高 脂 肪 食 肥 満 ラ ッ トに お け るGH-IGF-I
axisの 検 討
埼玉医科大学第四内科
山
中
佳
代
Decreased GH-IGF-I Axis in Obese Rats Induced by High Fat Diet
Kayo YAMANAKA
The Fourth Department of Internal Medicine, Saitama Medical School
Growth hormone (GH) and IGF-I are considered to be essential to adipocyte differentiation and may play a key role in fat mass accumulation in vivo. The aim of this study is to determine the effect of high lipid con-tent diet (HL) on serum GH and tissue IGF-I mRNA levels in rats. Male Wistar rats were administered a diet containing 29% energy as lipid for 18 weeks. Significant body weight increase was observed in HL-treated rats at 28 weeks of age, comparing with normal control (CO) rats. Significantly increased fat accumlation was also shown in epididymal and subcutaneous adipose tissues in HL rats. Serum GH levels in HL rats were significant-ly lower than those in CO rats (HL=16.5•}2.9(SEM) ng/ml vs CO=31.7•}6.0,p<0.01). Total RNA was extracted and applied to northern blot to hybridize with a rat IGF-I cDNA probe. IGF-I mRNAs were ex-pressed at 7.5 kb with several minor bands in liver and white adipose tissue. Hepatic IGF-I mRNA/i3-actin mRNA ratio in HL rats was significantly decreased (HL=0.74•}0.07vs CO=1.66•}0.59, p<0.01) in accord-ance with decreased serum GH levels. The epididymal fat IGF-I mRNA/i3-actin mRNA ratio in HL was also significantly lower than those in CO (HL=0.56•}0.13 vs CO=0.81•}0.14,p<0.02),whereas there was no significant difference in subcutaneous fat IGF-I mRNA/i3-actin mRNA ratio between HL and CO (HL=1.61•}0.31 vs CO=1.68•}0.42,NS). IGF-I mRNA levels in both liver and epididymal fat in HL rats decreased proportionately to serum GH levels, suggesting that hepatic and epididymal fat IGF-I mRNA levels are mainly regulated by GH. In an obese state, increased visceral fat accumulation may be promoted by decreased serum GH levels or vice versa.
Keywords: high lipid content diet, obesity, GH, IGF-I, adipose tissue
ま え が き
成 長 ホ ル モ ン(GH)やinsulin like growth factor-I(IGF-I)は,個 体 を 成 長 さ せ る 働 き の 他 に,生 体 内 に お い て 様 々 な 代 謝 を 調 節 す る 重 要 な 役 割 を 果 た し て い る1)2)。そ の 一 つ と し て,GHの 脂 肪 組 織 に 対 す る作 用 が 注 目 さ れ て い る。 例 え ば,成 長 ホ ル モ ン の 欠 損 はGH分 泌 不 全 症 の 患 者 の 体 脂 肪 量 を増 加 させ,ま た 成 長 ホ ル モ ンの 過 剰 は 末 端 肥 大 症 の 患 者 の 体 脂 肪 量 を 減 少 さ せ る こ とが 知 られ て い る3)∼5)。脂 肪 細 胞 レベ ル で は 前 脂 肪 細 胞 か ら完 全 成 熟 脂 肪 細 胞 に 分 化 す る過 程 に お い て,GH・IGF-Iの 作 用 が 必 要 で あ り6),IGF-Iは 免 疫 組 織 学 的 に 成 熟 脂 肪 細 胞 か ら産 生 され,分 泌 され たIGF-Iは 前 脂 肪 細 胞 の 増 殖 抑 制 に 働 く と考 え られ て い る7)。
Wistar系 雄 ラ ッ トを コ ン ト ロー ル 群(以 下COと 略 す)12匹 と高 脂 肪 摂 取 群(以 下HLと 略 す) 12匹 の2群 に 分 け て,10週 齢 か ら28週 齢 ま で 飲 水 及 び 食 餌 を 自 由摂 取 さ せ 飼 育 した 。 高 脂 肪 摂 取 群 (HL)と は,飼 料 の 脂 質 分 を 総 カ ロ リー の29%に な る よ うに コ ー ン オ イ ル を 添 加 し た 餌 を 与 え,CO 群 に は 脂 質 分 が 総 カ ロ リー の4.4%を 占 め る 通 常 飼 料 を 与 え た 。 2.血 中 成 長 ホ ル モ ン及 び イ ン ス リン の 測 定 実 験 終 了 後28週 齢 にAM10:00∼12:00の 間 に 断 頭 屠 殺 し,血 液 採 取 及 び 肝 臓,各 種 脂 肪 摘 出 を 行 っ た 。 血 液 は,血 清 分 離 後 測 定 時 ま で-20℃ で 保 存 し た 。GHの 測 定 は,rat growth hormone (rGH)[125 I]assay system(Amersham International plc, Buckinghamshire,England)を 用 い て 測 定 し た 。 ま た イ ン ス リ ン の 測 定 は,rat insulin[125 I]assay system with AmerlexTM-M magnetic separation
(Amersham Life Science, Buckinghamshire, England)を 用 い て 測 定 を 行 った 。 3.脂 肪 含 量 の 測 定
ラ ッ トの 採 血 終 了 後,subcutaneous fat(以 下SCと 略 す)に つ い て は,頚 部 か ら 体 幹,四 肢 の す べ て の 脂 肪 含 量 を 測 定 す る た め に 皮 下 組 織 か ら筋 肉 を 取 り除 き,脂 肪 の み を 丁 寧 に 採 取 し これ を 皮 下 脂 肪 組 織 重 量 と し て 測 定 した 。 ま たepididymal fat(以 下Epiと 略 す)に つ い て は,開 復 後 両 側 のEpiを 摘 出,合 計 して そ の 重 量 を 測 定 した 。
4.rat IGF-I cDNA probeの 作 製
rat IGF-I cDNAの 塩 基 配 列 よ り プ ラ イ マ ー10)11)を合 成(Cruachem社,京 都)し,こ れ を 用 い て reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR)法 に よ っ てcDNAを 作 製 した 。 使 用 した ratIGF-I cDNAの プ ライ マ ー を 以 下 に 示 す 。
sense primer: TCACATCTCTTCTACCTGGC
anti-sense primer: GTAGGTCTTGTTTCCTGCAC
肝 臓 よ り 抽 出 し たtotal RNA1μgを90℃5分 間 の 熱 変 性 後 冷 却 し,1 mM dNTP,1U RNase inhibitor,100 pmol random primer(以 上 全 て 和 光 純 薬,大 阪),200 U SUPERSCRIPTTM II RNase H-reverse transcriptase(Life Technologies'Inc ,Gaithersberg,USA),50 mMKCI,5mM Tris-HCI, 1.5mM MgCl2, 0.6mM dithiothreitolを 含 む 反 応 液 中 で23℃10分,42℃50分 ,95℃10分 の 条 件 下 で 逆 転 写 反 応 を 行 っ た 。 そ の 後,Zymoreactor(ATTO,東 京)を 使 用 し て,DNAのpolymerase
chain reaction(PCR)増 幅 を 行 っ た 。Taq polymerase(Promega ,Madison,USA)1U,各 々25 pmol のprimer,50mM Tris-HCI,10mM KCI,0.1%Triton X-100,1 .5mM MgCl2,各 種dNTP混 合 液 0.2mMを 含 む 反 応 液 と し95℃2分 間 の 加 熱 後,denature 95℃1分,anneal 60℃1分,extension
72℃2分 を31 cycle施 行,end runを72℃10分 間 行 っ た 。 反 応 終 了 後 に,IGF-IcDNAの366 bpの バ ン ドを 確 認 し た 。 こ のPCR productをPCR II plasmid vectorに ク ロ ー ニ ン グ し た 後,One ShotTM competent cellsで 形 質 転 換 さ せ た(TA Cloning Kit,Invitrogen,San Diego,USA)12)。 こ れ を50μg/ml ampicillin,1mg X-gal(Promega,Madison,USA)を 含 むLB(Luria-Bertani)plate上 で 増 殖 さ せ,発 育 し た 白 色 コ ロ ニ ー か らIGF-I cDNA fragmentの 存 在 をEco RIで 切 断 し 確 認 し た 。LB mediumに て 大 量 培 養 後,plasmidの 精 製 を 行 い,Eco RIで 切 断 し,IGF-I cDNA fragmentを1%agarose gelよ り 回 収 し,GENECLEAN II Kit(BIO 101 Inc.LaJolla,USA)で 精 製 し た も の をcDNA probeと し た 。 β-actin cDNA probeは 和 光 純 薬(大 阪)よ り購 入 し た も の を 使 用 し た 。
5.IGF-l mRNA発 現 量 の 定 量
Total RNAの 調 整:摘 出 し た 肝 臓 及 び 脂 肪 組 織 を そ れ ぞ れaminomethanamidine guanidine thio-cyanate salt-phenol-chloroformか ら な るAGPC solution(Sigma,St.Louis,USA)中 で ホ モ ジ ナ イ ズ を 行 っ た 後,total RNAの 抽 出 をsingle step法 に て 既 報 の 如 く13)行 っ た 。
Northern blot:total RNA 20μgを1.0%agarose-2%formaldehyde gel上 で 電 気 泳 動 し た 後,ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜 で あ るGenescreen Plus(Dupont,Boston,USA)に プ ロ ッ ト し た 。Multiprime DNA labelling systems(Amersham International plc,Buckinghamshire, England)を 使 用 し,cDNAを32 Pで
ラ ベ リ ン グ を 行 い,ラ ベ ル さ れ たcDNAをSSPE(0.75M NaCl,0.05M NaH2PO4・H2O, 5mM EDTA-Na2),50%deionized formamide,1%SDSの 溶 液 中 で420℃ で,一 昼 夜 ハ イ ブ リ ダ イ ゼ イ シ ョ ン を 行 っ た 。 次 に,ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜 を2×SSC(0.3MNaCl,0.03M sodium citrate dihy-drate)溶 液 を 用 い て 室 温 下 で 洗 浄 し,続 い て1×SSC,1%sodium dodecyl sulfate(SDS)溶 液 を 用 い て65℃ で 洗 浄 し た 。 そ の 後-70℃ で 一 週 間 オ ー ト ラ ジ オ グ ラ フ ィ を 行 い,得 ら れ た バ ン ドの 吸 光 度 をCS-9000(島 津 製 作 所,京 都)で 定 量 化 し,各 組 織 で のIGF-I mRNAレ ベ ル を β-actin mRNAレ ベ ル に て 補 正 し た 。
6.統 計 学 的 検 定
す べ て の 成 績 は 平 均 ±SEMで 表 わ し た 。 統 計 学 的 検 定 は,2群 間 の 平 均 値 の 検 定 はStudentのun-paired t-testを 用 い,ま た,2群 間 の 相 関 関 係 はPeasonの 相 関 係 数 に よ り検 討 し,p<0.05を も っ て 有 意 差 あ り と 判 定 し た 。
結 果
1.高 脂 肪 食 肥 満 ラ ッ トの 作 製 1-1)体 重 変 化
CO群 とHL群 の 体 重 の 変 化 をFig.1に 示 す 。20週 齢 の 体 重 は,CO群658.0±30.79,HL群
710.0±27.6gとHL群 で の 体 重 増 加 が 明 ら か と な り(p<0.01),以 後 もHLラ ッ トの 体 重 は 有 意 差 を 持 っ て 増 え 続 け,実 験 終 了 時28週 齢 の 体 重 はCO群 よ り13%増 加 し て い た 。28週 齢 時 のnaso-anal lengthは,CO群27.3±2.1cm vs HL群29.1±2.4cm,p=0.22と 有 意 な 差 を 認 め な か っ た 。 1-2)脂 肪 含 量
CO群 とHL群 の 総 体 重 あ た り のEpi及 びSCの 含 量 をFig.2に 示 す 。Epi,scと も にHL群 で 有 意 な 増 加(p<0.05)を 示 し,高 脂 肪 食 に よ っ てHLラ ッ トは 体 重,各 脂 肪 組 織 の 重 量 と も 増 加 し,肥 満 動 物 の 特 徴 を 備 え て い た 。
2.血 中GHの 測 定
両 群 の血 中GH値 は,CO群31.7±6.0ng/ml,HL群16.5±2.9ng/mlと,HL群 で ほ ぼCO群 の 値 の 約50%に 有 意 に 低 下(p<0.01)し て い た 。 両 群 ラ ッ トの 血 中GH値 と体 重 の 関 係 をFig.3上 段 に 示 す 。 両 群 ラ ッ トに お け る体 重 の 増 加 が 著 明 で あ る ほ ど,血 中GH値 は よ り低 い 値 を 示 し,両 者 の
Fig. 1 Body weight changes in control (N=12) and HL (N=12) treated rats. Male Wistar rats were fed standard
diet or high lipid (HL) containing diet for 18 weeks. Mean±SEM.
**: p<0.01.
Epididymal fat Subcutaneous fat
Fig. 2 Epididymal (Epi) and subcutaneous (SC) fat content in control and HL treated rats . Y axis indicates fat content expressed in % of total body weight. Mean•}SEM. *: p<0.05.
間 に 有 意 な 逆 相 関(r=-0.421,p<0.05)が 得 ら れ た 。 ま た,両 群 ラ ッ トの 血 中GH値 とEpiの 脂 肪 重 量(g)の 関 係 をFig.3下 段 に 示 す 。 血 中GH値 が 低 い 値 を 示 す ほ ど,Epiの 脂 肪 重 量 は 増 加 し て お り,血 中GH値 はEpiの 脂 肪 重 量 と も 有 意 な 逆 相 関(r=0.442,p<0.05)を 示 し た 。 図 に は 示 さ な い が,血 中GH値 とSCの 脂 肪 重 量(g)の 間 に は,有 意 な 相 関 を 認 め な か っ た(r=-0.015,p=0.56)。 3.血 中 イ ン ス リ ン の 測 定 両 群 の 血 中 イ ン ス リ ン 値 は,CO群1.83±0.98ng/ml,HL群1.93±1.37ng/ml(p=0.83)と,有 意 差 は 認 め ら れ な か っ た 。 4.各 組 織 で のIGF-I mRNA発 現 量
各 組 織 で の ノ ー ザ ン ブ ロ ッ トの 結 果 をFig.4に 示 す 。IGF-I mRNAの バ ン ドを 上 段 に,β-actin mRNAの バ ン ドを 下 段 に 示 す 。IGF-ImRNAの バ ン ドは7.5kbの 部 位 にmajor bandを 認 め,他 に
極 く 薄 い バ ン ドを4.0kbと1.9kbに 認 め た 。 吸 光 度 を 測 定 す る と,過 去 の 報 告 と 一 致 し て7.5kbの major bandがtotal signalの85%以 上 を 占 め て い る た め14),IGF-I mRNAの 定 量 は こ の7.5kbの バ ン
ド で 行 っ た(Fig.4上 段)。IGF-I mRNAの ノ ー ザ ン ブ ロ ッ トを 行 っ た 同 じ ニ ト ロ セ ル ロ ー ス 膜 を β-actin cDNAでrehybridizationし,β-β-actinmRNAの バ ン ドを2.0kbに 認 め た(Fig.4下 段)。IGF-I mRNAと 同 様 に こ の バ ン ドを 定 量 し,IGF-I mRNA/β-actinmRNAの 比 を グ ラ フ 化 し た も の を,そ
れ ぞ れFig.5に 示 す 。
Fig. 3 The correlation between serum GH levels and total body weight (upper panel) or epididymal fat content
(lower panel). Open squares indicate serum GH level of CO rats and closed squares indicate GH levels of
HL rat. There was a negative significant correlation between serum GH levels and body weight (r=0.421,
N=24, p<0.05) or epididymal fat content (r=0.442, N=24, p<0.05).
肝 臓 で のIGF-I mRNA発 現 量 は,Fig.4左 側 に 示 す よ う に,℃0群14.9±2.7×103 vs HL群 9.3±0.9×10 3(arbitrary unit,p<0.01)とHL群 で 有 意 に 低 下 し て い た 。Hepatic IGF-I mRNA/β-actin mRNA比 は,CO群1.66±0.59 vs HL群0.74±0.07と,HL群 で 有 意(p<0.01)に 低 下 し て い た(Fig.5上 段)。
ま たFig.4中 央 に 示 す よ う に,Epiで のIGF-I mRNA発 現 量 も,℃0群13.5±0.9×10 3 vs HL群 10.1±1.3×10 3とHL群 で 有 意(p<0.05)に 低 下 し て い た 。Epiで のIGF-I mRNA/β-actin mRNA比 はCO群0.81±0.14vsHL群0.56±0.13(p<0.02)と,HL群 で 有 意 に 低 下 し て い た(Fig.5中 段)。
し か し な が らFig.4右 側 に 示 す よ う に,SCで のIGF-I mRNA発 現 量 に は,CO群14.5±0.5×103 vs HL群13.6±0.6×10 3と 両 群 で の 明 ら か な 差 は 認 め ず(p=0.86),結 果 と し てSCで のIGF-I mRNA
/β-actin mRNA比 は,CO群1.68±0.42 vs HL群1.61±0.31,p=0.68と 有 意 差 を 認 め な か っ た(Fig. 5下 段)。
5.血 中GH値 と 各 組 織 で のIGFI mRNA発 現 量 の 相 関 に つ い て
各 組 織 で の 血 中GH値 とIGF-I mRNA発 現 量 の 関 係 をFig.6に 示 す 。 血 中GHレ ベ ル と 肝 臓IGF-I mRNA発 現 量 と の 間 に は,r=0.488(p<0.02)と 有 意 な 正 相 関 が 認 め ら れ た(Fig.6上 段)。 血 中 GHレ ベ ル とEpiIGF-I mRNA発 現 量 と の 間 に も,r=0.415(p<0.05)の 正 の 相 関 が 認 め ら れ た(Fig . 6中 段)。 し か しHL,CO両 ラ ッ ト間 にIGF-I mRNA発 現 量 の 差 が 認 め ら れ な か っ たSCで は,血 中 GH値 とIGF-I mRNA発 現 量 と の 間 に は 明 ら か な 相 関 関 係 を 認 め な か っ た(r=0.029,p=0.89)(Fig.
6下 段)。
考 察
肥 満 と は 「身 体 に お け る 体 脂 肪 量 が 過 剰 に 蓄 積 し た 状 態 」 で あ り,そ の 原 因 と し て は 古 くか ら(a) エ ネ ル ギ ー 摂 取 の 過 剰,即 ち 食 餌 量 の 過 剰,ま た は(b)エ ネ ル ギ ー 消 費 の 低 下,即 ち 代 謝 率 の 低 下 Fig. 4 This is a representative autoradiography of IGF-I and ƒÀ-actin mRNA expressed in liver, epididymal fat, and subcutaneous fat from control and HL treated rats. (Left) Hepatic IGF-I mRNA levels (upper) and ƒÀ-actin mRNA levels (lower) in CO and HL treated rats. (Middle) IGF-I mRNA levels and ƒÀ-actin mRNA levels in Epi in CO and HL treated rats. (Right) IGF-I mRNA levels and ƒÀ-actin mRNA levels in SC in CO and HL treated rats.
や,(c)熱 産 性 の 低 下 な ど が 挙 げ られ,こ れ らの うち の い ず れ か に 異 常 が 起 これ ば 肥 満 を 来 た す と考 え られ て い る15)。 この 中 で 臨 床 上 も っ と も重 要 と考 え られ て い る の は(a)の エ ネ ル ギ ー摂 取 の 過 剰, 即 ち 食 餌 量 の 過 剰 に よ る も の で あ り,実 際 に 食 生 活 の 欧 米 化 に よ っ て,昔 よ りも一 人 あ た りの 一 日 の 摂 取 カ ロ リー 量 は 増 え,肥 満 患 者 の 数 も増 加 して い る16)。そ の 内 訳 は 単 純 性 肥 満 が 大 部 分 で あ り, 2次 性 の 症 候 性 肥 満 は 日本 で は 極 く稀 な も の で あ る。 肥 満 で の 病 態 を 明 らか に す る た め に,様 々 な 肥 満 モ デ ル 動 物 が 作 られ て い る。 そ れ ら は(1)薬剤 や 電 極 に よ る 視 床 下 部 破 壊 ラ ッ ト17)18),(2)遺伝 性 肥 満 ラ ッ ト19)20),(3)食餌 性 肥 満 ラ ッ ト21)22)と3種 類 に 分 類 さ れ て い る。(1)の モ デ ル で は 視 床 下 部 破 壊 に よ り高 イ ンス リ ン血 症 を 呈 し,(2)の 遺 伝 性 肥 満 ラ ッ トで もobese mouse(ob/ob),Zucker fatty rat (fa/fa)な ど は 遺 伝 子 異 常 に よ っ て 視 床 下 部 性 肥 満 と同 様 に 高 イ ンス リ ン血 症 を 来 た し,イ ン ス リン の 脂 肪 蓄 積 作 用 に よ り肥 満 に な る と考 え ら れ て い る 。 実 際,Zucker obese ratで 認 め ら れ る 高 イ ン ス リ ン血 症 は,leanモ デ ル と比 較 し て4∼10倍 の イ ン ス リ ン 高 値 を 示 す 状 態 で あ る と の 報 告 が 多 い19)23)。(3)の食 餌 性 肥 満 ラ ッ トは,何 らか の 食 餌 性 負 荷 に よ っ て 起 こ る後 天 性 の 肥 満 で あ り,人 間 で
Fig. 5 Ratio of IGF-I mRNA to ƒÀ-actin mRNA in the liver (upper panel), epididymal fat (middle panel) and sub-cutanous fat (lower panel) obtained from CO (N=12) and HL (N=12) treated rats. Mean•}SEM. **:p<0.01, *: p<0.02.
の 肥 満 の 大 部 分 を 占 め る単 純 性 肥 満 に 最 も近 く,ま た(1)(2)に認 め られ る 様 な早 期 か ら の 高 イ ン ス リン 血 症 及 び 視 床 下 部 に お け る 原 発 性 の ホ ル モ ン異 常 な どが み られ な い 。 しか しな が ら,過 食 性 の 肥 満 ラ ッ トで も,コ ン ト ロー ル と比 較 し て20%未 満 の 体 重 増 加 を 示 す 軽 度 肥 満 で は 空 腹 時 の 血 中 イ ン ス リン
IGF-1 mRNA level (in arbitrary unit)
IGF-1 mRNA level (in arbitrary unit)
IGF-1 mRNA level (in arbitrary unit)
Fig. 6 Correlation between serum GH levels and IGF-I mRNA in the liver (upper panel), epididymal fat (middle
panel) or subcutanous fat (lower panel). Open squares indicate serum GH levels of CO rats and closed
squares indicate GH levels of HL rats. There was a positive significant correlation between serum GH levels
and IGF-I mRNA levels in the liver (r=0.448, N=24, p<0.02) or epididymal fat (r=0.415, N=24, p<0.05),
but not in subcutaneous fat (r=0.029, N=24, p<0.892).
値 に 差 を 認 め な い が,50%以 上 の 高 度 肥 満 で は 有 意 な 上 昇 を 認 め た とす る 最 近 の 報 告 が あ る24)。今 回 用 い た 高 脂 肪 食 肥 満 ラ ッ トの体 重 増 加 は13%で あ り,空 腹 時 血 中 イ ンス リン値 を 測 定 した が,コ ン ト ロ ール 群 の 値 と比 較 して 有 意 な 上 昇 は 認 め られ な か っ た 。 今 回 の 検 討 の 目的 は 単 純 性 肥 満 に よ って 起 こ るGH-IGF-I axisの 変 化 で あ り,高 脂 肪 食 肥 満 ラ ッ ト は 他 の 先 天 的 な ホ ル モ ン異 常 や,肥 満 作 成 時 に お き る 視 床 下 部 障 害 な ど を 伴 わ ず,数 あ る 肥 満 動 物 の 中 で 最 も適 当 な モ デ ル で あ る と思 わ れ る 。 雌 ラ ッ トに 高 脂 肪 食 を 与 え 肥 満 に さ せ た 過 去 の 報 告 で は, 脂 肪 含 量 の 増 加 に よ っ て 体 重,脂 肪 重 量 や 脂 肪 細 胞 の 直 径 が 増 加 して い た 。 この 肥 満 は,高 脂 肪 食 投 与 期 間 に よ っ て は 可 逆 性 で あ っ た と報 告 され て い る25)。今 回 得 られ た 高 脂 肪 食 肥 満(HL)ラ ッ トで は,対 照(CO)ラ ッ トと比 較 して 有 意 な 体 長 差 は な く,体 重 の み が 有 意 な 増 加 を 認 め た 。 ま た 体 脂 肪 量 も,腹 腔 内 脂 肪 で あ るepididymal fat(Epi)及 び 皮 下 脂 肪subcutaneous fat(SC)も,CO群 と比 較
して 有 意 な 増 加 を 示 し,肥 満 動 物 の 特 徴 を 備 え て い た 。
肥 満 患 者 で は,様 々 な 内 分 泌 学 的 変 化 が 指 摘 さ れ て い る が,肥 満 患 者 の血 中GH,IGF-Iレ ベ ル が 低 値 で あ る こ と や,GRH負 荷 に 対 す る血 中GHの 反 応 が 低 下 し て い る と の 報 告8)9)が み られ る 。 ま た ラ ッ トで は,血 中GH値 の 日内 変 動 に つ い て,male obese Zuker ratとlean littermateを 比 較 し た 場 合 に,GH pulseの 波 高 がobese ratで はleanの 約3分 の1に 低 下,ま たGH pulseの 頻 度 も少 な くな る こ と26),cafeteria dietに よ る食 餌 性 の 肥 満 ラ ッ トにGRH負 荷 試 験 を 行 い,control群 とoverweight 群 と の 間 に 有 意 差 を 認 め て い る が,GRH負 荷 前 の 基 礎 値 で も,control群 に 対 しoverweight群 で は 約3分 の1の 低 下 を 認 め て い る とい う報 告24)が あ る 。 す な わ ち,本 研 究 で 用 い たobese ratで は, GHの 変 動 は 少 な い と予 測 さ れ,採 血 条 件 を 一 定 に す る な ど に よ り,GH変 動 の 影 響 を 極 力 抑 え る よ うに 努 め た 。 本 実 験 終 了 時 のH正 群 の 体 重 は,CO群 の 体 重 の113%程 度 の 増 加 で あ り,血 中GH値 はHL群 で CO群 の 約 半 分 の値 に低 下 して い た 。 こ のHL群 とCO群 の 有 意 なGHの 差 は,今 回 の検 討 で は,体 重 及 びEpiの 脂 肪 量 に 負 の 相 関 関 係 を 認 め,肥 満 状 態 と血 中GH値 の 関 連 を 推 察 さ せ た 。 ヒ トで は113%程 度 の 体 重 増 加 は 軽 度 肥 満 の 範 疇 に 入 り,血 中GHの 基 礎 値 の 明 ら か な 低 下 は Body Mass Index(BMI)で25∼30以 上,も し くは 肥 満 度 で15∼37%以 上 の 中 程 度 か ら重 度 の肥 満 患 者 に認 め られ る と の報 告 が あ る27)。 この 違 い は ラ ッ ト との 種 差 に よ る もの と考 え られ るが,ラ ッ トで は 軽 度 の 肥 満 で も下 垂 体 のGH分 泌 は 充 分 に抑 制 さ れ る 事 が 示 さ れ た 。 ま た 今 回 の 検 討 で は,血 中GH 値 と総 体 重 との 間 に,ま たEpi重 量 と の 間 に も有 意 な 負 の 相 関 を 認 め た 。 過 去 の 肥 満 患 者 に お け る報 告 で は,血 中 のGH,IGF-1レ ベ ル は 肥 満 状 態 を 評 価 す る体 重,BMI,ウ エ ス トーヒ ップ 比 な どの 間 に は 相 関 が 認 め ら れ ず,腹 腔 内 脂 肪 量 と逆 相 関 す る28)と され て い る。 肥 満 状 態 でGH分 泌 が 低 下 す る 機 序 に つ い て は,そ の 詳 細 は 未 だ 不 明 で あ る 。 常 染 色 体 劣 性 遺 伝 子(fa/fa)を 持 ち,早 期 よ り高 イ ン ス リン血 症 を 伴 うobese Zuckerラ ッ トに つ い て は,既 に 幾 つ か の 報 告 が あ る。Zuckerラ ッ トで は, 視 床 下 部 レベ ル のGRH mRNA発 現 量 の 低 下 や,GRH負 荷 に よ る下 垂 体 で のGHの 反 応 性 の 低 下, お よびGH mRNA発 現 量 の 低 下 が 示 され て お り,GH分 泌 の 欠 乏 の 原 因 は,下 垂 体 ま た は 視 床 下 部 レベ ル で 生 じて い る と考 え られ て い る26)29)。こ れ ら の 所 見 は,肥 満 患 者 で の 血 中GH分 泌 低 下 や GRH負 荷 に 対 す るGHの 反 応 性 の 低 下 な どの 所 見 と一 致 し て い る 。 しか しな が ら,最 近 の報 告 で は Zuckerラ ッ トの 血 中GHが 低 値 で あ る に も か か わ らず,leanラ ッ トと比 較 して 体 長 の発 達 に は 差 は な い の は,血 中GHが 低 値 で あ っ て も 血 中 の 高 濃 度 の イ ン ス リ ン が 肝 細 胞 で のGH receptorのup regulationを 起 こす こ と や,IGF-I mRNAを 増 加 さ せ る こ とに よ りIGF-I合 成 を 増 加 さ せ,そ の 結 果
るcafeteria dietに よ って 作 成 さ れ た ラ ッ トで は,視 床 下 部 で のGRH mRNA,下 垂 体 で のGH含 量, GH mRNAレ ベ ル を 比 較 す る と,コ ン ト ロー ル と肥 満 ラ ッ トで は 有 意 差 を 認 め な か っ た24)と の 最 近 の 報 告 が あ る。 肥 満 患 者 で の 体 重 減 少 に よ るGH分 泌 能 の 改 善 は,GRH負 荷 の み で は な く,1-dopa, arginine,低 血 糖 等 の あ ら ゆ る負 荷 に対 して 反 応 性 が 回 復 す る8)。 こ の 点 か ら も,血 中GHレ ベ ル の 低 下 は2次 的 な も の に よ る と考 え ら れ る 。 しか し2次 的 なGH分 泌 不 全 で あ ろ う と も,そ の 結 果 と し て 腹 腔 内 脂 肪 量 の 増 大 を 来 た し た こ とに な り,肥 満 状 態 に 更 な る 悪 化 影 響 を 与 え て い る の は 間 違 い な い と思 わ れ る。
今 回 作 製 したHLラ ッ トのhepatic IGF-I mRNA発 現 量 は,HLラ ッ トでCOラ ッ トに較 べ 有 意 に 低 下 して い た 。 ま た,血 中GH値 とhepatic IGF-I mRNAレ ベ ル の 間 に 有 意 な正 相 関 を 認 め た 。 下 垂 体 か らGH分 泌 が 起 こ る と,そ の 主 要 な 標 的 臓 器 で あ る 肝 臓 でIGF-Iが 産 生 ・分 泌 さ れ,循 環 血 中 のIGF-Iは,そ の 殆 ど が 肝 臓 由 来 で あ る 事 が 確 認 され て い る33)。従 っ てhepatic IGF-I mRNA発 現 量 は 血 中IGF-I濃 度 を 反 映 して お り34),高 脂 肪 食 肥 満 ラ ッ トの 肝 臓 レベ ル で のIGF-I産 生 は,血 中GH 値 低 下 の 影 響 を 受 け てCO群 と比 較 した 場 合 に 明 ら か に 低 下 して い る と考 え られ た 。
脂 肪 組 織 で のIGF-I mRNAの 発 現 は,近 年 に な っ て 主 要 標 的 臓 器 で あ る肝 臓 と同 じ程 度 に 各 脂 肪 組 織 で 独 自 に 発 現 し て い る こ とが 報 告 され14),ま たin vitroの 系 で も,GHに よ り刺 激 されautocrine
の 形 態 で 分 泌 され たIGF-Iは 成 熟 脂 肪 細 胞 よ り由 来 し,前 駆 脂 肪 細 胞 に 働 き そ の 分 化 を 促 進 す る事 や,前 駆 脂 肪 細 胞 の 増 殖 を 抑 制 す る事6)が 明 らか に され た 。 こ の 前 駆 脂 肪 細 胞 へ の 分 化 の 促 進 作 用 は,IGF-Iそ の もの を 直 接 加 え て も そ の効 果 が 得 ら れ ず,GHの 投 与 に よ っ て の み 起 こ る35)。 これ は 脂 肪 細 胞 で の 分 化 に,GHの 作 用 が 不 可 欠 で あ る こ と を 示 し,事 実,脂 肪 細 胞 に はGHレ セ プ タ ー が 存 在 す る事 が 証 明 され て い る36)37)。そ の 一 方 で,加 齢 に よ り血 中GH値 が 低 下 して い る 老 齢 者 にGH を 数 週 間 投 与 す る と,体 脂 肪 重 量 の 減 少 が 認 め ら れ る との 報 告38)や,ま たGH分 泌 不 全 の 患 者 で は, そ の た め に2次 性 の 肥 満 を 来 し,皮 下 脂 肪 よ りも腹 腔 内 脂 肪 の 蓄 積 が 著 し く,GH投 与 後 は 体 脂 肪 重 量 が 減 少 す る が,そ の 程 度 は 腹 腔 内 脂 肪 で よ り強 い 事 な ど が 報 告 され て い る30)。以 上 の よ うにGH に は,in vivoに お い て 体 脂 肪 重 量 を 減 少 さ せ る 役 割 が あ り,そ の 中 で も 腹 腔 内 脂 肪 量 を よ り強 く 減 少 さ せ る方 向 に 働 く。 脂 肪 細 胞 の 増 殖 過 程 で は,前 駆 脂 肪 細 胞 が そ の 中 心 とな っ て 増 殖 し,し か る 後 に 増 殖 力 の 弱 い 成 熟 脂 肪 細 胞 に 分 化 し脂 肪 滴 を 貯 留 す る と され て い る40)。脂 肪 組 織 で のIGF-I mRNA発 現 量 の 増 加 は,脂 肪 組 織 で 前 駆 脂 肪 細 胞 の 増 殖 を抑 制 し た り,前 駆 脂 肪 細 胞 の 分 化 を 促 進 す る 可 能 性 を 示 唆 して い る。
した が っ て,HLラ ッ トのEpiに お い て,IGF-I mRNA発 現 量 が 有 意 に 低 下 して い る 結 果 は,こ の 脂 肪 組 織 で の 前 駆 脂 肪 細 胞 の分 化 が 抑 制 され,ま た 前 駆 脂 肪 細 胞 の増 殖 が 起 こ っ て い る 事 を示 す も の
と 思 わ れ る。 血 中GHレ ベ ル とEpi IGF-I mRNA発 現 量 との 間 に 認 め られ た 有 意 な 正 相 関 は,血 中 GHの 低 下 が そ の ま まEpiに お け るIGF-I mRNA発 現 量 の低 下 に 反 映 され て い る も の と考 え られ る 。 す な わ ちGHの 主 要 標 的 臓 器 で あ る 肝 臓 と 同 じ よ うに,Epiに お け る組 織 レベ ル のIGFI mRNA発 現 は,GHに よ る 調 節 を 受 け て い る も の と考 え られ る 。 そ れ に 対 して,SCに お け るIGF-I mRNA発 現 量 はCO群 と差 が な く,ま た 血 中GHと の 間 に 相 関 関 係 を 認 め な か っ た 。HLラ ッ トのSC組 織 は IGF-I mRNAを 発 現 して い る が,そ の 程 度 はCOラ ッ トのSCで の 発 現 量 と 同程 度 で あ り,肥 満 状 態 に よ る血 中GH分 泌 低 下 の 影 響 を 受 け て は い な い と思 わ れ る。HLラ ッ トで は 高 脂 肪 食 に よ る 負 荷 を 受 け な が ら,COラ ッ トと 同 じ様 に 皮 下 脂 肪 組 織 中 で 分 化 が 促 進 さ れ て い る こ とを 間 接 的 に 示 し て い る と考 え られ る。 こ の こ と は,ラ ッ トに 抗GH抗 体 を 投 与 し内 因 性GHを ブ ロ ッ ク した 場 合 に,Epi で は 分 化 した 脂 肪 細 胞 が20%に 減 少 した の に 対 し,SCで は80%程 度 の 軽 度 の 減 少 に 留 ま った と の報 告41)か ら も支 持 さ れ る 。 即 ち,皮 下 脂 肪 は 内 因 性GH低 下 の 影 響 を 強 く受 け ず に,脂 肪 細 胞 の 分 化 が 維 持 され る も の と考 え られ る 。 脂 肪 組 織 に お け るIGF-I mRNAレ ベ ル は,脂 肪 細 胞 の分 化 を 示 す 指 標 の一 つ に な り うる と考 え られ る。 また 視 床 下 部 破 壊 ラ ッ トを 用 い た 実 験 で,内 臓 脂 肪 で は 皮 下 脂 肪 よ り も脂 質 合 成 酵 素 で あ るacyl-CoA synthetaseやlipoprotein lipaseな ど の遺 伝 子 レベ ル の 増 強 が 認 め られ,内 臓 脂 肪 は 脂 肪 蓄 積 が 早 くか ら起 こ る 脂 肪 組 織 で あ り,皮 下 脂 肪 は 内 臓 脂 肪 よ り も遅 れ て 蓄 積 脂 肪 を 漸 増 さ せ て 行 くstorage tissueで あ る 可 能 性 が 示 唆 さ れ て い る42)。 この 仮 説 に よれ ば,HL ラ ッ トの よ うな 過 剰 カ ロ リー 摂 取 に よ る肥 満 で も,体 内 に お け る 余 剰 カ ロ リー の 蓄 積 先 が,腹 腔 内 脂 肪 よ り も皮 下 脂 肪 の 方 ヘ シ フ トして い る の か も しれ な い 。 した が っ て 皮 下 脂 肪 が 過 剰 に蓄 積 され る の は,生 体 に と っ て よ り好 ま し くな い 脂 肪 で あ る腹 腔 内 脂 肪 の 増 大 を 防 ぐた め の 防 御 機 構 で あ る と考 え る こ とが で き るか も しれ な い 。 結 語 実 験 肥 満 モ デ ル で あ る 高 脂 肪 食 ラ ッ トに お い て 血 中GHの 低 下 及 びGHの 主 要 標 的 臓 器 で あ る 肝 臓IGF-I mRNAレ ベ ル の 低 下 を 認 め た 。 こ のGH-IGF-I axisの 低 下 は,過 去 に 報 告 され たZucker fatty ratに 見 られ る高 イ ンス リ ン血 症 に 続 発 す る も の と は 異 な った 機 序 に よ る も の で あ ろ う。 脂 肪 組 織 で も腹 腔 内 脂 肪 の一 部 で あ るepididymal fatは,血 中GHの 低 下 に 伴 い 有 意 な 相 関 を 持 ちIGFI mRNA発 現 量 の 低 下 を認 め,GHの 支 配 下 に あ る臓 器 と考 え られ る が,皮 下 脂 肪 のIGF-I mRNA発 現 量 は 直 接GHの 影 響 を 受 け な い 。 同 じ脂 肪 細 胞 で も,腹 腔 内 脂 肪 は 皮 下 脂 肪 に 比 べ て,GHに よ り 強 く反 応 す る こ とが 示 唆 さ れ た 。 高 脂 肪 食 肥 満 ラ ッ トは,我 が 国 で 最 も 多 い食 餌 性 肥 満 患 者 に 近 く有 用 な モ デ ル 動 物 で あ る。 ま た,こ の モ デ ル に お け るGH-IGF-I axisの 低 下 は 腹 腔 内 脂 肪 に お け る 脂 肪 細 胞 増 殖 を 反 映 し,高 イ ンス リン血 症 を 来 た さ な い 初 期 の 食 餌 性 肥 満 で あ っ て も,既 に 肥 満 状 態 に 起 こ り得 る脂 肪 蓄 積 の 悪 循 環 が 始 ま っ て い る も の と考 え ら れ た 。 謝 辞 稿 を 終 え る に あ た り,本 論 文 の 御 校 閲 を 賜 わ りま し た 埼 玉 医 科 大 学 第 四 内 科 ・片 山 茂 裕 主 任 教 授, 石 井 淳 教 授,飯 高 誠 助 教 授,そ し て 直 接 御 指 導 い た だ き ま した 川 上 淑 人 講 師 に 深 謝 い た し ます 。 ま た,本 研 究 に あ た り御 協 力 い た だ き ま した 同 教 室 の 諸 先 生 方 お よび 鈴 木 徳 子 研 究 助 手 に謝 意 を 表 わ しま す 。
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(受 付 日:'96,11,13) (採 択 日:'97,2,4)
