 胞 を 活 性 化 す る の で 、 免 疫 反 応 に 重 要 な 役 割 を 担 っ て い る[Ref. 28]。 こ の よ う な 報 告 か ら 、 関 節 炎 に お け る 乾 燥 皮 膚 の マ ス ト 細 胞 の 活 性 化 に 関 わ っ て い る 可 能 性 が 示 唆 さ れ た 。 関 節 リ ウ マ チ で は 好 中 球 や マ ク ロ フ ァ ー ジ が 関 節 の 滑 膜 に 集 積 し 、 貪 食 作 用 に よ り 関 節 破 壊 を も た ら す[Ref. 29]。 特 に 好 中 球 は 関 節 リ ウ マ チ 患 者 の 滑 膜 液 に お け る 細 胞 の 約 90%を 占 め る [Ref. 30]。 ま た 、 好 中 球 は 関 節 症 状 の み な ら ず 、 急 性 熱 性 好 中 球 性 皮 膚 症 の よ う に 皮 膚 症 状 に 関 連 す る 疾 患 も 存 在 す る[Ref. 31]。 好 中 球 は Reactive oxygen species (ROS)を 産 生 し て お り 、 関 節 リ ウ マ チ 患 者 に お け る 関 節 の 炎 症 部 位 に お い て は 、ROS が 増 加 し て い る [Ref. 32]。 ROS は 外 来 異 物 の 除 去 や 細 胞 内 シ グ ナ ル の 応 答 に 必 要 な 物 質 で あ る が 、 過 剰 に 生 成 し た ROS は 、 癌 や 動 脈 硬 化 、 糖 尿 病 、 胃 潰 瘍 、 大 腸 炎 、 皮 膚 疾 患 な ど 多 く の 疾 患 の 発 症 に 関 わ る[Ref. 33]。 ROS が 線 維 芽 細 胞 の 変 性 を 起 こ し 、 コ ラ ー ゲ ン の 生 成 を 阻 害 す る こ と で 皮 膚 炎 を 起 こ す こ と や[Ref. 24]、 ROS を 低 減 す る こ と で 皮 膚 に お け る コ ラ ー ゲ ン の 減 少 を 抑 制 し 、 乾 燥 皮 膚 を 抑 制 し た 報 告 が あ る[Ref. 7]。 ま た 、 ROS は マ ス ト 細 胞 か ら ヒ ス タ ミ ン が 脱 顆 粒 す る 際 に 作 用 す る こ と や [Ref. 34]、 TSLP の シ グ ナ ル を 調 節 し て い る と の 報 告 が あ る [Ref. 35]。 こ れ ら の こ と か ら 、 好 中 球 や 好 中 球 か ら 産 生 さ れ る ROS が TSLP に 影 響 を 及 ぼ し 、 マ ス ト 細 胞 を 介

し て 関 節 炎 に お け る 乾 燥 皮 膚 を 誘 導 し て い る 可 能 性 が 考 え ら れ る が 、 こ の こ と を 解 析 し た 報 告 は な さ れ て い な い 。

関 節 リ ウ マ チ で は 、 関 節 の 激 し い 痛 み を 伴 う た め 、 罹 患 者 に は 身 体 的 に も 精 神 的 に も ス ト レ ス が 生 じ て い る 。 そ れ ら ス ト レ ス が 、 グ ル コ コ ル チ コ イ ド の 増 加 を も た ら す[Ref. 36]。 ス ト レ ス に よ り 、 視 床 下 部 -下 垂 体 -副 腎 系 が 活 性 化 さ れ 、 下 垂 体 を 刺 激 し 、adrenocorticotropic hormone (ACTH)を 分 泌 す る 。 そ の 後 、 ACTH は 副 腎 皮 質 か ら の グ ル コ コ ル チ コ イ ド の 分 泌 を 促 進 す る 。 グ ル コ コ ル チ コ イ ド 類 似 の 合 成 ス テ ロ イ ド(デ キ サ メ タ ゾ ン )に よ り TSLP の 発 現 が 低 下 し た 報 告 の よ う に[Ref. 37]、 グ ル コ コ ル チ コ イ ド は 免 疫 反 応 を 抑 え る 作 用 を 有 す る 一 方 で 、Toll like receptor 2 遺 伝 子 の 発 現 を 上 昇 さ せ る こ と で 皮 膚 の 機 能 異 常 を 引 き 起 こ す こ と が 報 告 さ れ て い る[Ref. 38]。 グ ル コ コ ル チ コ イ ド が 関 節 炎 に お け る 乾 燥 皮 膚 の 発 現 に 関 わ っ て い る 可 能 性 が 考 え ら れ る が 、 そ の 詳 細 は 明 ら か と な っ て い な い 。 上 述 の よ う に 、 関 節 炎 の 乾 燥 皮 膚 に お け る マ ス ト 細 胞 活 性 化 に 、TSLP、 好 中 球 、ROS が 関 与 し て い る 可 能 性 が あ る が 詳 細 は 不 明 で あ る 。 し た が っ て 、 本 章 で は 抗 TSLP 抗 体 [Ref. 39]、 抗 好 中 球 抗 体 [Ref. 40]、 抗 酸 化 物 質 の グ ル タ チ オ ン 前 駆 体 と し て 活 性 酸 素 を 除 去 す る N-acetyl cysteine (NAC) [Ref. 41]を そ れ ぞ れ 投 与 す る こ と で マ ス ト 細 胞 活 性 化 へ の 影 響 を 確 認 し た 。 ま た 、 グ ル コ コ ル チ コ イ ド 受 容 体 遮 断 薬(RU486: mifepristone) [Ref. 42]を 投 与 す る こ と で 、 ス ト レ ス ホ ル モ ン で あ る グ ル コ コ ル チ コ イ ド の 関 節 炎 に お け る 乾 燥 皮 膚 の 発 現 へ の 関 与 に つ い て も 検 討 し た 。

第

2 節 実 験 方 法

1. 実 験 動 物 と そ の 飼 育 お よ び 処 置 第 1 章 同 様 に 、 10 週 齢 の 雄 性 DBA/1J コ ラ ー ゲ ン 誘 導 関 節 炎 マ ウ ス (関 節 炎 マ ウ ス)を 用 い た 。 本 章 に お い て も 、 日 本 エ ス エ ル シ ー 株 式 会 社 が コ ラ ー ゲ ン 誘 導 関 節 炎 処 置 を 実 施 し た も の を 購 入 し た 。 関 節 炎 処 置 を 行 わ な い DBA/1J マ ウ ス を コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス(n = 5)と し た 。 購 入 し た マ ウ ス は 第 1 章 と 同 条 件 で 馴 化 飼 育 し 、 馴 化 飼 育 後 、 各 試 薬 を 関 節 炎 マ ウ ス に 投 与 し た 。 各 試 薬 の 投 与 終 了 日 に 、 第 1 章 同 様 に 背 部 の 除 毛 に よ り 、 皮 膚 を 露 出 さ せ た 。 す べ て の 動 物 実 験 は 、 鈴 鹿 医 療 科 学 大 学 動 物 実 験 委 員 会 に よ る 研 究 計 画 書 の 承 認 を 得 た 後 に 、 総 理 府 の 「 実 験 動 物 の 飼 養 及 び 保 管 等 に 関 す る 基 準 」、 な ら び に 「 鈴 鹿 医 療 科 学 大 学 動 物 実 験 指 針(承 認 番 号 :第 66 号 )」 に 従 っ て 実 施 し た 。

2. 各 試 薬 の 投 与

馴 化 飼 育 後 、 各 中 和 抗 体 や 阻 害 剤 を 関 節 炎 マ ウ ス に 投 与 し た(Fig. 9)。 1 日 1 回 4 日 間 連 続 に て 0.08 µg/0.2 mL/mouse の 抗 TSLP 中 和 抗 体 (R&D System Inc., Minneapolis, USA)を Phosphate buffered salts (PBS)に 溶 解 さ せ 、 腹 腔 内 投 与 し た 。 試 験 2 日 目 に 、 250 µg/0.2 mL/mouse の 抗 好 中 球 モ ノ ク ロ ー ナ ル 中 和 抗 体(AdipoGen Life Sciences, Inc., San Diego, CA, USA)を PBS に 溶 解 さ せ 、 腹 腔 内 に 単 回 投 与 し た 。1 日 1 回 4 日 間 連 続 に て 200 mg/kg の NAC

(Nacalai Tesque, Kyoto, Japan)を 0.1%の Dimethyl sulfoxide (DMSO)に 溶 解 さ せ 、 腹 腔 内 投 与 し た 。1 日 1 回 4 日 間 連 続 に て 30 mg/kg の RU486 (Roussel-Uclaf, Paris, France)を コ ー ン 油 に 溶 解 さ せ 、 腹 腔 内 投 与 し た 。

Fig. 9 実 験 方 法 3. マ ウ ス 後 肢 容 積 の 測 定 除 毛 処 置 の 24 時 間 後 、 ペ ン ト バ ル ビ タ ー ル ナ ト リ ウ ム の 腹 腔 内 投 与 に て マ ウ ス を 麻 酔 し 、 第 1 章 同 様 に Cosgrove ら の 方 法 に 則 り 、 後 肢 容 積 を 測 定 し た [Ref. 22]。 4. マ ウ ス 背 部 皮 膚 の TEWL の 測 定

手 順 3 終 了 後 、 マ ウ ス の 背 部 皮 膚 の TEWL を Tewameter®_{TM300 (Courage +}

Khazaka Electronic)を 用 い て 測 定 し た [Ref. 23]。 測 定 値 は 第 1 章 と 同 法 に よ り 算 出 し た 。

5. マ ウ ス の 血 液 お よ び 皮 膚 組 織 の 採 取

手 順 3 お よ び 4 終 了 後 、 マ ウ ス の 心 臓 か ら 約 1 mL の 血 液 を 採 取 し た 。 ま た 、 縦 1.5 cm×横 0.8 cm 四 方 の 背 部 皮 膚 組 織 を 採 取 し 、 － 80°C で 凍 結 結 保 存 し た 。

6. 皮 膚 組 織 の 染 色

採 取 し た 皮 膚 組 織 の 一 部 は 免 疫 組 織 学 的 評 価 に 用 い る た め 、 パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド 溶 液(4%, Wako)で 固 定 し た 。 固 定 さ れ た 皮 膚 組 織 は Tissue-Tek O.C.T. Compound (Sakura Finetek)を 用 い て 凍 結 包 埋 し 、 5 μm の 厚 さ で ミ ク ロ ト ー ム に て 薄 切 を 行 っ た 。 薄 切 し た 切 片 は HE に よ っ て 染 色 し た 後 、 光 学 顕 微 鏡 に て 組 織 学 的 評 価 を 行 い 、 無 作 為 に 抽 出 し た 10 枚 の 画 像 に お け る 表 皮 か ら 皮 下 組 織 に 至 る ま で の 厚 さ を 測 定 し た 。 ま た 、 皮 膚 中 の マ ス ト 細 胞 は ト ル イ ジ ン ブ ル ー 染 色 し 、 細 胞 数 を Image J ソ フ ト ウ ェ ア を 用 い て 計 測 し た 。 無 作 為 に 3 か 所 の エ リ ア を 抽 出 し 、 単 位 面 積(mm2_{)あ た り の マ ス ト 細 胞 数 の 平 均 値 を 算 出 し た 。} 7. 血 中 分 子 マ ー カ ー の 濃 度 測 定 心 臓 か ら 採 取 し た 血 液 サ ン プ ル を 4°C、 3,000 ×gで 10 分 間 遠 心 分 離 し 、 上 清 部 分(血 漿 )を 測 定 に 用 い た 。 血 漿 中 の TSLP、 IL-6、 ヒ ス タ ミ ン 、 コ ル チ コ ス テ ロ ン 濃 度 は 、 そ れ ぞ れ の ELISA kit (TSLP, R&D Systems; IL-6, BioLegend, San Diego, CA, USA; Histamine, Bertin Pharma; Corticosterone, Enzo Life Sciences Inc., Farmingdale, NY, USA )の プ ロ ト コ ル に 従 い 、 マ イ ク ロ プ レ ー ト リ ー ダ ー に て 450 nm の 波 長 で 測 定 し た 。 ROS は OxyselectTM in vitro

ROS/RNS 測 定 キ ッ ト (Cell biolabs, Inc., San Diego, CA, USA)を 使 用 し 、 マ イ ク ロ プ レ ー ト リ ー ダ ー に て 励 起 480 nm/蛍 光 530 nm の 波 長 で 測 定 し た 。 8. 統 計 解 析 全 て の デ ー タ は コ ン ト ロ ー ル に 対 す る 比 率 と し 、 平 均 値±SD 値 で 示 し た 。 関 節 炎 マ ウ ス に 対 す る 各 群 の 比 較 に は Student’s t-test を 用 い た 。 危 険 率 が 5%未 満 の 場 合 を 統 計 学 的 に 有 意 と 判 断 し た 。 統 計 解 析 は IBM SPSS Statistics24 に て 実 施 し た 。

第

3 節 結 果

1. 各 試 薬 投 与 に よ る 後 肢 容 積 の 比 較 抗 TSLP 抗 体 、 抗 好 中 球 抗 体 、 NAC、 NAC+RU486 投 与 に よ る 関 節 の 炎 症 状 態 を 比 較 す る た め に 、 マ ウ ス の 後 肢 容 積 を 測 定 し た 。 関 節 炎 マ ウ ス の 後 肢 容 積 は コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス よ り も 約 2 倍 増 加 し た 。 し か し 、 後 肢 容 積 は 各 試 薬 を 投 与 し た 関 節 炎 マ ウ ス と 無 投 与 の 関 節 炎 マ ウ ス と の 間 で 差 異 は な か っ た(Fig. 10)。 Fig. 10 各 試 薬 投 与 に よ る 後 肢 容 積 の 比 較 後 肢 を 蒸 留 水 に て 満 た し た ビ ー カ ー に 浸 け る こ と で 容 積 を 測 定 し た 。 値 は コ ン ト ロ ー ル に 対 す る 比 率 と し 、 平 均 値±SD 値 で 示 し た 。 Student’s t-test (n = 5)。 * p < 0.05。 2. 各 試 薬 投 与 マ ウ ス と 関 節 炎 マ ウ ス と の 皮 膚 の 比 較 各 試 薬 の 投 与 に よ る 乾 燥 皮 膚 の 状 態 を 確 認 す る た め に 、 マ ウ ス 背 部 皮 膚 の TEWL の 測 定 お よ び HE 染 色 に よ る 組 織 学 的 な 検 討 を 行 っ た 。 関 節 炎 マ ウ ス で は コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス と 比 較 し て 、TEWL が 約 2.5 倍 上 昇 し た が 、 各 試 薬 を 投 与 し た 関 節 炎 マ ウ ス の TEWL は 抗 TSLP 抗 体 を 投 与 し た マ ウ ス を 除 い て 、 コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス と 同 程 度 ま で 低 下 し た(Fig. 11A)。 コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス の 皮 膚 と 比 較 し た 場 合 、 関 節 炎 マ ウ ス の 皮 膚 は 約 2 倍 厚 か っ た が 、 各 試 薬 を 投 与 し た 関 節 炎 マ ウ ス の 皮 膚 の 厚 さ は 抗 TSLP 抗 体 と NAC を 投 与 し た マ ウ ス を 除 い て 、 コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス と 同 程 度 ま で 減 少 し た(Fig. 11B)。

Fig. 11 各 試 薬 投 与 に よ る 皮 膚 状 態 の 変 化 A) 除 毛 処 置 し た 翌 日 の TEWL 測 定 値 を 示 し た 。 B) 皮 膚 切 片 を HE 染 色 し た 後 、 光 学 顕 微 鏡 で 観 察 し た 。 観 察 に よ り 得 ら れ た 皮 膚 切 片 の 画 像 を 無 作 為 に 抽 出 し 、 表 皮 か ら 皮 下 組 織 に 至 る ま で の 厚 さ を 測 定 し た 。Scale bar = 200 μm。 値 は コ ン ト ロ ー ル に 対 す る 比 率 と し 、 平 均 値±SD 値 で 示 し た 。 Student’s t-test (n = 5)。 * p < 0.05。 3. 血 漿 中 の TSLP、 ROS、 お よ び IL-6 濃 度 の 解 析 抗 TSLP 抗 体 や NAC の 投 与 に よ り 、 乾 燥 皮 膚 が 改 善 し た こ と か ら 、 TSLP や ROS の 値 が 変 動 し て い る 可 能 性 が 考 え ら れ た た め 、 そ れ ら の 血 中 濃 度 を 測 定 し た 。 関 節 炎 マ ウ ス に お け る TSLP お よ び ROS 濃 度 は コ ン ト ロ ー ル と 比 較 し て 、 そ れ ぞ れ 約 15 倍 、 1.5 倍 高 か っ た 。 一 方 、 無 投 与 の 関 節 炎 マ ウ ス よ り 各 試 薬 を 投 与 し た 関 節 炎 マ ウ ス で は い ず れ の 因 子 も 低 下 し て い た(Fig. 12)。 抗 TSLP 抗 体 を 投 与 す る こ と で TSLP は コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス と 同 程 度 ま で 抑 え ら れ て い た が 、 NAC の み で は コ ン ト ロ ー ル と 同 程 度 ま で 抑 え る こ と は で き な か っ た 。 し た が っ て 、NAC 以 外 の 因 子 が TSLP を 活 性 化 し て い る 可 能 性 が あ り 、 既 報 に て TSLP を 活 性 化 す る こ と が 報 告 さ れ て い る グ ル コ コ ル チ コ イ ド に 着 目 し 、 グ ル コ コ ル チ コ イ ド 受 容 体 遮 断 薬 で あ る RU486 を 併 用 さ せ た 。 NAC+RU486 を 投 与 し た 関 節 炎 マ ウ ス で は コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス と 同 程 度 ま で 減 少 し た(Fig. 12A)。 ROS は 抗 TSLP 抗 体 お よ び NAC を 投 与 し た 関 節 炎 マ ウ ス で は コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス と 同 程 度 ま で 減 少 し 、 抗 好 中 球 抗 体 お よ び NAC+RU486 を 投 与 し た 関 節 炎 マ ウ ス で は さ ら に 減 少 し て い た(Fig. 12B)。 ま た 、 第 1 章 で は マ ス ト 細 胞 か ら 脱 顆 粒 す る ヒ ス タ ミ ン の 増 加 が 関 節 炎 に お け る 乾 燥 皮 膚 の 発 現 に 関 わ る こ と を 明 ら か に し た が 、 マ ス ト 細 胞 か ら は TNF-α や IL-6 な ど の 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン が 放 出 さ れ る こ と が 報 告 さ れ て い る[Ref. 43]。 ヒ ス タ ミ ン は ケ ラ チ ノ サ イ ト の IL-6 供 給 を 増 加

さ せ る 働 き あ り[Ref. 44]、 IL-6 は 、 核 内 転 写 因 子 で あ る signal transducers and activator of transcription (STAT) 3 を 活 性 化 さ せ る こ と で Th17 の 分 化 を 促 し [Ref. 45, 46]、 ア ト ピ ー 性 皮 膚 炎 の よ う な 乾 燥 皮 膚 を 伴 う 皮 膚 疾 患 に 関 わ る IL-17 を 放 出 す る 働 き が あ る [Ref. 47]。 こ れ ら が 乾 燥 皮 膚 に 関 わ る 可 能 性 も 考 え ら れ る 。 し た が っ て 本 研 究 で は ELISA に よ り 、 血 漿 中 の IL-6 濃 度 を 測 定 し た 。 関 節 炎 マ ウ ス に お け る IL-6 濃 度 は コ ン ト ロ ー ル と 比 較 し て 、 約 20 倍 高 か っ た 。 IL-6 は 、 抗 TSLP 抗 体 、 NAC、 NAC+RU486 を 投 与 し た 関 節 炎 マ ウ ス で は コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス と 同 程 度 ま で 減 少 し た(Fig. 12C)。

Fig. 12 各 試 薬 投 与 に よ る TSLP、 ROS お よ び IL-6 へ の 影 響

A) ELISA に よ り 、 血 漿 の TSLP を 測 定 し た 。 B) ELISA に よ り 、 血 漿 の ROS を 測 定 し た 。C) ELISA に よ り 、 血 漿 の IL-6 を 測 定 し た 。 値 は コ ン ト ロ ー ル に 対 す る 比 率 と し 、 平 均 値±SD 値 で 示 し た 。 Student’s t-test (n = 5)。 * p < 0.05。 4. 皮 膚 中 の マ ス ト 細 胞 数 お よ び 血 漿 中 ヒ ス タ ミ ン 濃 度 の 解 析 マ ス ト 細 胞 を 活 性 化 す る 因 子 の 阻 害 剤 や 中 和 抗 体 を 投 与 し た 際 の 皮 膚 中 の マ ス ト 細 胞 数 の 変 化 に つ い て 、 ト ル イ ジ ン ブ ル ー 染 色 を 用 い て 組 織 学 的 に 評 価 し た 。 マ ス ト 細 胞 は コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス と 比 較 し て 関 節 炎 マ ウ ス に お い て 約 2.5 倍 増 加 し た(Fig. 13A)。 し か し な が ら 、 関 節 炎 マ ウ ス に 比 べ 、 各 試 薬 を 投 与 し た 関 節 炎 マ ウ ス で は 皮 膚 の マ ス ト 細 胞 数 が 減 少 し た 。 さ ら に 、 各 試 薬 投 与 に お け る マ ウ ス の ヒ ス タ ミ ン 濃 度 を ELISA に よ り 測 定 し た 。 ヒ ス タ ミ ン は 、 コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス よ り も 関 節 炎 マ ウ ス に お い て 約 10 倍 増 加 し た が 、 各 試 薬 を 投 与 し た マ ウ ス で は 減 少 し て い た(Fig. 13B)。 抗 TSLP 抗 体 、 NAC+RU486 を 投 与 し た 関 節 炎 マ ウ ス で は 、 コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス と 同 程 度 ま で 減 少 し た 。

Fig. 13 各 試 薬 投 与 に よ る 皮 膚 中 マ ス ト 細 胞 数 お よ び 血 漿 中 ヒ ス タ ミ ン へ の 影 響 A) 皮 膚 切 片 に お け る マ ス ト 細 胞 を ト ル イ ジ ン ブ ル ー 染 色 に よ り 検 出 し 、 計 測 し た 。 B) 血 漿 中 の ヒ ス タ ミ ン 濃 度 を ELISA に よ り 測 定 し た 。 値 は コ ン ト ロ ー ル に 対 す る 比 率 と し 、 平 均 値±SD 値 で 示 し た 。 Student’s t-test (n = 5)。 * p < 0.05。 5. 血 漿 中 の コ ル チ コ ス テ ロ ン 濃 度 の 解 析 血 漿 中 の グ ル コ コ ル チ コ イ ド(コ ル チ コ ス テ ロ ン )を ELISA に よ り 測 定 し た 。 関 節 炎 マ ウ ス に お け る コ ル チ コ ス テ ロ ン は 、 コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス よ り 約 10 倍 高 か っ た 。 関 節 炎 マ ウ ス と 各 試 薬 を 投 与 し た 関 節 炎 マ ウ ス 間 で の 差 異 は な か っ た (Fig. 14)。

Fig. 14 各 試 薬 投 与 に よ る 血 漿 中 コ ル チ コ ス テ ロ ン へ の 影 響 血 漿 中 コ ル チ コ ス テ ロ ン 濃 度 は ELISA に よ り 測 定 し た 。 値 は コ ン ト ロ ー ル に 対 す る 比 率 と し 、 平 均 値±SD 値 で 示 し た 。 Student’s t-test (n = 5)。 * p < 0.05。

第

4 節 考 察

本 章 で は 、 関 節 炎 に お け る 乾 燥 皮 膚 症 状 に お い て TSLP、 好 中 球 、 ROS な ら び に ス ト レ ス ホ ル モ ン の 一 種 で あ る グ ル コ コ ル チ コ イ ド な ど 、 そ れ ぞ れ の 中 和 抗 体 や 阻 害 剤 の 投 与 を 行 い 、 そ れ ら が 、 マ ス ト 細 胞 を 刺 激 し 乾 燥 皮 膚 を 発 現 す る か ど う か を 検 討 し た 。 関 節 炎 マ ウ ス で は 、 前 章 に て 論 述 し た マ ス ト 細 胞 や ヒ ス タ ミ ン の 増 加 に 加 え 、TSLP、 ROS、 IL-6 お よ び コ ル チ コ ス テ ロ ン 濃 度 が 増 加 し た た め (Fig. 12-14)、 こ れ ら の 因 子 が 乾 燥 皮 膚 を 引 き 起 こ し て い る こ と が 考 え ら れ た 。 抗 TSLP 抗 体 の 投 与 を 行 っ た 結 果 、 TEWL お よ び 皮 膚 の 厚 さ は 統 計 的 有 意 差 が な か っ た も の の 非 投 与 の 関 節 炎 マ ウ ス に 比 べ る と 減 少 し て い た(Fig. 11)。 ま た 、TSLP や マ ス ト 細 胞 数 を 減 少 さ せ 、 ヒ ス タ ミ ン も 減 少 し た (Fig. 13)。 し か し な が ら 、TEWL や 皮 膚 の 厚 さ は コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス ま で 戻 ら な か っ た 。 し た が っ て 、TSLP の 他 に も マ ス ト 細 胞 /ヒ ス タ ミ ン 系 に 関 わ る 因 子 が あ り 、 乾 燥 皮 膚 を 引 き 起 こ し て い る 可 能 性 が 考 え ら れ た 。 抗 好 中 球 抗 体 を 投 与 し た 関 節 炎 マ ウ ス で は 、TEWL が 低 下 し 、 皮 膚 の 厚 さ が 減 少 し て い た(Fig. 11)。 ま た 、 皮 膚 中 マ ス ト 細 胞 、 血 中 TSLP、 IL-6、 ROS な ら び に ヒ ス タ ミ ン の 増 加 が 抑 制 さ れ て い た(Fig. 12, 13)。 な か で も ROS に 関 し て は 、 コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス よ り 低 い 値 と な っ て い た 。 し か し な が ら 、 抗 好 中 球 抗 体

の 投 与 に よ っ て TSLP、 IL-6 お よ び ヒ ス タ ミ ン の 値 は コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス ま で は 抑 え ら れ な か っ た(Fig. 12, 13)。 こ れ ら の 結 果 か ら 、 好 中 球 は ROS 産 生 に よ る マ ス ト 細 胞 数 の 増 加 に よ り 、 関 節 炎 に お け る 乾 燥 皮 膚 を 発 現 さ せ る こ と が 考 え ら れ た 。 NAC を 投 与 し た 関 節 炎 マ ウ ス で は 無 投 与 の 関 節 炎 マ ウ ス と 比 較 し て 、 TEWL が 低 下 し 、 皮 膚 の 厚 さ が 減 少 傾 向 で あ っ た(Fig. 11)。 ま た 皮 膚 中 マ ス ト 細 胞 数 や 血 中 TSLP、 IL-6、 ROS お よ び ヒ ス タ ミ ン を 減 少 さ せ た (Fig. 12, 13)。 こ れ ら の 結 果 か ら 、 本 章 で 用 い た キ ッ ト に て 測 定 可 能 な ROS(H2O2、 一 酸 化 窒 素 、 ペ ル オ キ シ ラ ジ カ ル 、 ペ ル オ キ シ 亜 硝 酸)は 関 節 炎 マ ウ ス に お け る 乾 燥 皮 膚 の 誘 導 に 関 与 し て い る こ と が 示 さ れ た(Fig. 12C)。 ま た 、 NAC を 投 与 し た 関 節 炎 マ ウ ス に お い て も 抗 好 中 球 抗 体 を 投 与 し た 関 節 炎 マ ウ ス と 同 様 、IL-6、 TSLP、 マ ス ト 細 胞 お よ び ヒ ス タ ミ ン は コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス の 値 ま で 抑 え ら れ な か っ た 。 し た が っ て 、ROS 以 外 の 因 子 が TSLP お よ び マ ス ト 細 胞 に 影 響 を 及 ぼ し て い る 可 能 性 が 考 え ら れ た た め 、 既 報 に て TSLP を 活 性 化 す る こ と が 報 告 さ れ て い る グ ル コ コ ル チ コ イ ド に 着 目 し た 。 NAC+RU486 を 併 用 し た 関 節 炎 マ ウ ス で は 、 TEWL お よ び 皮 膚 の 厚 さ の い ず れ も コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス と 同 程 度 ま で 抑 え ら れ て お り 、 乾 燥 皮 膚 が 抑 え ら れ て い る こ と が 明 ら か と な っ た(Fig. 11)。 ま た 、 皮 膚 中 マ ス ト 細 胞 数 や 血 中 TSLP、 IL-6、 ROS お よ び ヒ ス タ ミ ン の 値 を コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス に コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス の レ ベ ル に ま で 抑 え ら れ た(Fig. 12, 13)。 RU486 に よ る 相 乗 的 な 効 果 は 、 NAC 単 独 投 与 以 上 の ROS や TSLP の 減 少 を も た ら し 、 マ ス ト 細 胞 数 を 減 少 さ せ る こ と で 、 乾 燥 皮 膚 を 改 善 し た と 考 え ら れ た 。 以 上 よ り 、 好 中 球 や ROS に 加 え て 、 ACTH/glucocorticoid 系 に よ る TSLP を 介 し た マ ス ト 細 胞 へ の 影 響 が 関 節 炎 に お け る 乾 燥 皮 膚 の 発 現 に 関 与 す る こ と が 示 さ れ た 。

Fig. 15 マ ス ト 細 胞 を 活 性 化 す る 因 子 が 関 節 炎 に お け る 乾 燥 皮 膚 を 誘 導 す る 反 応

第

5 節 小 括

本 章 で は 、 関 節 炎 マ ウ ス の 乾 燥 皮 膚 発 現 に お け る マ ス ト 細 胞 を 活 性 化 す る 因 子 と し て 、TSLP や 好 中 球 、 ROS、 グ ル コ コ ル チ コ イ ド が 関 与 す る こ と を 明 ら か に し た(Fig.15)。 な か で も ROS お よ び グ ル コ コ ル チ コ イ ド の 連 関 が TSLP を 介 し て マ ス ト 細 胞 を 活 性 化 し 、 関 節 炎 に お け る 乾 燥 皮 膚 の 発 現 に 関 与 す る こ と が 示 さ れ た 。

第

3 章

関 節 炎 モ デ ル マ ウ ス に お け る 乾 燥 皮 膚 発 現 に

Th2 細 胞 お よ び

Th17 細 胞 が 及 ぼす 影 響

第

1 節 緒 言

第 2 章 で は 、 ROS や グ ル コ コ ル チ コ イ ド な ど が TSLP を 介 し 、 マ ス ト 細 胞 活 性 化 す る こ と で 、 関 節 炎 モ デ ル マ ウ ス に お け る 乾 燥 皮 膚 の 発 現 に 関 与 し て い る こ と を 見 出 し た 。 前 章 ま で は マ ス ト 細 胞 を 中 心 に 検 討 を 行 っ て き た が 、TSLP か ら 刺 激 を 受 け る 免 疫 担 当 細 胞 は 様 々 で あ り 、 マ ス ト 細 胞 以 外 の 免 疫 担 当 細 胞 が 関 節 炎 に お け る 乾 燥 皮 膚 誘 導 に 関 わ る か に つ い て は 明 ら か で は な い 。 樹 状 細 胞 は 、 ナ イ ー ブ T(Th0)細 胞 を T helper (Th) 2 細 胞 や Th17 細 胞 に 分 化 さ せ る 免 疫 担 当 細 胞 の 一 種 と し て 、 生 体 内 に 取 り 込 ま れ た 抗 原 の 提 示 を 行 う 他 、 T 細 胞 や B 細 胞 を 分 化 さ せ る こ と で 生 体 防 御 を 担 っ て い る 。 TSLP が ミ エ ロ イ ド 樹 状 細 胞 を 活 性 化 し 、OX40 ligand の よ う な TNF ス ー パ ー フ ァ ミ リ ー や

Chemokine (C-C motif) ligand 17 (CCL17) (TARC: Thymus and activation regulated chemokine)の 発 現 を 誘 導 す る こ と で 、 Th0 細 胞 を Th2 細 胞 に 分 化 さ せ る こ と が 報 告 さ れ て い る[Ref. 48]。 そ の 際 に は Th2 細 胞 の 特 異 的 な 転 写 因 子 で あ る GATA3 が 発 現 し 、 Th0 細 胞 か ら の Th2 細 胞 の 分 化 を 促 進 し 、 IL-4、 IL-6 や TNF-α な ど の サ イ ト カ イ ン の 放 出 を 誘 導 す る [Ref. 49, 50]。 炎 症 性 サ イ ト カ イ ン で あ る IL-6 や TNF-α は 関 節 リ ウ マ チ に お け る 関 節 の 炎 症 に 関 わ る だ け で は な く[Ref. 51]、 ア ル コ ー ル 性 肝 炎 で は 乾 燥 皮 膚 を 生 じ さ せ る こ と や 、 掻 痒 感 を も た ら す な ど 皮 膚 へ の 悪 影 響 が 報 告 さ れ て い る[Ref. 4, 8]。

ま た 、 樹 状 細 胞 は Th1 細 胞 や Th2 細 胞 に 加 え て IL-17、 IL-21 や IL-22 産 生 細 胞 と し て 新 た に 発 見 さ れ た Th17 細 胞 を 活 性 化 す る [Ref. 52, 53]。 Orphan Nuclear Receptor RORγt (retinoid -related orphan receptor gamma t) は Th17 の 特 異 的 な 転 写 因 子 と し て 同 定 さ れ 、STAT3 と 協 調 的 な 働 き を 行 い 、 IL-23 受 容 体 を 誘 導 す る 。IL-23 受 容 体 は RORγt の 発 現 増 加 を 介 し て 、 Th0 細 胞 の Th17 細 胞 へ の 分 化 を 促 進 す る[Ref. 54]。 IL-6 も ま た 、 Janus kinase (JAK) 1 を 介 し て STAT3 を 刺 激 し 、 樹 状 細 胞 の Th0 細 胞 か ら Th17 細 胞 へ の 分 化 作 用 を 促 進 す る[Ref. 55, 56]。 Th17 細 胞 か ら 放 出 さ れ る IL-17 は 、 ア レ ル ギ ー 性 皮 膚 炎 や 乾

癬 に 影 響 を 及 ぼ す と 報 告 さ れ て い る[Ref. 47](Fig. 16)。 こ れ ら の こ と か ら 、 樹 状 細 胞 に よ っ て Th0 細 胞 か ら 分 化 さ れ る Th2 細 胞 お よ び Th17 細 胞 は 関 節 炎 に よ り 誘 導 さ れ る 乾 燥 皮 膚 の 発 現 に 関 与 し て い る 可 能 性 が 考 え ら れ た 。 本 章 で は 、Th2 お よ び Th17 の そ れ ぞ れ の 阻 害 剤 を 投 与 す る こ と で 、 そ れ ら が 関 節 炎 に お け る 乾 燥 皮 膚 に 与 え る 影 響 を 検 討 し た 。 Fig. 16 樹 状 細 胞 か ら 活 性 化 さ れ る Th2 細 胞 お よ び Th17 細 胞 の パ ス ウ ェ イ お よ び 阻 害 剤 の 作 用 Th2 阻 害 剤 *: Th2 細 胞 か ら の サ イ ト カ イ ン 放 出 抑 制

Th17 阻 害 剤 **: c-Jun N-terminal kinase (JNK)を 阻 害 (Th0 細 胞 か ら Th17 細 胞 へ の 分 化 阻 害)

第

2 節 実 験 方 法

1. 実 験 動 物 前 章 ま で と 同 様 、 日 本 エ ス エ ル シ ー 株 式 会 社 が コ ラ ー ゲ ン 誘 導 関 節 炎 処 置 を 実 施 し た 10 週 齢 の DBA/1 J 雄 性 の 関 節 炎 マ ウ ス を 購 入 し た 。 関 節 炎 処 置 を 行 わ な い DBA/1J マ ウ ス を コ ン ト ロ ー ル マ ウ ス (n = 5)と し た 。 購 入 し た マ ウ ス は こ れ ま で と 同 条 件 の 飼 育 と し 、 い ず れ も 1 週 間 、 馴 化 飼 育 し た 後 、 Th2 サ イ ト カ イ ン 放 出 抑 制 剤(Th2 阻 害 剤 ) (IPD-1151T; TAIHO Pharmaceutical Co., Tokyo, Japan)

お よ び Th17 細 胞 分 化 阻 害 剤 (Th17 阻 害 剤 ) (SP600125; Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Japan)の 投 与 を 開 始 し た [Ref. 57, 58]。 各 阻 害 剤 の 投 与 終 了 日 に 、 前 章 と 同 様 に 背 部 の 除 毛 に よ り 、 皮 膚 を 露 出 さ せ た 。 す べ て の 動 物 実 験 は 、 鈴 鹿 医 療 科 学 大 学 動 物 実 験 委 員 会 に よ る 研 究 計 画 書 の 承 認 を 得 た 後 に 、 総 理 府 の 「 実 験 動 物 の 飼 養 及 び 保 管 等 に 関 す る 基 準 」、 な ら び に 「 鈴 鹿 医 療 科 学 大 学 動 物 実 験 指 針(承 認 番 号 :第 66 号 )」 に 従 っ て 実 施 し た 。 2. Th2 阻 害 剤 お よ び Th17 阻 害 剤 の 投 与 1 日 1 回 4 日 間 連 続 で 、 30 mg/kg の Th2 阻 害 剤 を 蒸 留 水 に 溶 解 さ せ 、 経 口 投 与 し た 。1 日 1 回 4 日 間 連 続 で 、 20 mg/kg の Th17 阻 害 剤 を 0.1%の DMSO に 溶 解 さ せ 腹 腔 内 投 与 し た 。 3. マ ウ ス 後 肢 容 積 の 測 定 除 毛 処 置 の 24 時 間 後 、 ペ ン ト バ ル ビ タ ー ル ナ ト リ ウ ム の 腹 腔 内 投 与 に て マ ウ ス を 麻 酔 し 、Cosgrove ら の 方 法 に 則 り 、 前 章 と 同 様 に 後 肢 容 積 を 測 定 し た [Ref. 22]。 4. マ ウ ス 背 部 皮 膚 の TEWL の 測 定 手 順 3 終 了 後 、 マ ウ ス の TEWL の 測 定 を 行 っ た 。 Tewameter®_TM300

(Courage + Khazaka Electronic GmbH, Cologne, Germany) を 用 い て 、 TEWL を 測 定 し た[Ref. 23]。 測 定 値 は こ れ ま で と 同 法 に て 、 算 出 し た 。 5. マ ウ ス の 血 液 お よ び 皮 膚 組 織 の 採 取 手 順 3 お よ び 4 終 了 後 、 マ ウ ス の 心 臓 か ら 約 1 mL の 血 液 を 採 取 し た 。 ま た 、 縦 1.5 cm×横 0.8 cm 四 方 の 背 部 皮 膚 組 織 を 採 取 し 、 － 80°C で 凍 結 結 保 存 し た 。 6. 組 織 染 色 採 取 し た 皮 膚 の 組 織 の 一 部 は 免 疫 組 織 学 的 評 価 に 用 い る た め 、 パ ラ ホ ル ム ア ル デ ヒ ド 溶 液(4%, Wako)に て 固 定 し た 。 固 定 さ れ た 皮 膚 組 織 を Tissue-Tek O.C.T. Compound を 用 い て 凍 結 包 埋 し 、 5 μm の 厚 さ で ミ ク ロ ト ー ム に て 薄 切 を 行 っ た 。 薄 切 し た 切 片 は HE に よ っ て 染 色 し た 後 、 光 学 顕 微 鏡 に て 組 織 学 的 評 価 を 行 い 、 無 作 為 に 抽 出 し た 10 枚 の 画 像 に お け る 表 皮 か ら 皮 下 組 織 に 至 る ま で の 厚 さ を 測 定 し た 。 ま た 、 皮 膚 中 の マ ス ト 細 胞 は ト ル イ ジ ン ブ ル ー 染 色 し 、 細 胞 数 を Image J ソ フ ト ウ ェ ア を 用 い て 計 測 し た 。 無 作 為 に 3 か 所 の エ リ ア を 抽 出 し 、 単 位 面 積(mm2_{)あ た り の マ ス ト 細 胞 数 の 平 均 値 を 算 出 し た 。 さ ら に 、 免 疫 染 色 に よ} り 、 皮 膚 切 片 の 樹 状 細 胞 数 を 評 価 し た 。 皮 膚 切 片 は 樹 状 細 胞 の 1 次 抗 体 と し て 抗