研究床析関す臨法医学的迅速薬毒物分用完全自動化高速液体

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金沢大学十全医学会雑誌第1 0 5巻第5号 6 27 ^‑6 4 7 (1 9 9 6)

完全自動化高速液体^ク ^ロ ^マ ^{トグ}^ラ ^{フシ} ^ステ ^ムを用^い^た臨床法医学的迅速薬毒物分析^に関する研究

金沢大学医学部医学科法医学講座 (^主任^: 大島徹教授)

大辻雅彦

6 27

人体由来試料からの薬毒物分析は臨床および法医実務^において極めて重要^であ^り, 既^に各種^の薬毒物分析装置^が開発^され, 医療現場^や法医実務^で使用^{されて}^い^る^. ^{しかし}従来^の装置^に^{よる}分析^で^は, 現場の状況などから推定しうる薬毒物^のみを対象とする, 限られた範囲^の分析となる傾向を否めず, 未知^の対象薬毒物^の場合^に臨床および剖検試料から^の薬毒物分析^を^いかに短時間に, かつ系統的^に行うかは未解決^の問題である. そ^こで本研究^で^ほ, 米国^で開発^{された}完全自動化高速液体^ク^ロ^マトグラフシステ^ム R E M E D iT^{H S}^⑧ ^を用^い, 中毒学的情報^が未知^の症例^の分析をも含めた包括的な薬毒物分析^の可能性を検討した^. まず, 現在, 汎用されて^いる向精神薬, 催眠^･鎮静薬, 抗^ヒスタミン薬および局所麻酔薬などから4 2種^の薬物^･代謝物を選び, それらを蒸留水, 血清^{または}尿検体^に実験的^に添加^し, 同装置^によりそれらの試料から当該薬物^が定性的^に正確に検出されるか否かを検討^{したと}^こ^ろ, 4種^の酸性薬物を除く3 8種が正確^に同定された^. その内, リドカイ^ンと他^の7種^の局所麻酔薬および 2 種^のリドカイ^ン代謝物^についてほ, 同^一検体中での同時的定性分析が可能であり, 検体中^の水素^イ^オ^ン濃度^の定性分析^へ ^の影響^ほpH 4 から 9 の範閃^で認^{めなか}^っ^た^. ^{また}, メタンフユタミソやそ^の代謝物^{および}関連化合物である^ア ^{ンフ}ェタミン, メチル ^エフェドリソ, エフェドリ^ンは▲ 腐敗試料^{から}も定性的^に正確^に検出された^. また R E M E D i^‑H S^⑧の定量分析^へ

の可能性を探るた軋前記4 2種^の中から選んだ 2 4種^の薬物および代謝物^について , クロルフェニラミソを内部標準物質^{とし}^て検量線^を作成^{したと}^こ^ろ, いずれも良好な直線性を示した^. ^これ.^ら^の^{検出限界}^は^概^し^て⁰^.¹^〃g/^mI で, 従来より我が国^で薬物^ス

クリ^ー ^ニ ^ングに使用されてきた薄層^ク^ロ^マ ^トグラフシステムよりも良好^であり, これら薬物^の急性中毒^の診断^に有用であると同時^に, プリロカイン , リドカイン , メビバカイン, ブビバカイン _, カルバマゼピソについては, R E M E D i^,H S^㊥の検出限界^が各^々^の有効血中濃度より低値な^{ので}, 各薬物濃度^{のモ}^ニ ^{タリ}^ング^にも有用であると考えられた^. R E M E Di‑^{H S}^⑧ ^の薬物同定^ライブラリ ^ーにほ, 約4 5 0種類^の薬物または代謝物^の濃度と^ピ ^ー ^ク高^の比^に基づいて計算された定量^パ^ラメ ^ータ ^ーが登録^{され}^ており, それを用いてプ^ロムワレリル尿素, エフェドリソ_, ヒド^ロキシジン _, ジフェンヒドラミン , ラ ^ニチジン, リドカイ^ンおよびグリシネキ^シリジ^ンの血清^, 尿並びに胃内容液中の濃度を定性分析終^了後. 直ちに定量^し, 内部標準法^による建量結果と比較したと^ころ, 両定量値^には相関係数0.9 6 0 から1^.0 0 0^の範囲^で高^い相関^のある^ことが確認^{された}^. ^{また}, リドカイン_, モノ

エチルグリシネキシリジンおよびプ^ロムワレリル尿素^の血清, 尿検体中^の濃度を内部標準法を用^いて定量し, ガ^スク^ロ ^マトグラフ ^･質量分析法^{での}定量値と比較したところ, いずれも高^い相関が認められた (相関係数0^.7 5 3^〜0^.9 7 8)^. また, 8種^の局所麻酔薬^{と 2}種^の^{リド}^カ^イ^ン代謝物^の定量値^へ^の検体pH 値^の影響^は認^{められ}ず, これら1 0種^の薬物^･代謝物^の日内および日間精度^の変動係数ほ各^々1^.0 7 ^〜8^.3 5% , 1^.9 1^〜11 ^.8% であり, いずれも高^い再現性を示した^. ^一方, 市販感冒薬や抗^ヒ^ス ^{タミ}ン

薬並びにリドカインを各^々 , ヒトボランテ_ィアやウ^サギ^に投与し, それら^の血清および尿^の分析結果から, 各薬品に含有されている薬物とその代謝物^の同時分析が可能^であ^る^こ^{とが}確かめられた^. 法医中毒学的実務^に関す^る具体例として, 剖検7 9例と救急患者5 3例の検体を分析したところ各^々6 1例, 46例で何らかの薬物が検出^{され}, 検出例^では分析結果が死因^の決定や確認,

ある^いは薬物中毒^の診断や治療方針^の決定に重要な役割を果たした. さらに急性心筋梗塞患者に投与されたリドカインおよびそ^の代謝物^に^つ^いて薬物濃度^モ ^ニ^{タリ}^ングを行ったと^ころ, R E M E D トH S^⑧は治療効果^の確認や副作用^の防止に有用であった^. 以上の結果から, 完全自動化高速液体^ク^ロ ^マ ^トグラフシステム R E M E D i^‑H S^⑳ほ包括的な薬毒物分析^に極めて有用であり,

医中毒学的実務^{および}救急医療^に^おける有力^な手段となりうることが示された.

K ey ^w ^{o r}ds fo r e n sic to xic olog y^, ^{r a}pid dr ug ^s^c^rê^{e n l}ⁿg^, q ^{u a}litative a n al_ysI S, qû âⁿtitativ e anal_ysis, H P L C

平成8 年⁹ 月^{2 6 日}受付, 平成⁸ 年¹⁰月^{2 1 日}受理

A b br e viatio n s : A R, abs o rba n c e r atio; A R l, abs o rba n c e r atio of 20 9 n m to 2 05 n m ; G C^‑M S , g^{a S} Chro m atog^{r a}ph_y m a s s sp^{e c}tr o m etry ; G X, gl_ycin e xylidide;^･H P L C, high p^{e r}fo r m a n c e liq^uid chr o m atog^{r a}phy ; IS_,inter n alsta nda rd;IS l,N ^‑ethyln o rdi_{a z}ep^{a m} ;IS 2,Chl^{o r}pheni^r^{a m}ⁱ^{n e}; M E G X ,m O nOeth_yl_gl_ycin e xylidi'_d

e; M/^Z^,

m a s s/ê^l^{e c}^t^rⁱ^c ^c^h^{a r}gê; N ^‑D E S, N^‑desm eth_yldi_phe nh_ydr ami ^{n e}_; Q^F , q^{u a n}titatio n fa cto r; Q^{L P}, qûalific atioq

障ポが報

わ☆幣∵巌rよ‰句

(2)

全^て^の中毒症例^の診断^は, 体内^に^おける当該薬毒物^の同定によってはじめて確定されるため, 薬毒物分析体制^の確立は極^め

て重要な課題^である. 今^日^, 薬毒物分析体制整備^の進んだ米国を中心^に, 各種分析放器^の発達ほ目覚まし^いも^の^があ^り, 我^が国においても, こうした磯器分析が臨床や法医実務^で威力を発揮^して^い^る^. ^{ただし}現状^{でほ}, 現場^の状況^などから推定される薬毒物のみを対象とする, 限られた範閃^の分析となる憤向^ほ否めず⁾, 対象物質が未知^の場合^に広範囲^の薬毒物分析をど^のよう^に行う^べき^か^{につい}^{ては}t な^お十分な検討^を必要^とす^る^.

さら^に, 分析結果を剖検所見^の解析や臨床現場^{での}治療に的確^に反映^{させるため}^に, 薬毒物分析^{ほ可}及的迅速^に行われる^のが理想的である^. しかる^に我^が国^{でほ}薬毒物分析体制^の整備^は人員および設備^の両面^で大きく立ち遅れており, 救急医療や法医剖検例等を対象^とす^る薬毒物^の包括的緊急^{スク}^リ ^ー ^ニ ^ン^{グほ}

これまでほとんど行^{われて}来なかった²⁾^. このような問題^に対処す^{るため}, 当教室^{では}従来より蒋層^ク^ロ ^マ ^トグラフィ ^ー

(^th in^‑1aye r chr o m atog^{r a}phy, T L C) とガ^ス ^ク^ロ ^マ ^トグラフ _ィ ^ー

ー質量分析法 (ga s chr o m atogr aphy m a s s spe ctr o m etry,

G C^‑M S) ^の両^シ^ス ^{テム}^を用^いた ∴薬毒物^ス ^ク^リ^ー ^ニ ^ン^グ^に関す

る研究を継続してきた^{2 ト l)}^. しかしこれらのシステムにおいて

T L C では感度^が低^い点, また G C^‑M S ではやや長^い分析時間を必要とする点などで, 改善す^べき問題点^が残っている.

本論文では米国で開発された完全自動化高速液体^ク^ロ ^マトグラフ

ィ ^ーシステ ^ム (R E M E D トH S^⑧, B I O^‑R A D, He r c ule s,

U^.S^.A^.)^{F こ}よる迅速な定性^{および}定量分析^の^可能性を基礎的^に検討し, この成績に基づき法医実務や救急患者試料から^の薬毒物^{スク}^リ^ー ^ニ ^ン^{グおよび}薬物^モ^ニ ^タ^リ^ン^グ^へ^の応用を試^{みた}^.

材料^{およ}び方法

Ⅰ^. 分析装置

R E M E D i^‑H S ⑳ は高速液体^ク ^ロ ^マトグラフシステム (h igh

pe rfo r m a n c eliquid chr o matogr aphy, H P L C) ^に, スキ_ャン ^エソ

グ紫外線 (ultr avi01et_,U V) 検出券と^コ ^ンピュ ^ータ ^ーを接続した新^し^い薬物分析装置^であ^る^. ^{この}装置付属^の ^コ ^ン ^ピ^ュ ^ー ^タ ^ー ^にほ , 約6 5 0種塀^の薬物^に^つ ^いて , 内部標準物質 (ⁱⁿ^t^{e r n a}^l

sta nda rd,IS) ^に対する各薬物^の相対保持時間 (r elativ e r ete ntio n tim e, R R T), および 2 0 5 から 3 0 0n m まで^の吸光^ス ^ペ

クトルを用^いて得られた各^パ ^{ラメ} ^ー ^タ ^ー ( 定性パラメ ^ータ ^ー) (qu alific atio n pa r a m ete r,Q ^{L P}) ^が薬物同定^ラ^{イブ}^ラ^リ ^ー ^に登録されており, 検体中^の薬物同定を自動的^に行う^ことができる^. 薬物同定^ライブラリ ^ーには各々の薬物^に対して, 以下^に述^べる Q ^{L P} ^が登録^され^{てい}^る^. すなわち R R T l と R R T 2 は, 各^々 I S である N^‑ ^エチルノルジアゼパム(N‑^e^t^hyln o rdia,^{Z e}^p^{a m} ^,

l S l) ^と^ク^ロ^{ルフ} ^ェ ^ニ^{ラミ} ^ソ(^c^{h l}^{o r}phe nir a min e,I S 2) ^に対する R R T を意味して^いる^. また, シミラリ^ティ ^ーファクタ ^ー

(simila rit yfa cto r,S F) は検体中^の薬物から得られた^ス ^ペ ^クトラムと, そ^の薬物^に^つ^{いて} R E M E D i^‑H S^⑳ のライブラリ ^ーに登録されている^ス^ペクーラムとの煉似性を数値で表わしたものである. さらに, 吸光度比 (^a^b^{s o r}^b^{a n c e} ^{r a}^tⁱ^o^, ^{A R}) は 2 つの異なる波長^{にお}^け^る^{吸光度}^の^此^で^, ^各薬物^に特徴的な 3 波長比を登録

しており, しm a x は薬物スペクトラムのピ ^ーク波長を示し, セカンドデリバテ _ィブ(^{s e c o n}^{d d}^{e r}ⁱ^{v a}^tⁱ^{v e}) ^ほ^ス^ペクトラムを 2 次数分した場合^に , 2次微分値が 0 を示す波長^に相当する.

同装置^は検体^の前処理用^と分離用^{として}各^々 ²本, 計4本^の

カラムを装備して^いる^. すなわち, 検体が通過する順番^に,

1) 除蛋白 ^･脱塩等を行^なう1 0×2^.1m m 疎水性^{ポリ}^マ ^ー ^カ ^ートリッジ(^ビ ^ュ ^リ^フィケ ^ーショソカ ^ートリッジ) (^Ha mitto n,

Re n o,U S A), 2) 酸性物質等^の除去を行なう 1 0^×4^.Om m 陰^イ

オン交換^カ ^ー ^{トリ} ^ッ ^ジ( ^エ^ク ^ス ^{トラクシ} ^ョ ^ン^カ ^ー ^{トリ} ッジ) (A‑^{2 8}^,^{B I O}‑^{R A D}^, ^Ri^c^h^m ^{o n}^d^,^{U S A}⁾, 3) 中性薬物^の分離を行なう2 5×3^.2m m 逆相^カ ^ートリッジ(^セ ^バ ^レ ^ー ^ショソー^ト^カ ^ー ^ト

リッジ) (^{S h}^{a n}^d^{o n},C he sh ir e,U.K.), そして 4) 最後^に塩基性薬物^の分離を行なう1 60 ×4^.6m m 陽イオン交換^カ ^ートリッジ(^セ

バレ ^ーショソ ^ー2^‑カ ^ートリッジ) (^M ^{a c}^h^{e r}y^‑Nagel, Du r e n,

Ge r m a.ⁿ^y⁾ ^の⁴ ^本^{のカ}^ラ^ム^で^あ^る^S)

〜7)

. なお移動相は, アセト^ニ

トリルとリン酸緩衝液 (pH 7^.0 5) を容^{積比}^{3 3}^:⁶⁷^に^{混合}^{した}も

のを使用^{して}^い^る^.

Ⅰ^. 薬毒物分析方法

分析手順^は検体 (^血清, 血策, 尿, 胃内容, 脳脊髄液^{など}) 1_ml に対して, I S として.^{I S l} ^{( 濃度}^{1 2}^{p g}/ ^m^l⁾ ^{と I S 2}( 濃度 1軸g/^m^t⁾ ^の^{両者}^を^含^む^{溶液}^, ^{または} ^一 ^方^の^{みを}^含^む^{溶液}^を

0.2ml 加^え, ボルテックスを用いて十分^に混和^{した}後t 9 5 0 0 回転/分で 1 分間遠心し, 尿 ^･胃内容等はその上清を採取して測

1 mlo【n rim e,占t O m a eb C O n t e n t,e t C.

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Ce n t rifugê^d^{a t}^{9 5 0 0}^rp^m f brl minin amic r o山gê^{t 1 1}^bê

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【Ce n t ri 餌gê^d â^{t 5 0 0 0} ^rp^mrb r5 min in 8C e n t rifug⁸^{1 f王}¹^{t e r} p^{r e}p^{a r e}d e x cIu 占iv el y fb r 5 e r u r n 5 a m p lê】

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S8 m p l^e p^{r e}p^{a r a t}io n p^{r o c e}du r e

St!p^{a r a t}io np^{r o c e}du r e

F ig^･1^･ Sa mple pr epa r atio n pr o c edu r e s fo r R E M E D i^‑H S^⑧

SySte m ^.I S, inte r n al sta nda rd^.

p^{a r a m e}te r; R T, rete ntio n tim e; R R T, r elativ e r ete ntio n tim e; R R T l, .

r elativ e r ete ntio n tim e to

N ^〜ethyln o rdia z ep^a ^m ; R R T 2, r elativ e r ete ntio n tim e to ch lo rphe nir ami n e; S F , Similari_{t y} fa cto r; T L C,thin^‑1ay^{e r} Chr o m atogfaphy ; U V , ult_{r a v}iol^e^t

研究 床 析 関す 臨 法医学的迅速薬毒物分 用 完全自動化高速液体

冒

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研究床析関す臨法医学的迅速薬毒物分用完全自動化高速液体