プラゾシンによる肝性リパーゼ分泌促進機構の解析に関する研究

プラゾシンによる肝性リパーゼ分泌促進機構の 解析に関する研究

福山大学薬学部 生化学研究室 中村 徹也

諸論 ... １

略語表 ... ３

第１章 プラゾシンによる初代培養ラット肝細胞からの

Hepatic Triacylglyceride Lipase

受容体の関与 ... ７ 1-1 序論 ... ７ 1-2 試薬および動物 ... ８

(1) 試薬 ... ８ (2) 動物 ... ８

(1) 初代培養肝細胞の調製 ... ９ (2) HTGL

(3) Western blotting

HTGL

(4) データ処理 ...

第２章 プラゾシンによる

HTGL

ホスホリパーゼ

C

(1) 試薬 ...

(2) 動物 ...

(1) 初代培養肝細胞の調製 ...

(2) HTGL

(3) Western blotting

HTGL

(4) ホスホリパーゼ C

(5) データ処理 ...

第３章 プラゾシンによる

HTGL

Ca

II

(1) 試薬 ...

(2) 動物 ...

(1) 初代培養肝細胞の調製 ...

(2) HTGL

(3) Western blotting

HTGL

(4) Ca

/カルモジュリン依存性プロテインキナーゼ II

(5) データ処理 ...

第４章 プラゾシンによる

HTGL

cyclic AMP

A

(1) 試薬 ...

(2) 動物 ...

(1) 初代培養肝細胞の調製 ...

(2) HTGL

(3) Western blotting

HTGL

(4) 細胞内 cAMP

(5) プロテインキナーゼ A

(6) データ処理 ...

総括 ... ５９

謝辞 ... ６３

論文目録 ... ６４

引用文献 ... ６５

1

緒論

食餌により吸収された脂質や肝臓および脂肪組織で合成された脂質は、血漿中を通 り種々の組織や器官へ輸送される際、個々の形では存在せず、アポリポタンパク質と 結合することにより可溶性を持つリポタンパク質として存在している¹⁾。 この食餌 による脂質は、小腸で吸収されカイロミクロンとなり血中に移行する。 また肝臓に 取り込まれ再合成を受けたリポタンパク質は、超低比重リポタンパク質(VLDL)とし てトリアシルグリセロール(TG)を輸送しており、これらのリポタンパク質中に多く含 まれる

TG

Lipase, EC 3.1.1.34)によって加水分解を受ける

LPL

って生じたより高比重のリポタンパク質は、次いで肝性リパーゼ(HTGL; Hepatic

Triacylglyceride Lipase, EC 3.1.1.3)によりリポタンパク質中の TG

生成された

FFA

HTGL

HDL

HDL

TG

HDL

HTGL

TG

FFA

VLDL

この

HTGL

52～55kDa

57～59kDa

HTGL

HTGL

一方、プラゾシン(1-[4-amino-6,7-dimethoxy-quinazolin-2-yl]-4-[2-furoyl]pipera-

-zine)は 1965

quinazoline

はサイクリックヌクレオチドホスホジエステラーゼ(PDE)阻害剤として合成を目的 とされていたが、交感神経のα1 アドレナリン受容体を選択的に遮断する作用がある

2

薬として用いられてきている⁸⁾。 現在においては、本態性高血圧症、腎性高血圧症 や褐色細胞種、前立腺肥大症に伴う排尿障害に用いられる。 その後の作用機序の解 析が進み血管平滑筋のα1Bアドレナリン受容体を遮断することで降圧作用を示し、前 立腺において尿道括約筋のα1A

/

quinazoline

G2

E

(PTSD)の改善などの報告もされている

quinazoline

期投与での

HDL

+LDL

)

3-

-3-

(HMG)-CoA

さらにプラゾシンはショ糖食摂取ラットの褐色脂肪組織において

LPL

TG

HTGL

すなわち脂質代謝において

HTGL

3

略語表

本論文において用いた略語は、次の通りである。

HTGL Hepatic Triacylglyceride Lipase AC Adenylate Cyclase

Adrenaline (R)-4-(1-hydroxy-2-(methylamino)ethyl)benzene-1,2-diol Amiloride 3,5-Diamino-N-(aminoiminomethyl)-6-chloropyrizinamide ATP Adenosine-5’-triphosphate

BSA Bovine Serum Albumin

Calphostin C [(2R)-1-[3,10-dihydroxy-12-[(2R)-2-(4-oxy)carbonyloxypropyl]- 2,6,7,11-tetramethoxy1-yl]propan-2yl] benzoate

CaMK-II Ca

/Calmodulin-dependent protein kinaseⅡ

Chelerythrine 1,2-Dimethoxy-12methyl[1,3]benzodioxolo[5,6-c]phenanthrid- -in-12-ium

cAMP Adenosine 3’,5’-cyclic monophosphate CYP Cytochrome P450

DAG Diacylglycerol

DGK Diacylglycerol kinase DMSO Dimethyl sulfoxide

Doxazosin (RS)-2-[4-(2,3-dihydro-1,4-benzodioxine-2-carbonyl)piperazin- -1-yl]-6,7-dimethoxyquinazolin-4-amine

DTT Dithiothreitol

EDTA Ethlene Glycol Tetraacetic Acid EGF Epidermal Growth Factor

EGTA Ethlene Glycol-bis(β-aminoethyl Ether)-N,N,N’,N’- Tetraacetic Acid

Epac Exchange protein directly activated by cAMP FBS Fetal Bovine Serum

FFA Free Fatty Acid

4

-linesulfonamide

HBSS Hanks’ Balanced Salt Solution 10×Concentrated HDL High Density Lipoprotein

Herbimycin A [(2R,3S,5S,6R,7S,8E,10R,11S,12E,14E)-2,5,6,11-tetramethoxy- 3,7,9,15-tetramethyl-16,20,22-trioxo-17-azabicyclo[16.3.1]doc- -osa-8,12,14,18,21-pentaen-10-yl]carbamate

Hepes N-2-Hydroxyethyl Piperazine-N-2-ethanesulfonic Acid HMG-CoA 3-Hydroxy-3-methlglutaryl-coenzyme A

HRP Horseradish peroxidase IP

Inositol-1,4,5-triphosphate

Isoproterenol (R)-3,4-dihydroxy-α-(isopropylaminomethyl)benzyl alcohol KN-62 4-[(2S)-2-[(5-Isoquinolinylsulfonyl)methylamino]-3-oxo-3-(4-p-

-henyl-1-piperazinyl)propyl] phenylisoquinolinesulfonic acid ester

KN-92 2-[N-(4-Methoxybenzenesulfonyl)]amino-N-(4-chlorocinnamyl) -N-methylbenzylamine, Phosphate

KN-93 2-[N-(2-hydroxyethyl)-N-(4-methoxybenzenesulfonyl)]-amino- N-(4chlorocinnamyl)-N-merhylbenzylamine

KT5720 (9R,10S,12S)-2,3,9,10,11,12-Hexahydro-10-hydroxy-9-methyl-1 -oxo-9,12-epoxy-1H-diindol-o[1,2,3-fg:3',2',1'-kl]pyrrolo[3,4-i]

[1,6]benzodiazocine-10-carboxylic acid, hexyl ester LDL Low Density Lipoprotein

L-nor-adrenaline l-1-(3,4-Dihydroxyphenyl)-2-aminoethanol LPL Lipoprotein Lipase

LY294002 2-Morpholin-4-yl-8-phenylchromen-4-one

MDL-12,330A Cis-N-(2-Phenylcyclopentyl)azacyclotridec-1-en-2-amine 5-Methylurapidil 5-Methyl-6[[3-[4-(2-methoxyphenyl)-1-piperazinyl]-propyl]-

amino]-1,3-dimethyluracil

MOPS 3-(N-Morpholino) Propane Sulfonic acid

OCT Organic Cation Transporter

5

PBS Phosphate buffered saline PDE Phosphodiesterase

Phenylephrine (R)-3-(1-hydroxy-2-(methylamino)ethyl)phenol PI3K Phosphoinositide 3-kinase

PIP

Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate PKA Cyclic AMP dependent Protein kinase PKC Protein kinase C

PLC Phospholipase C

PMSF Phenylmethylsulfonyl fluoride

PP2 4-Amino-5-(4-chlorophenyl)-7-(t-butyl)pyrazolo[3,4-d]pyrimi- -dine

PP3 4-Amino-1-phenyl-1H-pyrazolo[3,4-d]pyrimidine

Prazosin 1-[4-Amino-6,7-dimethoxy-quinazolin-2-yl]-4-[2-furoyl]- -piperazine

PVDF Polyvinylidene difluoride

Quin2/AM 8-Amino-2-[(2-amino-5-methylphenoxy)methyl]-6-methoxyqu- -inoline-N,N,N’,N’-tetraacetic acid tetraacetoxymethylester R59949 3-[2-[4-[Bis(4-fluorophenyl)methylidene]piperidin-1-yl]ethyl]-2- sulfanylidene-1H-quinazolin-4-one

SDS-PAGE Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis SH Src homology

SKF-525A

Ester

Src Proto-oncogene tyrosine-protein kinase

ST-638

TBA Tetrabutylammonium

TCA Trichloroacetic acid

Terazosin (RS)-6,7-dimethoxy-2-[4-(tetrahydrofuran-2-ylcarbonyl)piper- -azin-1-yl]quinazolin-4-amine

TG Triacylglyceride

TPA Phorbol 12-Myristate 13-Acetate

Tris Tris (hydroxymethyl) aminomethane

6

Tween 20 Polyoxyethlene(20) sorbitan monolaurate

U-73122 1-[6-((17β-3-Methoxyestra-1,3,5(10)-trien-17-yl)amino)hexyl]- 1H-pyrrole-2,5-dione

U-73343 1-[6-((17β-3-Methoxyestra-1,3,5(10)-trien-17-yl)amino)hexyl]- 2,5-pyrrolidinedione

VLDL Very Low Density Lipoprotein

W-5 N-(6-Aminohexyl)-1-naphthalenesulfonamide hydrochloride W-7 N-(6-Aminohexyl)-5-chloro-1-naphthalenesulfonamide Hydrochloride

Xestospongin C [1R-(1R,4aR,11R,12aS,13S,16aS,23R,24aS)]-eicosahydro-5H,

17H-1,23:11,13-diethano-2H,14H-[1,11]dioxacycloeicosaino[2,

3-b:12,13-b1]dipyridine

7

第１章 プ ラ ゾ シ ン に よ る 初 代 培 養 ラ ッ ト 肝 細 胞 か ら の

Hepatic Triacylglyceride Lipase

受容体の関与

1-1 序論

脂質代謝に影響を与える薬剤は数多く存在しており、中でも

quinazoline

LPL

HDL

VLDL

LDL

プラゾシンなどα1 アドレナリン受容体拮抗薬の脂質代謝に対する作用は、血管に おけるα1アドレナリン受容体の遮断により、他の臓器へのアドレナリンの作用の増 強であると推測されていた。 このα1アドレナリン受容体にはα1A、α1B、α1D サ ブタイプが存在しておりラット肝臓においてα1B のみ発現していると報告されてい

る^23,24)。 これらサブタイプの発現は異なっており、α1Bは細胞膜上に、α1Aは細胞

膜と細胞質に、α1Dは細胞質に多く局在する²⁴⁾。 またα1アドレナリン受容体には α1Lサブタイプも報告されており、プラゾシン低感受性(low affinity)である事よりα

1Lと呼ばれ、ヒト前立腺やウサギ耳動脈組織に発現している²⁵⁾。 プラゾシンの受容 体感受性はα1A、α1B、α1Dに対し高い親和性を持つ受容体拮抗薬であるが、この受 容体のアゴニスト非存在下で受容体が自発的に持っている活性（構成的活性）を抑制 する逆作用薬(inverse agonist)として構成性な反応を抑えるとされている²⁶⁾。 しか しこれらに分類される薬剤の特異的な作用は多く、近年の報告ではα1 アドレナリン 受容体に非依存的な作用としての報告も少なくない^13,14)。 更には肝臓にも発現して いる有機カチオントランスポーター(OCT)1 の強力な阻害剤としても知られており、

8

ショ糖食摂取ラットの褐色脂肪組織において

LPL

LPL

HTGL

の関与^28,29)が報告されており、プラゾシンでも関与が推測される。

そこで本章では、プラゾシンの標的としてα1アドレナリン受容体を含む、細胞膜受 容体の関与を考慮し、脂質代謝関連酵素である

HTGL

1-2 試薬および動物

(1)試薬

Prazosin、 Adrenaline、 Amiloride、 L-nor-Adrenaline、 Doxazosin、 Isoproterenol、

Phenylephrine、TBA、インスリン、デキサメタゾン、アプロチニン、コラゲナーゼ

PP3、 Terazosin、 Williams’ medium E

SKF-525A

Hanks’

Balanced Salt Solution(HBSS)

ST638

Triolein,[carboxyl-

C]- (2.59GBq/mmol)はパーキンエルマー社から、リッキシンチ

は

National Diagnostius

学用特級を使用した。

(2)動物

体重

200～300g

Wistar

1～2

飼料

CE-2(日本クレア)で飼育し、実験前 24

なお動物実験は、福山大学学術研究倫理審査委員会にて承認を得られている（承認 番号：H-27-動-16）。

9

1-3 実験方法

(1)初代培養肝細胞の調製

肝実質細胞はコラゲナーゼを用いた

Berry＆Friend

分離精製した。

24

Wistar

C

その後、遠心(90×g, 1min, 4℃; クボタ製

5922

4℃;

2

採取した遊離肝実質細胞は

Williams’ medium E

, 10% FBS, 10

M

M

プラスチックディッシュ(FALCON PRIMARIA)上で細胞の濃度が

1×10

cells/cm

CO

24

24

Williams’ medium E

, 2% BSA

HTGL

1g

Krebs-Ringer

, 4.8mM KCl, 0.5mM CaCl

, 1.2mM KH

PO

, 1.2mM MgSO

, pH 7.4, 4℃) 10ml

×g,10min,4℃; クボタ製 KR-1500)、上清を捨て凍結させる。 この細胞量に対して

10

2mM, pH 7.4)を加え、氷冷下、超音波破砕(10sec×2, 4℃; S&M

ultrasonic processor)を行い、超遠心(105,000×g, 60min, 4℃;

XP Ultracentrifuge)を行った。 その遠心上清を肝細胞内 HTGL

各種薬剤は、水溶媒とし、水に不溶な試薬は細胞に影響のない濃度の

DMSO

10

HTGL

Triolein,[carboxyl-

C]- (1.21μM; 3.1kBq/ml)、0.3% BSA、0.075% Triton X-100、

pH 8.6(28℃)0.4ml

これに

0.37M Tris-HCl/3.2M NaCl

応液

0.79ml

0.2ml

30

止液(イソプロパノ－ル:3N H2

SO

=40:1)2ml

2ml

1ml

1

×g, 7min, 4℃; 日立製 05PR-22 型)し、上層のヘキサン層を採取し、これに

0.1N

KOH 500μl

μlを採取し、リッキシンチ

5ml

LSC-6100

HTGL

FFA/min/10

cells

4

(3)Western blotting

HTGL

BSA

Bradford

(2% SDS, 4% 2-mercaptoethanol

5

34)に従い

SDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動(SDS-PAGE)(200V, 40mA, 60min,

ゲルに

0.1%SDS/10%Acrylamide

Towbin

35)に準じて行った。 すなわち、

SDS-PAGE

PVDF

PBS

(5min×5)し、 0.1%脱脂粉乳を含む PBS

応させた(室温, 60min)。 反応後、PBS で洗浄(5min×5)し、0.1%脱脂粉乳を含む

PBS

IgG-HRP

11

60min)。 反応後、PBS

(ImmunoStar

Zeta,

)

(BIO-RAD

ChemiDoc XRS)で化学発光の検出を行った。

(4)データ処理

結果は平均±標準誤差で示した。 有意差検定は、

Student’s t-test、 Welch t-test、

及び

Dunnett’s-test、Tukey’s-test

1-4 実験結果

(1) プラゾシンの経時変化及び濃度変化による HTGL

Fig.1

濃度の増加による

HTGL

HTGL

HTGL

1B-1b)に増加した。

(2) 各種α

HTGL

及び薬剤構造による作用

quinazoline

テラゾシン³⁴⁾を用い、また異なる骨格のα1受容体拮抗薬である

5-メチルウラピジル

35)を用いてこれらの濃度変化による

HTGL

HTGL

2A-2a)。 また母核である quinazoline

HTGL

作用は認められなかった(Fig. 2A-2b)。 また

HTGL

12

ナゾリンの濃度を増加させても

HTGL

2B)。

(3) プラゾシンによる HTGL

HTGL

プラゾシンによる

HTGL

HTGL

プラゾシンと肝細胞との温置により細胞外の

HTGL

HTGL

HTGL

プラゾシン非添加群における細胞内

HTGL

HTGL

(4) プラゾシンによる HTGL

アドレナリン受容体拮抗薬のプラゾシンによる

HTGL

α,βアドレナリン受容体刺激薬である(±)-Adrenaline、α,β1アドレナリン受容体刺 激薬である

L-nor-Adrenaline、α

Phenylephrine、βア

Isoproterenol

HTGL

HTGL

4B)。

(5) プラゾシンによる HTGL

プラゾシンによる

HTGL

Amiloride

HTGL

13

上皮成長因子(EGF)受容体などのチロシンキナーゼを抑制することで知られている ケイヒ酸誘導体のチロシンキナーゼ阻害剤である

ST-638

HTGL

(6) プラゾシンによる HTGL

非受容体型チロシンキナーゼ阻害剤の効果

プラゾシンによる

HTGL

Src

PP2

HTGL

一方、

Src

EGF

PP2

PP3

Src

SH

Src

阻害する

Herbimycin A

HTGL

Herbimycin A

(7) プラゾシンと標的を同じとするトランスポーター阻害剤の効果

HTGL

プラゾシンは

OCT

OCT1

OCT1

OCT1

Tetrabutylammonium(TBA)によるトランスポーター阻害では HTGL

認められなかった(Fig. 7A-7a)。一方、非特異的にチトクローム

P450(CYP)を阻害す

SKF-525A

HTGL

7A-7b)。 さらに、SKF-525A

HTGL

抑制が認められた(Fig. 7B-7b)。

14

初代培養ラット肝細胞を用いた本実験系において、

HTGL

HTGL

4.に示すように受容体

HTGL

HTGL

細胞表面における受容体型チロシンキナーゼの関与が示唆されている事から^28,29)、プ ラゾシンによる肝細胞からの

HTGL

HTGL

OCT

OCT

CYP

HTGL

HTGL

Erve

in vitro

HTGL

HTGL

CYP

Src

HTGL

15

1A)

0 30 60 90

0 0.2 0.4

Time (min) H TG L R el ea se [p m o l F F A /m in /1 0

ce ll s]

1b) 1a)

***

**

**

**

**

0 50 100 150

0 0.2 0.4

Prazosin (µM)

1B)

1a)

Time (min) 0

15

30

45

60

75

90

105 Prazosin (+) HTGL- Prazosin (−) HTGL-

1b)

Dose (µM)

0

50

70

80

90

100

150 Prazosin

HTGL-

Fig.1. The Time Course of HTGL Release from Hepatocyte by Stimulated Prazosin and the Prazosin Concentration Dependence on release of HTGL

1A) 1a) The hepatocytes were incubated for 0-105 min either with (●) or without (○) 100µM prazosin. 1b) The hepatocytes were incubated for 60 min with various concentrations (0-150µM) of prazosin.

Significant differences compared with the control: **p<0.01 and ***p<0.001.

1B) Western blot analysis with an HTGL antibody. HTGL protein is released by prazosin

time- and dose-dependent manner. The incubation time is 0-105min with (±) 100µM

prazosin, and dose response is incubated 60 min with 0-150µM concentrations prazosin.

16

0 100 200

0 0.2 0.4

Concentration (µM) H TG L R el ea se [p m o l F F A /m in /1 0

ce ll s]

2a)

** **

No ne Pra

zo si n (1 00 µM)

Qu in azo

lin e

( 20 0µ M )

0 0.2

0.4 ^2b)

***

2B)

Dose (µM)

0 25 50 100 200 Prazosin

HTGL- Doxazosin

HTGL- Terazosin

HTGL- 5-Methylurapidil HTGL- Quinazoline

HTGL-

Fig. 2. Comparison of HTGL Release by Alpha 1 Adrenoceptor Antagonists and Effect of Quinazoline Structure on Release of HTGL from Hepatocyte

2A) 2a) The hepatocytes were incubated for 60 min with various alpha 1 adrenoceptor antagonists; prazosin (●), doxazosin (○), terazosin (■), 5-methylurapidil (□). 2b) The hepatocytes were incubated for 60 min with prazosin (black bar) or quinazoline (slash bar).

Significant differences compared with each alpha 1 adrenoceptor antagonists: **p<0.01 and

***p<0.001.

2B) Western blot analysis with an HTGL antibody. The hepatocytes were incubated for 60

min with 0-200µM of various alpha 1 adrenoceptor antagonists and quinazoline, and the

supernatants were harvested for western blot analysis with an HTGL antibody.

17

3A)

Prazosin (-) Prazosin (+) 0

1 2 3

H TG L A ct iv it y [p m o l F F A /m in /1 0

ce ll s]

Intracellular

Prazosin (-) Prazosin (+) 0

0.2 0.4

H TG L R el ea se [p m o l F F A /m in /1 0

ce ll s]

Extracellular

***

* 3b) 3a)

3B)

Prazosin

Time (min) 0 30

60

120

0 30

60

120 HTGL-

β-actin-

Fig. 3. Extracellular HTGL Release from the Hepatocyte and Intracellular HTGL Activity of the Hepatocyte

3A) 3a) The HTGL release from hepatocytes were increased to incubate for 60 min with prazosin (black bar). 3b) The intracellular HTGL activity in the hepatocytes were decreased to incubate for 60 min with prazosin (black bar).

Significant differences compared with the control: *p<0.05 and ***p<0.001.

3B) The hepatocytes were incubated for 0-120 min with (±) prazosin, the hepatocytes were

lysated and centrifuged for western blot analysis with an HTGL antibody. The β-actin

antibody is used for the loading control.

18

0 50 100

0 0.2 0.4

(±)-Adrenaline (µM) H TG L R el ea se [p m o l F F A /m in /1 0

ce ll s]

0 50 100

0 0.2 0.4

L-Noradrenaline (µM)

0 50 100

0 0.2 0.4

Phenylephrine (µM) H TG L R el ea se [p m o l F F A /m in /1 0

ce ll s]

0 100 200

0 0.2 0.4

Isoproterenol (µM)

4a) 4b)

4c) 4d)

4B)

Prazosin

(±)-Adrenaline (µM) 0 25

50

100 0 25 50

100 4a) HTGL- L-Noradrenaline (µM) 0 25

50

100 0 25 50

100 4b)

HTGL- Phenylephrine (µM) 0 25

50

100 0 25 50

100 4c)

HTGL- Isoproterenol (µM) 0 50

100

200 0 50 100

200 4d)

HTGL-

19

Fig. 4. Effects of Adrenoceptor agonists on the Stimulatory Release of HTGL by Prazosin

4A) 4a) The hepatocytes were incubated with prazosin (100µM,

presence of (±)-adrenaline. 4b) The hepatocytes were incubated with prazosin (100µM,

or without (○) in the presence of L-noradrenaline. 4c) The hepatocytes were incubated with prazosin (100µM,

were incubated with prazosin (100µM,

No significant differences.

4B) Western blot analysis with an HTGL antibody. The hepatocytes were incubated for 60

min with (±) prazosin after pre-incubated for 10 min in the presence of 0-200µM of various

adrenoceptor agonists, and the supernatants were harvested for western blot analysis with an

HTGL antibody.

20

0 5 10

0 0.2 0.4

Amiloride (mM) H TG L R el ea se [p m o l F F A /m in /1 0

ce ll s]

0 100 200

0 0.2 0.4

ST-638 (µM) 5b) 5a)

5B)

Prazosin

Amiloride (mM) 0 2

5

10

0 2 5

10 5a) HTGL-

ST-638 (µM) 0 50

100

250

0 50

100

250

5b)

HTGL-

Fig. 5. Effects of Receptor Tyrosine Kinase Inhibitors on the Stimulatory Release of HTGL by Prazosin

5A) 5a) The hepatocytes were incubated with prazosin (100µM,

presence of amiloride. 5b) The hepatocytes were incubated with prazosin (100µM,

without (○) in the presence of ST-638.

No significant differences.

5B) Western blot analysis with an HTGL antibody. The hepatocytes were incubated for 60

min with (±) prazosin after pre-incubated for 10 min in the presence of receptor tyrosine

kinase inhibitors, and the supernatants were harvested for western blot analysis with an HTGL

antibody.

21

6A)

0 50 100

0 0.2 0.4

Concentration (µM) H TG L R el ea se [p m o l F F A /m in /1 0

ce ll s]

*

0 10 20

0 0.2 0.4

Herbimycin A (µM) 6b) 6a)

**

** **

6B)

Prazosin

Concentration (µM) 0 20

50 100

0

20

50

100 PP2 HTGL-

PP3

HTGL-

Herbimycin A (µM) 0 5

10

20

0 5

10

20 6b)

HTGL-

Fig. 6. Effects of Non-receptor Tyrosine Kinase Inhibitors on the Stimulatory Release of HTGL by Prazosin

6A) 6a) The hepatocytes were incubated with prazosin (100µM,

the presence of PP2 (○,●) and PP3 (□,■). 6b) The hepatocytes were incubated with prazosin (100µM,

Significant differences compared with the control: *p<0.05 and **p<0.01.

6B) Western blot analysis with an HTGL antibody. The hepatocytes were incubated for 60

min with (±) prazosin after pre-incubated for 10 min in the presence of non-receptor tyrosine

kinase inhibitors, and the supernatants were harvested for western blot analysis with an HTGL

antibody.

22 No ne

Prazosin (1 00 µM )

TBA (2 00 µM ) 0

0.2 0.4

H TG L R el ea se [p m o l F F A /m in /1 0

ce ll s] ***

7a)

0 50 100

0 0.2 0.4

SKF-525A (µM) 7b)

*

***

7B)

Prazosin

SKF-525A (µM) 0 10

100

0 10

100 7b) HTGL-

Fig. 7. Effects of Organic Cation Transporter Inhibitors on the Stimulatory Release of HTGL by Prazosin

7A) 7a) The hepatocytes were incubated for 60 min with prazosin (black bar) or TBA (slash bar). 7b) The hepatocytes were incubated with prazosin (100µM,

presence of SKF-525A.

Significant differences compared with the control: *p<0.05 and ***p<0.001.

7B) Western blot analysis with an HTGL antibody. The hepatocytes were incubated for 60

min with (±) prazosin after pre-incubated for 10 min in the presence of 0-100µM SKF-525A,

the supernatants were harvested for western blot analysis with an HTGL antibody.

23

第２章 プラゾシンによる

HTGL

C

2-1 序論

第

1

HTGL

Src

C(PLC)のリン酸化と活性化が起こることが報告されている

PLC

ってホスファチジルイノシトール

4,5-二リン酸(PIP

)を分解しイノシトール 1,4,5-三

)とジアシルグリセロール(DAG)の 2

44)。

Kerakawati

癌細胞からの

LPL

PLC

本章では、プラゾシンによる

HTGL

PLC

2-2 試薬及び動物

(1)試薬

U-73122、U-73343、コール酸ナトリウム(cholate-Na)及び dithiothreitol(DTT)は

H(N)] PIP

は室町薬品から購入したものを使用した。 その他の試薬は、本論文第

1

1-2(1)

24

本論文第

1

1-2(2)に記載した Wistar

24

して用いた。 なお動物実験は、福山大学学術研究倫理審査委員会にて承認を得られ ている（承認番号：H-27-動-16）。

2-3 実験方法

(1)初代培養肝細胞の調製

遊離肝実質細胞の調製及び初代培養法は、本論文第

1

1-3(1)に示した。

(2)HTGL

HTGL

1

1-3(2)に示した。

(3)Western blotting

HTGL

Western blotting

HTGL

1

1-3(3)に示

した。

(4)ホスホリパーゼ C

肝実質細胞を本論文第

1

1-3(1)で示した方法で各種薬剤などと温置した後、培養

1g

20mM Hepes-K

EDTA, 0.7% cholate-Na

日音製ハンディマイクロホモジナイザー)をした。 これを、遠心(4℃, 10,000×g,

25

30min)し、この遠心上清を PLC

PLC

Higashi

0.37kBq Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate [myo-inositol-2-

H(N)] PIP

100mM Hepes-K

, 1mM CaCl

, 0.1% BSA, 1%

cholate-Na, 0.8 mg/ml phosphatidylcholine

5μl

37℃で 10

10％TCA

を

100μl

100μl

g, 5 min)し、

H]IP

100μl

2ml

LSC-6100

PLC

cells

4

(5)データ処理

本論文第

1

1-3(4)に示した。

2-4 実験結果

(1) プラゾシンによる HTGL

PLC

プラゾシンによる

HTGL

PLC

PLC

U-73122

HTGL

PLC

い

U-73343

様に

HTGL

U-73343

26

肝細胞とプラゾシン共存下、細胞内

PLC

Fig.9a

PLC

いて示している。

0~30

1.5

PLC

PLC

(3) プラゾシンによる PLC

及び

PLC

Fig.10

PLC

ナーゼ及び

PLC

PLC

非受容体型チロシンキナーゼ阻害剤である

PP2、Herbimycin A

PLC

U-73122

PLC

U-73343

2-5 考察

PLC

13

各構造の違いに従って

6

PLCβは 7

3

G

PLCγは PLC

SH

Src

Src

Src

SH2

合し、

PLCγ自身もチロシンリン酸化され、活性化される。 またチロシンキナーゼ

の活性化に伴いリン酸化された

PLCγは PIP

IP

DAG

2

これらの結果から、プラゾシンによる肝細胞からの

HTGL

27

より抑制されたことにより、肝細胞における

PLC

肝細胞内の

PLC

PLC

PLC

Xu

c-Src

PLC

1

HTGL

G

HTGL

PLC

IP

DAG

28

0 1 2

0 0.2 0.4

Concentration (µM) H TG L R el ea se [p m o l F F A /m in /1 0

ce ll s]

0 1 2

0 0.2

0.4 ⁸⁾

*

8B)

Prazosin

Concentration (µM) 0 0.5

1

2

0 0.5

1

2 U-73122 HTGL-

U-73343

HTGL-

Fig. 8. Effects of Phospholipase C Inhibitors on the Stimulatory Release of HTGL by Prazosin

8A) The hepatocytes were incubated with prazosin (100µM,

presence of U-73122 (○,●) and U-73343 (□,■).

Significant differences compared with the control: *p<0.05.

8B) Western blot analysis with an HTGL antibody. The hepatocytes were incubated for 60

min with (±) prazosin after pre-incubated for 10 min in the presence of PLC inhibitors, and

the supernatants were harvested for western blot analysis with an HTGL antibody.

29

0 15 30

0 10 20

Time (min) P L C A ct iv it y [f m o l/ m in /1 0

ce ll s]

0 50 100

0 10 20

Prazosin (µM)

9a) 9b)

*

*** * **

Fig. 9. Increasing Effect of Prazosin Phospholipase C Activity in Hepatocytes

(a) The hepatocytes were incubated with prazosin (100µM,

30-min period. (b) The hepatocytes were incubated for 30 min with prazosin various concentrations (0-100µM) of prazosin.

Significant differences compared with control: * p<0.05, **p<0.01 and ***p<0.001.

30

Prazosin (-) Prazosin (+) 0

10 20

P L C A ct iv it y [f m o l/ m in /1 0

ce ll s]

10)

**

*

*

Fig. 10. Effect of Non-receptor Tyrosine Kinase Inhibitors and Phospholipase C Inhibitors on Increase in Phospholipase C Activity by Prazosin

The hepatocytes were incubated with 100µM prazosin or without (white bar) in the presence of PP2 (black bar), herbimycin A (cross bar), U-73122 (vertical bar), U-73343 (slash bar).

Significant differences compared with the prazosin-treated group and without inhibitors:

*p<0.05 and **p<0.01.