●人工臓器 ─最近の進歩 ■ 著者連絡先 東京大学大学院工学系研究科バイオエンジニアリング 専攻・機械工学専攻 （〒113-8656 東京都文京区本郷7-3-1） E-mail. [email protected]
1. はじめに
組織・臓器に障害・欠損・不全が認められた場合に，最 終的な治療手段として臓器移植に頼らざるを得ないケース が未だに多く存在する。しかしながら，ドナー不足，ウイ ルス感染などの問題から，臓器移植に代わる治療手段の確 立が重要な課題となっている。これらの課題を解決する手 段として，ポリマーや金属による人工臓器の開発が注目さ れている。 人工臓器による治療は，安定した製品の供給，ウイルス 感染の危険性の低減などの観点から，古くからその完成が 熱望されてきた。コンタクトレンズ，人工歯根，人工関節， 大口径の人工血管など，人工臓器開発には多くの成功例が 存在し，現代の我々の生活になくてはならないものとなっ ている。一方，人工材料で作製した人工臓器の中には，生 体機能代替性，耐久性，生体適合性などに問題があり，実 用化が困難なものも多数存在する。生体内の臓器は，血液 と直接的な接触，または緻密な毛細血管網と共存する形で 間接的な接触を介して機能している。したがって，血液や 血管との反応性，すなわち血液適合性に優れた人工臓器の 開発が必要不可欠である。このような背景があるにもかか わらず，血液適合性に優れた人工材料の開発には限界があ り，血栓形成が原因で実用化が難航している人工臓器も少 なくない。材料科学者による最先端の素材開発によって， 開発の糸口が見え始めている臓器もある一方で，根治が期 待される再生医療技術による臓器の開発が強く望まれてい る。本稿では，最新の組織工学・再生医療研究について紹 介する。2. 組織工学の 3 要素
細胞の再生能力を引き出しながら臓器を再生させる組織 工学研究は，1990年代にハーバード大学とマサチューセッ ツ工科大学（MIT）のLanger・Vacantiらによる研究で広く 認知されるようになった1),2)。ネズミの背部に移植された ヒト外耳の映像がニュースで大々的に取り上げられたこと も，再生医療が広く認知されるきっかけになった。この頃 から，大学・企業・投資家による多角的な取り組みが始ま り，再生医療研究が爆発的に推進されるようになった。 組織工学・再生医療研究には，細胞，担体（スキャフォー ルド），増殖因子と呼ばれる3要素（図1）がある2)。典型的 な組織工学のアプローチとしては，目標とする臓器の構造組織工学と再生医療
東京大学大学院工学系研究科バイオエンジニアリング専攻・機械工学専攻古川 克子
Katsuko S FURUKAWA 図1 典型的な組織工学・再生医療のアプローチの3要素（足場）を生体内分解性の材料で作り，そこに任意の細胞を 播種し，さらに発生の過程または組織治癒の過程で組織・ 生体内部に存在する因子（成長因子など）を添加して組織 形成を促すというものである。 1） 細胞 この中で最も重要な要素は細胞であり，細胞を用いない アプローチは組織工学・再生医療の定義からは外れること となる。細胞工学・再生医療には，①細胞による再生能を 引き出し，移植した細胞そのものから臓器構築を促すアプ ローチと，②細胞から分泌される各種ファクターをドラッ グデリバリーシステムの供給源として，細胞を組織構築に 間接的に関与させるアプローチが存在する。前者のアプ ローチが大半であり，対象臓器を構成する実質細胞を少量 採取して，生体外で培養する研究が今までに多く行われて きた。すなわち，生体外で，対象とする臓器の細胞を少量 採取して培養することによって充分な細胞数を確保し，そ の結果として脱分化型のフェノタイプを呈してしまった細 胞をもとの分化状態にコントロールすることによって，正 常な機能を有する臓器を構築しようとするものである。 さらに近年，幹細胞の基礎生物学に関する研究が進み， その結果として骨髄性幹細胞3)，末梢血由来幹細胞4)，臍帯 血由来幹細胞，胎盤由来幹細胞，そして人工多能性幹細胞 （iPS細胞）5)を含む幹細胞による臓器構築技術に期待が寄 せられている。幹細胞は，脂肪細胞，骨芽細胞，骨格筋細胞， 軟骨細胞，血管内皮細胞など多くの臓器を構成する細胞に 分化可能な性質である「多分化能」を有することが報告さ れてから，幹細胞を用いた組織工学・再生医療研究の今後 の展開が期待されている。これらの幹細胞の多分化能に関 する証明の多くは，2次元培養による成果であり，現段階 では幹細胞から移植可能な3次元的な構造をもった再生臓 器の構築を意味していない。細胞生物学者が発見した最新 の幹細胞における知見を利用して，いかに3次元的な構造 を有する臓器構築を試みるかが今後の課題となっている。 2） 構造体のデザイン 組織工学・再生医療用の担体の開発技術は，ここ数年で めざましい進歩を遂げた。担体を用いた組織工学の従来の アプローチでは，生体内分解性のプラスチックまたはセラ ミックスをスポンジ状の構造体に成形した後に細胞を播種 することによって，材料上で細胞が分裂・増殖し，細胞外 マトリクスが分泌される。同時に，足場材料がゆっくり分 解することによって，担体形状が維持されながら組織構造 体が構築されるというものである。 しかしながら，実際に生体内で機能する臓器を構築する ためには，臓器の外部形状を任意のものに制御する必要が あり，ここ数年，担体の外部・内部形状の制御技術に関す る工学技術が報告されるようになっている。例えば，生体 内分解性のプラスチックを融点以上の温度で液状化してノ ズルの先端から射出することによって，3次元構造体を造 形できる装置が開発された。また，3次元構造体の造形精 度を上げるために，層構造ごとに担体を機械加工した構造 体を積層させることによって，最終的な目標とする臓器構 造をデザインする工学的な手法6)も報告された。さらに， 緻密な構造設計を具現化するために，粉末化した生体内分 解性材料をバインダーなどで積層造形する技術7)や，光反 応性のポリマーで光造形する技術8)∼10)を用いて，構造体 をデザインする報告もなされている。これらの手法は担体 をベースにした臓器の構造体の設計手法であり，多くの臓 器で確実に構造体を構築する手法として，日々，材料の設 計，構造体の3次元造形の制御精度が進歩している。 さらに，担体に播種した細胞の分化制御効率を上げるた めに，近年では材料を構造構築の誘導材として捉えたアプ ローチも多数報告されている。生体適合性に優れた材料が 数多く報告され，その臨床応用が進められているものも多 く存在することも事実ではあるが，臓器の適用部位や状況 によっては必ずしもうまく生体組織に適合しない場合も存 在する。すなわち，材料が生体内で免疫反応，分解速度の 制御，分解産物による毒性（pH変化などによる化学的な効 果，分解産物の粒子径，物質形状による物理的な効果も含 まれる），移植による炎症反応，瘢痕形成を惹起することも ある。発生や組織治癒の過程では，細胞間相互作用が充分 に存在する状態が重要であることが多い。例えば，心筋組 織の場合には，細胞間相互作用が存在することによって初 めて心筋細胞間のギャップジャンクションが形成され，そ の結果として組織全体としての拍動がスタートすることが 報 告 さ れ て い る11),12)。 温 度 感 受 性 の ポ リ マ ー で monolayer状の細胞シートを作製して移植するアプローチ では，細胞の分化制御に優れたシート構造体を形成できる ことが報告されている11)。既に心筋組織などで臨床応用 が始まっており，さらに細胞シートを積層させるマシーン の開発も報告されていることから，本モデルの今後の発展 が大きく期待されている。また，軟骨組織は生体内部で無 血管の組織として存在し，酸素や栄養の要求性が低い組織 であるために，組織の厚みがある多層構造を生体外でダイ レクトに3次元構築するための形状コントロール材を用い た研究も報告されている13)∼16)。厚みのある組織を作製 するにあたり，外部形状を制御するために，形状コントロー ル材は必要不可欠であり，本モデルの有用性は動物実験モ デルを用いて検証されつつある。細胞の種類によって酸
素・栄養要求性が異なることから，これらの要求性の違い が組織厚の限界を左右する決定的な因子となっていると考 えられている。 2種類以上の細胞から構成され，複雑な3次元構造を有 する組織を構築するための新たな研究手法も検討されてい る。Single cell17),18)や細胞凝集塊（スフェロイド）をゲル 化材料に包埋して積層造形するアプローチが報告19)∼21) されており，複雑な内部・外部形状を有する組織構築のた めに有用な工学手段になりうると期待されている。 Single cellを用いたアプローチでは，原理上，精度の高い 複雑構造体の造形が実現可能とされている。細胞凝集塊を 用いたアプローチでは，細胞間相互作用の効果によって組 織分化能に優れた構造体の複雑形状設計が可能とされてい る。現時点では，血管内径が0.9∼2.5 mmの再生血管様構 造体の形成の成功例が報告されている19)。物質要求性の 高い幹細胞の凝集塊を用いた造形では，周囲の物質供給環 境を整えることによって，肝臓様の3次元組織構築が成功 したことが報告された22)。今後，さらに具体的な組織構 造体の成功例の報告が待たれる興味深いアプローチであ る。
3. 組織工学・再生組織の分化制御
組織工学・再生医療の技術によって構築した臓器におけ る最大の問題点は，細胞の分化制御が不十分なことである。 従来の研究手法では，再生医療の3要素の一つである化学 因子の添加によって，組織の分化制御の可能性が追究され てきた。しかしここ数年，細胞の分化制御は，化学因子以 外の物理の視点でユニークな研究が行われており，例とし て幹細胞の分化が担体の材料力学的な性質や細胞内の張力 バランスなどの力学環境の相違によってダイナミックに制 御されることが報告されている23),24)。 アメリカのEnglerらは，材料のヤング率を0.1∼40 kPa の範囲に制御したアクリルアミドゲルの表面に幹細胞など を播種して培養したところ，0.1∼1 kPaの表面では神経細 胞に，8∼17 kPaでは筋肉，25∼40 kPaでは骨系の細胞に 幹細胞が分化するという興味深い知見を発見した23)。こ れらの現象が非筋肉myosinⅡ，アクチン，Paxillinなどを 介した反応であることも報告された。 Englerらの発見を機に，細胞内の力学環境と細胞の分化 制御に関する個性的な研究結果が次々と報告されるように なった。酸化チタンのナノチューブの直径を30∼100 nm の範囲に制御して材料表面に垂直に配向させ，間葉系幹細 胞を播種し培養したところ，径の増大に伴い材料表面に細 胞が細長く配向し，径の減少に伴い細胞は材料表面に丸く 接着・進展する傾向があることがわかった25)。この伸長 した細胞内には発達したアクチンフィラメントの形成が認 められ，同時に骨芽細胞様の遺伝子発現を有する細胞に幹 細胞が分化することがわかり，細胞の形態・張力と細胞分 化との間に密接な関係があると報告された。 さらに，電子線照射リソグラフィーの技術を用いて， polymethylmethacrylate膜に120 nmのナノピットを秩序・ 無秩序に形成し，間葉系幹細胞をその材料表面で培養した ところ，秩序立ってナノピットを形成した材料上で培養し た幹細胞は骨芽細胞様のフェノタイプを呈することがわ かった26)。 さらに，ポリカーボネート膜に秩序・無秩序の120 nm のナノピットを形成して，幹細胞をその材料上で培養した ところ，幹細胞の骨芽細胞・脂肪細胞への分化制御が可能 であることがわかった27)∼29)。これらの分化はRhoAや MyosinⅡを経由した細胞内の張力の発生に連動して制御 されていることがわかった。 さらに，細胞接着面が限定されている材料表面で幹細胞 をsingle cellの状態で培養したところ，骨・脂肪の分化培 地中では，正方形から長方形にそのアスペクト比を変化さ せることによって，幹細胞を脂肪細胞から骨芽細胞に分化 制御できることが報告された30)。また，花形，正五角形， 星形の3種類の5角形の細胞接着面を有する材料表面で幹 細胞を培養したところ，花形は脂肪細胞，正五角形は脂肪 細胞と骨芽細胞，星形は骨芽細胞に幹細胞が分化コント ロールされることがわかった（図2）。これらの骨芽細胞・ 脂肪細胞への幹細胞からの分化は，微小管重合，アク チン重合，MyosinⅡ，ROCK，インテグリンシグナル， MAPK（p38，ERK，JNK），DKK1，sFRP3，DKK1，Wntな どによって複雑に制御されており，力の分布との相関が報 告された30),31)。 Monolayer様の細胞集団においても，形態と力の分化に 図2 Single cellの形態による幹細胞の分化制御及ぼす効果が調べられた。幹細胞を2次元状のmonolayer として細胞集団で培養した場合，円，四角，楕円，偏心した 同心円，S字状のひも様組織では，張力の加わらない内部 の細胞は脂肪細胞に，張力の加わる外周部の細胞は骨芽細 胞様の細胞に分化することが報告された（図3）32)。さら に，任意の幅や高さを持つ格子状の細胞接着表面を有する パターン化基盤を作製して幹細胞を培養したところ，特定 の幅を持つパターン上で幹細胞が骨芽細胞に再現性よく分 化し33)，これらの現象が細胞接着斑，アクチンフィラメン トの重合などの細胞のテンション・張力を制御する因子を 介して起こる現象であることが示された34)。 材料表面のtopologicalな構造設計は，細胞の分化制御シ グナルとして重要であり，長期間に亘る培養においても，2 次元的な組織の分化の方向性を大きく左右する重要な因子 であると考えられている。Monolayer様の細胞集団では， 円柱形状をしたロッドに播種した細胞の牽引力などの物理 量を計測できることから，これら物理量と細胞の分化との 関係を直接的に計測することが可能であり，細胞内の力の 分布と細胞の多分化能との間には何らかの相関があること が報告された。 3次元組織内部における細胞の分化制御に関する知見も 報告されている。ゲル材料内に円柱状の幹細胞から構成さ れる組織を封入して培養した3次元組織モデルでは，組織 外周部は骨芽細胞，内部は脂肪組織に分化した32)。3次元 的に培養された細胞集団内部における力の分布を直接的に 計測する手段がないため，3次元組織内における力と細胞 の分化との関係の直接的な証明は困難であるが，Myosin ⅡやRhokinaseなどの細胞骨格や細胞内部のテンション調 節・張力に関わる成分の阻害実験から，3次元組織におい ても「力の分布」と「分化」との関連が指摘されている。 脱分化型の軟骨細胞から分化型の細胞を有する軟骨組織 への分化誘導実験において，外部形状を制御するための モールドを用いることによって，図4に示す外部形状を有 す る，分 化 能 に 優 れ た 再 生 軟 骨 の 形 成 が 可 能 で あ っ た13),15)。円柱状に成形した軟骨組織では，横方向ではな く円柱組織の上下方向にのみ組織が3次元的に成長するこ とが報告された（図4）。細胞外マトリクスの産生および細 胞増殖によって生じた3次元組織内部における力学バラン スの変化が組織成長の方向を決定したのか，または重力な どの外部からの力学的因子が影響したのか，今後詳細な検 討が期待される。さらに，組織の表層近くには軟骨に特徴 的なプロテオグリカンが希薄な部位が認められ，明らかに 組織内部と外部では組織の構造が異なる異方性組織が構築 されていた。組織の外部形状制御のためのモールド材料の 表面特性によって生じた細胞内部への初期張力と，長期培 養によって2次的に組織内部で発生した力のバランスで組 織全体の分化状態やヘテロな構造体が形成・誘導されると 考えられる。詳細な現象解明研究によって，より複雑な3 次元構造を有する組織の成形を成功に導く手がかりが見出 されると考えられる。
4. おわりに
組織工学・再生医療技術によって再生組織を構築するた めには，細胞の分化制御技術の確立が必要不可欠である。 旧来のアプローチでは，細胞の分化を制御する方法として， 発生や治癒の過程で生じる生化学的な因子を添加して培 図3 2次元monolayerの分化制御 グレー；脂肪細胞，白色；骨芽細胞養，またはドラッグデリバリーシステムのようなデリバ リー手法で組織に因子を投与する手法が考案されてきた。 しかしながら，これらの人工的な因子を投与する手法は， 生化学的な因子による発がんの可能性，高額なコストが問 題となる可能性がある。そこで，材料表面のtopologicalな 修飾手法や組織内部の応力による組織の分化誘導手法の確 立が，組織工学技術を確かな再生医療技術に発展させる新 しい技術として期待されている。再生組織の3次元組織で は，細胞増殖および細胞外マトリクスの分泌によって組織 内部の応力状態が時々刻々と変化することが予想され，ダ イナミックな生体組織を3次元構造および細胞の生化学的 な性質の制御の観点からどのようにコントロールできるの か，今後の詳細な検討が期待されている。 文 献
1) Langer R, Vacanti JP: Tissue engineering. Science 260: 920-6, 1993
2) Lenza R, Langer R, Vacanti J: Principles of tissue engineering (3rd edition), ed by Lenza R, Langer R, Vacanti
J, Academic press, Waltham, 2007
3) Pittenger MF, Mackay AM, Beck SC, et al: Multilineage potential of adult human mesencymal stem cells. Science
284: 143-7, 1999
4) Asahara T, Murohara T, Sullivan A, et al: Isolation of putative progenitor endothelial cells for angiogenesis. Science 275: 964-7, 1997
5) Takahashi K, Tanabe K, Ohnuki M, et al: Induced of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131: 861-72, 2007
6) Sakai Y, Otsuka S, Hanada Y, et al: A novel poly-lactic acid scaffold that possesses a macroporous structure and a branching/joining three-dimensional flow channel network: Its fabrication and application to perfusion culture of human hepatoma Hep G2 cells. Mat Sci Eng C 37: 379-86, 2004 7) Huang H, Oizumi S, Kojima N, et al: Avidin-biotin binding
based cell seeding and perfusion culture of liver-derived cells in a porous scaf fold with a three-dimensional interconnected flow-channel network. Biomaterials 28: 3815-23, 2007
8) Leclerc E, Furukawa KS, Miyata F, et al: Fabrication of microstructures in photosensitive biodegradable polymers for tissue eigineering applications. Biomaterials 25: 4683-90, 2004
図4 再生軟骨の3次元培養
（a）任意形状を有する再生軟骨の3次元組織構築，（b）再生軟骨の組織形成像，（c）組織の成長曲線 （文献13より改変して転載）
Proteoglycan TypeⅡCN TypeⅠCN
Viscoelasticity Pathologic properties Bars: 200μm Elasticity (a) (b) (c)
9) Schade R, Weiss T, Berg A, et al: Two-photon techniques in tissue engineering. Int J Artif Organs 33: 219-27, 2010 10) Ovsianikov A, Deiwick A, Vlierberghe SV, et al: Laser
fabrication of three dimensional FAD scaf fold from photosensitive gelatin for applications in tissue engineering. Biomacromolecules 12: 851-8, 2011
11) Shimizu T, Yamato M, Kikuchi A, et al: Cell sheet engineering for myocardial tissue reconstr uction. Biomaterials 24: 2309-16, 2003
12) Zimmermann WH, Didie M, Doker S, et al: Heart muscle engineering: An update on cardiac muscle replacement therapy. Cardiovasc Res 71: 419-29, 2006
13) Furukawa KS, Imura K, Tateishi T, et al: Scaffold-free car tilage by rotational culture for tissue engineering. J Biotechnol 133: 134-45, 2008
14) Nagai T, Furukawa KS, Sato M, et al: Characteristics of a scaffold-free articular chondrocyte plate grown in rotational culture. Tissue Eng Part A 14: 1183-93, 2008
15) Furukawa KS, Sato M, Nagai T, et al: Scaffold-free cartilage tissue by mechanial stress loading for tissue engineering. Tissue Eng (IN-TECH), in press.
16) Kutsuna T, Sato M, Ishihara M, et al: Noninvasive evaluation of tissue-engineered cartilage with time-resolved laser-indued fluorescence spectroscopy. Tissue Eng Part C Methods 16: 365-73, 2010
17) Nishiyama Y, Nakamura M, Henmi C: Development of a three dimensional bioprinter: construction of cell supporting str uctures using hydrogel and state-of-the-ar t inkjet technology. J Biomech Eng 131: 035001, 2009
18) Moon S, Hasan SK, Song YS, et al: Layer by layer three-dimensional tissue epitaxy by cell-laden hydrogel droplets. Tissue Eng Part C Methods 16: 157-66, 2010
19) Norotte C, Marga FS, Niklason LE, et al: Scaffold-free vascular tissue engineering using bioprinting. Biomaterials
30: 5910-7, 2009
20) Mironov V, Visconti RP, Kasyanov V, et al: Organ printing: Tissue spheroids as building blocks. Biomaterials 30: 2164-74, 2009
21) Mironov V, Kasyanov V, Markwald RR: Organ printing: from bioprinter to organ biofabrication line. Curr Opin Biotechnol
22: 1-7, 2011
22) Hamon M, Montagne H, Kojima N, et al: Avidin-biotin-based
approach to forming heterotypic cell clusters and cell sheets on a gas-permeable membrane. Biofabrication 3: 034111, 2011
23) Engler AJ, Sen S, Sweeney HL, et al: Matrix elasticity directs stem cell lineage specification. Cell 126: 677-89, 2006
24) Zajac A, Discher DE: Cell differentiation through tissue elasticity-coupled, myosin-driven remodeling. Curr Opin Cell Biol 20: 609-15, 2008
25) Oh S, Brammer KS, Li YSJ, et al: Stem cell fate dictated solely by altered nanotube dimension. Proc Natl Acad Sci USA 17: 2130-5, 2009
26) Dalby M, Gadegaard N, Tare R, et al: The control of human mesenchymal cell differentiation using nanoscale symmetry and disorder. Nat Mater 23: 997-1003, 2007
27) Mrksich M: Multipotency retained. Nat Mater 10: 559-60, 2011
28) McMur ray RJ, Gadegaard N, Tsimbouri PM, et al: Nanoscale sur faces for the long-term maintenance of mesenchymal stem cell phenotype and multipotency. Nat Mater 10: 637-44, 2011
29) Reilly GC, Engler AJ: Intrinsic extracellular matrix properties regulate stem cell differentiation. J Biomech 43: 55-62, 2010
30) Kilian KA, Bugarija B, Lahn BT, et al: Geometric cues for directing the differentiation of mesenchymal stem cells. Proc Natl Acad Sci USA 11: 4872-7, 2010
31) Nelson CM, Jean RP, Tan JL, et al: Emergent patterns of growth controlled by multicellular form and mechanics. Proc Natl Acad Sci USA 102: 11594-9, 2005
32) Ruiz SA, Chen CS: Emergence of patterned stem cell differentiation within multicellular structures. Stem Cells
26: 2921-7, 2008
33) Seo CH, Furukawa KS, Suzuki Y, et al: A topographically optimized substrate with well-ordered lattice micropatterns for enhancing the osteogenic differentiation of murine mesenchymal stem cells. Macromol Biosci 11: 938-45, 2011
34) Seo CH, Furukawa KS, Montagne K, et al: The effect of substrate microtopography on focal adhesion maturation and actin organization via the RhoA/ROCK pathway. Biomaterials, in press
