2015 年 2 月改訂
比濁・比色時間分析装置「トキシノメーター」および
マイクロプレート法「MPRシステム」を用いた
エンドトキシン試験法における標準操作法
エンドトキシン試験法
目次 比濁・比色時間分析装置「トキシノメーター」を用いた エンドトキシン試験における標準操作法・・・・・・・・1 用意する器具および試薬 測定手順 比濁・比色時間分析装置「マイクロプレートリーダー」を用いた エンドトキシン試験法における標準操作法・・・・・・・4 用意する器具および試薬 測定手順 日本薬局方におけるエンドトキシン試験法・・・・・・・・・・6 検量線の信頼性確認試験 反応干渉因子試験 定量試験 参考・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・8 エンドトキシンの添加方法 CSE の力価検定 最大有効希釈倍数の求め方 日本薬局方、FDA ガイドライン比較表 Es-Eapp プロット法について 生物学的製剤中のエンドトキシン測定
比濁・比色時間分析装置「トキシノメーター」を用いた
エンドトキシン試験法における標準操作法
エンドトキシン試験法用意する器具及び試薬
● 希釈用試験管
● ピペット
● バイオクリーンチップ
ワコーⅡ
● 反応用試験管（リムルステストチューブS）
● アルミキャップ（アルミキャップS）
● ミキサー
● トキシノメーター
● ライセート試薬
● コントロールスタンダードエンドトキシン（CSE）
（または日本薬局方エンドトキシン標準品、USP 標準品など）
● エンドトキシン試験用水
測定手順
1.ライセート試薬の溶解、分注（シングルテストを使用する場合はこの操作は必要ありません）
使用する器具について エンドトキシン試験用水とは ガラス製の用具及び器具は、少なくとも250℃で30 分 間の乾熱滅菌を行ったものを使用して下さい。 また、吸着の恐れもありますので、確認して使用して下 さい。 プラスチック製品を用いる場合は、エンドトキシンの 汚染がないこと及び、測定に対する干渉がないことが 確認されたものを使用して下さい。 水0.1mL とライセート試薬0.1mL を混合、トキシノメー ターで測定しゲル化判定されないことを確認します。 通常は注射用水が使用できます。 （JISK8008「生化学試薬通則」には、0.006EU/mL 以 下と規定されています。） また、ガラス容器に入っている注射用水を使用する場 合には、ガラスアンプルからの金属の溶出による影響 を受ける場合（エンドトキシンの失活）があるので確 認してから使用して下さい。 ❶アルミキャップをはずす 注1 バイアル内部は真空になっているので粉末が舞い上がらないように注意して下さい 注 2 分注時にはなるべく気泡ができないようにして下さい 注 3 試験管の底は測光部なので、手で触れないようにして下さい ❷ゴム栓をゆっくりと持ち上げ、 エンドトキシン試験用水を加え 再び栓をする 注1 ❸ふたに液がつかないように ゆっくりと振り混ぜる ❹反応用試験管に0.1mL ずつ分注し、 すみやかにアルミキャップを かぶせる 注 2・注 32 比濁・比色時間分析装置「トキシノメーター」を用いたエンドトキシン試験法における標準操作法 エンドトキシン試験法
2.エンドトキシンの溶解及び希釈
各希釈溶液は次の希釈操作を行う前に30 秒以上撹拌して下さい。試薬の保存について
ライセート試薬の保存 参考 エンドトキシンの保存 溶解したライセート試薬は氷冷下または冷蔵庫内で 保存し、できるだけその日のうちに（カラー KY テスト は6 時間以内）使用して下さい。 後日使用する場合は、各ライセート試薬毎に設定され ている保存温度※にて凍結保存を行い2週間以内に使 用して下さい。また、凍結する場合は、バイアルのまま 凍結させ使用時に融解し、反応用試験管に分注してご 使用下さい。凍結融解は1回にとどめて下さい。 ●日本薬局方エンドトキシン標準品は、10000 ～ 20000EU/バイアルになるように調整されています。 ●USP 標準品は10000EU/バイアルです。 CSE は溶解後2 ～ 10℃で保存し、1 ヶ月以内に使用 して下さい。 JR-RSE、USP-RSEは溶解後は冷蔵保存（2 ～ 8℃）で 2 週間以内に使用して下さい。 注1 日本薬局方エンドトキシン標準品（JP-RSE）は10000EU/mL となるようにエンドトキシン試験用水を加えて下さい 注 2 保存していたものを使用する時は、1 分間以上撹拌して下さい 注 3 日本薬局方エンドトキシン標準品の場合は5分間 ※ES-IIシリーズ：－10℃～－30℃、ES-Fシリーズ：－10℃～－20℃、カラー KYシリーズ：－80℃以下、J/Fシリーズ：－20℃～－30℃。 実際の保存条件はそれぞれの現品説明書に従って行って下さい。 ❶1000EU/mL となるようエンド トキシン試験用水を加える 注1 ❷ミキサーで約2 分間激しく撹拌 注 2、注 3 ❸1 段階10 倍を超えない範囲で順次希釈を行うエンドトキシン希釈例（使用するライセート試薬の感度が0.0313EU/mL の場合）
－ 2 － CSE 1000EU/mL 0.2mL 1.8 10 1.8 1 1 0.5 1 0.25 1 0.125 1 0.0625 1 0.0313 1 0.0156 1.8mL 100 水 エンドトキシン濃度 （EU/mL） 検量線として使用 ※水はあらかじめ分注しておくと操作が簡単です 0.2mL 0.2mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL3.試料溶液の調製
試料溶液と試料溶液のエンドトキシンを添加した陽性製品コントロールを調製する。 希釈を行う場合は次の希釈動作の前に30 秒以上ボルテックスミキサーで撹拌して下さい。 また、1 段階の希釈で10 倍を超える希釈はしないで下さい。5.判定
●陰性コントロール（NC）が測定時間内にゲル化判定されないこと。 ●検量線の相関係数r の絶対値は0.980 以上であること。 （エンドトキシン溶液の濃度の対数値とゲル化時間の対数値の直線回帰式を最少自乗法によって求め検量線とします）注1 以上の条件を満たしたとき試験は有効となります。 求めた検量線から試料溶液のTg をエンドトキシン濃度に換算します。4.測定（測定する20 分以上前にスイッチを入れておいて下さい）
注1 ライセート試薬に加える前の試料溶液またはエンドトキシン溶液を20 秒以上撹拌して下さい 注 2 振動が測光に影響するので、測定中の試験管には触れないようにして下さい また、ミキサーは振動を避けるためトキシノメーターと同じ台に置かないようにして下さい 注1 検量線の濃度範囲を広くとると検量線が曲がる場合があります。その場合にはゲル化時間を2 回対数をとると検量線が直線になり、 検量線の範囲からはずれたゲル化時間の濃度換算の誤差が少なくなります。 ❶試料溶液又はエンドトキシン溶液 を0.1mL（シングルテストは0.2mL） 加える注1 ❷数秒間撹拌する（泡がないことを確認） ❸トキシノメーターにセットする 注 2 試料溶液又は エンドトキシン溶液 ライセート試薬4
比濁・比色時間分析装置「マイクロプレートリーダー」を用いた
エンドトキシン試験法における標準操作法
エンドトキシン試験法用意する器具及び試薬
● 希釈用試験管
● ピペット
● バイオクリーンチップワコーⅡ
● 連続分注器（推奨品：eppendorf社 マルチピペットプラス4981）
● チップ（推奨品：eppendorf社 コンビチッププラスバイオピュア2.5mL）
● 96穴マイクロプレート（推奨品：バイオクリーンプレートワコー）
● 恒温機能付きマイクロプレートリーダーとデータ処理ソフトウェア
（405nmと650nmの2波長カイネティック測定可能な機種）
※● ライセート試薬
● コントロールスタンダードエンドトキシン（CSE）
（または日本薬局方エンドトキシン標準品、USP 標準品）
● エンドトキシン試験用水
※ES-F/plate 使用時は405nm1波長カイネティック測定が可能な機種測定手順（リムルスカラー KYテストワコー使用時）
1. マイクロプレートリーダーの準備（下記、測定条件を設定）
カイネティック法（Onset time法）
測定温度：37℃
測定波長：405nm（主波長）－650nm（副波長）
＊1Onset OD：0.015
測光間隔：40秒
測定時間：120分（測定したい濃度範囲によって短縮する事も可能）
＊2攪拌条件：測定開始時に5秒間自動撹拌
＊1 ES-F/Plate 使用時は405nm（主波長）のみ ＊2 ES-F/Plate 使用時は60 分2.エンドトキシンの溶解及び希釈
各希釈溶液は次の希釈操作を行う前に30 秒以上撹拌して下さい。 注1 日本薬局方エンドトキシン標準品（JP-RSE）10000EU/mL となるようにエンドトキシン試験用水を加えて下さい 注 2 保存していたものを使用する時は、1 分間以上撹拌して下さい 注 3 日本薬局方エンドトキシン標準品の場合は5分間 ❶1000EU/mL となるようにエンド トキシン試験用水を加える 注1 ❷ミキサーで約2 分間激しく撹拌 注 2、注 3 ❸1 段階10 倍を超えない範囲で順次希釈を行う50 μ L 50 μ L 96 ウェルプレート
3.試料溶液の調製
試料溶液と試料溶液にエンドトキシンを添加した陽性製品コントロールを調製する。 希釈を行う場合は次の希釈動作の前に30秒以上ミキサーで撹拌して下さい。また、1段階の希釈で10 倍を超え る希釈はしないで付属のバイアル瓶にて下さい。6.判定
●測定時間内に陰性コントロール（NC）の測定値（Onset time）が得られないこと ●log（エンドトキシン濃度）－log（Onset time）モードで作成した検量線の相関係数rの絶対値は 0.980以上で あること。 以上の条件を満たしたとき試験は有効となります。 求めた検量線から試料溶液のOnset timeをエンドトキシン濃度に換算します。4. ライセート試薬の溶解、分注
ライセート試薬にエンドトキシン試験用水を加え、ゆるやかに振り混ぜて溶解し、氷冷する。5. 測定（測定する20分以上前に加温スイッチを入れておいて下さい）
試薬の保存について
ライセート試薬の保存 溶解したライセート試薬は氷冷下または冷蔵庫内で保存し、できるだけその日のうち（カラー KYテストは6時間以内） に使用して下さい。 各ライセート試薬毎に設定されている保存温度※にて凍結保存を行い、2週間以内に使用して下さい。 また、凍結融解は付属のバイアル瓶にて1回にとどめて下さい。 ※カラー KYテストワコー：－80℃以下、ES-F/Plate：－10℃～－20℃ 実際の保存条件はそれぞれの現品説明書に従って行って下さい。CSE希釈方法
－ 2 － CSE 1000EU/mL 0.1mL 0.9 10 0.9 1 0.5 0.5 0.9 0.05 0.9 0.005 0.9 0.0005 0.9 100 エンドトキシン試験用水 （mL） エンドトキシン濃度 （EU/mL） 0.1mL 0.1mL 0.5mL 0.1mL 0.1mL 0.1mL ❶アルミキャップをはずす 注1 注1 分注時にはなるべく気泡ができないようにして下さい 注 2 バイアル内部は真空になっているので粉末が舞い上がらないように注意して下さい ❷ゴム栓をゆっくりと持ち上げ、 エンドトキシン試験用水を加え 再び栓をする 注 2 ❸ふたに液がつかないように ゆっくりと振り混ぜる 注1 NC ❶エンドトキシン溶液 又は試料溶液 ❷ライセート試薬を すばやく加える ❸プレートの蓋をはずしてリーダー にセットして測光を開始する6
日本薬局方におけるエンドトキシン試験法
エンドトキシン試験法検量線の信頼性確認試験
用いるライセート試薬に規定されているエンドトキシンの濃度 範囲で、少なくとも3 種の濃度のエンドトキシン標準溶液を、 3 回以上測定します。 検量線を作成して相関係数r を求め、その絶対値は0.980以上 でなければなりません。反応干渉因子試験（阻害促進試験）
薬剤中のエンドトキシンを測定する場合は、既知の濃度のエンドトキシンを添加し、その回収率を調べ、薬剤が エンドトキシン試験に及ぼす影響についてあらかじめ調べる必要があります。 （同一成分及び同一分量の医薬品の場合、試料ごとに行う必要はありません。） まず、検量線の最少濃度λ1 と最大濃度λ n（n ≧ 3）の中央値のエンドトキシン濃度m を求め、m 又はm 付近の 濃度を添加します。 100 10 1 0.001 0.01 0.1 1 10 100 1 濃度追加 0.005（λ 1） 0.05（λ 2） 0.5（λ 3） 5 50（λ 4） Tim e（log） EU/mL（log） エンドトキシンの濃度範囲が一桁広がるごとに1 濃度追加しなくてはなりません。 (10 倍を超える濃度間隔をとらないこと) m 値の求め方 例1） λ1 ＝ 0.0313、λ2 ＝ 0.0625、λ3 ＝ 0.125 の場合 等倍希釈で奇数点の場合は真ん中の値がm 値となります。 m ＝ 0.0625 例2）λ1 ＝ 0.0313、λ2 ＝ 0.0625、λ3 ＝ 0.125、λ4 ＝ 0.25 の場合 log m ＝（log λ1 ＋ log λ4）/2 ＝（－ 1.504 ＋（－ 0.602））/2 ＝－ 1.053 m ＝ 0.089 算出方法 判定 B 液の平均エンドトキシン量－ A 液の平均エンドトキシン量＝エンドトキシンの平均回収量 添加回収率が50％以上200％以下であれば反応干渉因子が存在しない 反応干渉因子試験を行う試料溶液濃度は最大有効希釈倍数を超えない範囲まで希釈できます。 （『参考』の最大有効希釈倍数の求め方を参照して下さい。） A 液 試料溶液又は最大有効希釈倍数を超えない範囲で希釈した試料溶液 B 液 A 液にエンドトキシン濃度が検量線の中点付近となるようにエンドトキシンを添加した試料溶液注1 A、B 液を各n ＝ 2 以上で測定予備試験
算出方法 判定
A 液が反応促進作用又は反応阻害作用を示す場合
■試料溶液の希釈（最大有効希釈まで希釈していない場合、又は検量線の濃度を変更した場合） ■反応干渉因子の除去 ●限外濾過法 ●エンドトキシン特異的吸着剤リムルスPSシングルテストを用いたパイロセップ法 ●酸、アルカリ、界面活性剤、緩衝液などによる反応干渉因子の中和法 ●透析法 など ■ pH の調整 A 液のpH が反応至適pH7.0 ～ 7.5（薬局方ではpH6.0 ～ 8.0）の範囲から外れている場合は以下の試薬を用いて pH を調整する必要があります。注 2 （ライセート試薬との混合液が範囲以内になれば試料溶液のpH 調整の必要はありません。） 注1 エンドトキシンの添加方法については『参考』を参照して下さい。 エンドトキシン特異的でないライセート試薬は(1→3)-β-D-グルカンとも反応するので、試料溶液中に(1→3)-β-D-グルカン の存在が否定できない場合には、エンドトキシン特異的ライセート試薬を使用下さい。 注 2 pH調整用に用いる試薬例 ・エンドトキシン試験用0.1mol/L 水酸化ナトリウム試液 ・エンドトキシン試験用0.1mol/L 塩酸試液定量試験
A 液 反応干渉因子試験に適合するもので最大有効希釈倍数を超えない範囲で希釈した試料溶液 B 液 A 液と同一濃度の試料溶液にエンドトキシンを終濃度が検量線の中点付近となるように添加した液 C 液 検量線の信頼性確認で使用される少なくとも3 濃度以上のエンドトキシン標準溶液 D 液 エンドトキシン試験用水（NC） A，B，C，D 液をn ＝ 2 以上で測定します。 C 液により作成した検量線を用いて、A 液及びB 液のエンドトキシン濃度を算出します。 ● C 液より作成した検量線の相関係数r の絶対値が0.980 以上であること。 ● B 液－ A 液のエンドトキシンの回収率が50 ～ 200％の範囲であること。 ● NC であるD 液がゲル化判定されない。 以上の条件を満たし、A 液のエンドトキシン濃度に基づき被験試料のエンドトキシン濃度を求め、その値が 医薬品各条に規定された規格を満たすとき適合と判断されます。8
エンドトキシンの添加方法について
CSE の力価検定方法（トキシノメーター法）
参考 サンプルを希釈して反応干渉因子試験を行う場合は、下記方法❶のような1：1 の添加を行い、サンプル濃度を 変えずに添加したい場合（原液などに添加する場合）は方法❷のような添加法で行うと便利です。 日本薬局方では特に記載されていませんが、FDA のガイドラインでは標準品以外でのエンドトキシン（CSE）を 使用する場合には、CSE の力価を標準品と対比して求めなければならないという記載がありました。 尚、USP24 局からCSE の記載はなくなっています。 このCSE の力価はCSE の製造ロット、使用するライセート試薬によっても異なりますので、これらの変更に伴い 再検定する必要があります。CSE 力価検定
エンドトキシン標準品（RSE）の希釈系列（EU/mL） コントロールスタンダードエンドトキシン（CSE）の希釈系列（ng/mL）を4 バイアル 各n ≧ 2 で測定 判定 ●CSE の3 濃度以上がRSE の最大濃度と最少濃度のゲル化時間の範囲内であること ●RSE の検量線の相関係数r の絶対値が0.980 以上であること RSE の検量線をもとにCSE の重量あたりのエンドトキシン活性を求める 注）USP23 局から力価検定に用いるCSE のバイアル数が 4 バイアルから1 バイアルに変更になりました。 （ゲル化法のみ） － 6 － 方法 ❶ 等量添加 0.125EU/mL 4％サンプル 2％サンプル＋ 0.0625EU/mL 1mL 1mL 方法❷ 100 倍添加 （原液などに添加する場合） 6.25EU/mL サンプル原液 原液＋ 0.0625EU/mL 20 μ L 1980 μ L － 6 － 方法 ❶ 等量添加 0.125EU/mL 4％サンプル 2％サンプル＋ 0.0625EU/mL 1mL 1mL 方法❷ 100 倍添加 （原液などに添加する場合） 6.25EU/mL サンプル原液 原液＋ 0.0625EU/mL 20 μ L 1980 μ Lエンドトキシン標準品、CSE 希釈例
（使用するLAL のゲル化感度が0.0313EU/mL の場合） CSE の平均換算係数の求め方 RSE※ 10000EU/mL 0.2mL 1.8 100 1.8 10 1.8 1 1 0.5 1 0.25 1 0.125 1 0.0625 1 0.0313 1.8mL 1000 水 エンドトキシン濃度 （EU/mL） 0.2mL 0.2mL 0.2mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1 0.0156 CSE 100ng/mL 0.2mL 1.8 10 1.8 1 1.8 0.1 1 0.025 1 0.0125 1 0.00625 水 エンドトキシン濃度 （ng/mL） 0.2mL 0.2mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1mL 1 0.00156 1 0.05 1 0.00313 RSE の濃度とゲル化時間 CSE の濃度とゲル化時間 CSE の Tg EU 換算値 Log Conc RSE の検量線 Log Tg RSE（EU/mL） Tg（min.） 0.0156 54.2 54.8 0.0313 42.2 42.6 0.0625 34.0 34.2 0.125 26.6 26.8 0.25 20.8 21.4 0.5 18.0 18.2 log Tg ＝－ 0.3236log C ＋ 1.143 r ＝－ 0.9979 平均 Tg（min.） 4vial の平均 Tg EU 換算値 EU 換算係数 CSE（ng/mL） vial1 vial2 vial3 vial4 （min.） EU/mL EU/ng 0.00156 ＞ 60.0 ＞ 60.0 ＞ 60.0 ＞ 60.0 ＞ 60.00 - - 0.00313 45.7 48.5 48.5 48.3 47.75 0.0221 7.07 0.00625 34 33.7 35.5 34.2 34.35 0.0612 9.79 0.0125 26.4 25.5 27.4 25.7 26.25 0.1404 11.2 0.025 20.4 19.9 21.4 20.0 20.43 0.3046 12.2 平均換算係数 10.07EU/ng ゲル化法による力価検定方法は、リムルスHS-JシングルテストワコーまたはJシングルテストワコーの現品取扱説 明書をご参照下さい。 ※日局標準品の場合、USP-RSEは2000EU/mL10
最大有効希釈倍数の求め方
（日本薬局方の参考情報を参照して下さい。） 参考 最大有効希釈倍数（Maximum Valid Dilution, MVD）とは、反応促進又は反応阻害などの作用により、試料溶液で の試験ができない場合、許容範囲内で希釈した希釈試料溶液を調製することによって、エンドトキシン規格値の 測定ができる最大希釈倍数のことをいいます。 試料溶液濃度：エンドトキシン規格値濃度が重量あたり（EU/mg）で規定されている場合はmg/mL エンドトキシン規格値濃度が単位あたり（EU/unit）で規定されている場合はUnit/mL エンドトキシン規格値濃度が容量あたり（EU/mL）で規定されている場合は1.0mL/mL λ： ゲル化法の場合のライセート試薬の表示感度（EU/mL） 比濁法または比色法の場合の検量線の最小エンドトキシン濃度（EU/mL） λ： ゲル化法の場合はライセート試薬の表示感度（EU/mL） 比濁法または比色法の場合は検量線の最小エンドトキシン濃度（EU/mL） K： 静脈内投与で5.0EU/kg，脊髄腔内投与で 0.2EU/kg，静脈内投与の放射性医薬品で 2.5EU/kg，その他の投与経路で5.0EU/kg M： 体重kg 当たり1 時間以内に投与する最大量 注1）kg 当たりの最大ヒト投与量を算出するとき、平均ヒト体重としてUSPでは70kg、日局では60kgを用いる。 注 2）小児投与量が設定されている場合、その量が成人投与量より多いときは小児投与量に基づく。 ❷ MVD を求める。 ❶ まず最小有効濃度（Minimum Valid Concentration, MVC）を求める。1）医薬品各条でエンドトキシン規格値が規定されている場合
2）医薬品各条にエンドトキシン規格値が規定されていない場合
最大有効希釈倍数＝ （MVD） エンドトキシン規格値濃度×試料溶液濃度 λ MVC＝ λ・M K MVD ＝ 試料溶液濃度MVC エンドトキシン規格値＝ MKa 重量 /kg で投与する医薬品 製剤力価：20mg/mL 最大投与量 /kg：30mg/kg 試薬感度：0.0313EU/mL a エンドトキシン規格値が容量で表示されている場合 試 薬 感 度（λ）：0.0313EU/mL エンドトキシン規格値：0.5EU/mL b エンドトキシン規格値が重量で表示されている場合 製剤力価：20mg/mL（試料溶液濃度） 試薬感度：0.0313EU/mL エンドトキシン規格値：0.17EU/mg b 容量 /kg で投与する医薬品 最大投与量 /kg：10.00mL/kg 試薬感度：0.0313EU/mL
1）エンドトキシン規格値が規定されている場合
2）エンドトキシン規格値が規定されていない場合
MVC＝ MVD ＝ ＝ ＝ 0.1878mg/mL ＝106 0.0313EU/mL × 30mg/kg 5.0EU/kg 製剤力価（試料溶液濃度） MVC 20mg/mL 0.1878mg/mLMVD ＝ 0.5EU/mL × 1mL/mL0.0313EU/mL ＝16 MVD ＝ 0.17EU/mg × 20mg/mL ＝109 0.0313EU/mL MVC＝ MVD ＝ ＝ 0.0626mL/mL ＝16 0.0313EU/mL × 10.00mL/kg 5.0EU/kg 1mL/mL 0.0626mL/mL
最大有効希釈倍数算出例
12
三極薬局方比較表
参考 三極薬局方におけるエンドトキシン試験法光学的定量法 日本薬局方 エンドトキシン濃度 繰り返し数 判 定 検量線の信頼性確認 検量線 3 濃度以上 3 相関係数 r ≦－ 0.980 反応干渉因子試験 試料溶液又は希釈試料溶液 無添加 2 添加回収率 50 ～ 200％ 中点付近 2 定量試験 エンドトキシン試験用水（NC） （D 液） 2 ゲル化判定されない 検量線 3 濃度以上（C 液） 2 相関係数 r ≦－ 0.980 試料溶液又は希釈試料溶液 無添加（A 液） 2 エンドトキシン規格を満たす 中点付近（B 液） 2 添加回収率 50 ～ 200％FDA ガイドライン※（July 15, 1991 Interium Guidance を含む）
※2011年に廃止されました。（参考情報として掲載します。）
archived standard curve：
最低 3 日間続けて作成した検量線を回帰分析し、相関係数 r の絶対値が 0.980 以上であること（3 濃度，n ＝ 2） FDA エンドトキシン濃度 条件等 繰り返し数 判定 実験室の資格検定 標準曲線 3 濃度以上 3 相関係数 r ≦－ 0.980 力価検定 RSE による標準曲線 6 濃度以上 1.0 ～ 0.03EU/mL 2 CSE 4 バイアル 2 ゲル化時間が RSE の範囲内少なくとも 3 濃度に関する であること 阻害促進試験 標準曲線 3 濃度以上 最低濃度をλとする 2 相関係数 r ≦－ 0.980 製品または製品希釈液に よる標準曲線 3 濃度以上 最低濃度をλとする 2 相関係数 r ≦－ 0.980 －1.0 ＜傾き＜－ 0.1 製品または製品希釈液 無添加 2 内在エンドトキシンなし 75 ～ 125％ 4λ λ＜ 0.01EU/mL 以下の場合は注意 0.1 ～ 0.5EU/mL カットオフ値が1.0EU/mL 以下 内在エンドトキシンあり 50 ～ 150％ 1.0 ～ 5.0EU/mL カットオフ値が上記以外 日常試験 標準曲線 3 濃度以上 最低濃度をλとする 2 相関係数 r ≦－ 0.980 Archived standard curve mid-point 2 回収率 75 ～ 125％ 製品または製品希釈液 無添加 2 内在エンドトキシンなし 75 ～ 125％ 4λ λ＜ 0.01EU/mL 以下の場合は注意 0.1 ～ 0.5EU/mL カットオフ値が1.0EU/mL 以下 内在エンドトキシンあり 50 ～ 150％ 1.0 ～ 5.0EU/mL カットオフ値が上記以外
Es-Eapp プロット法について
参考 エンドトキシンの混入がない試料の入手が困難な場合、最大有効希釈倍数まで試料を希釈しても反応阻害又 は促進などの作用がある場合、Es - Eapp プロット法を使用すればエンドトキシンの混入量とエンドトキシン 試験に対する影響が同時に測定できます。 試料がエンドトキシンの濃度によらず一定の割合R というエンドトキシン活性出現率になるようにエンドトキ シン試験に影響を与えていると仮定すると、次式が成り立ちます。 Eapp：検量線をもとに求めた見かけのエンドトキシンの量 Ec：もともと試料に混入しているエンドトキシンの量 Es：添加したエンドトキシン量 検量線及びサンプルに検量線と同濃度のエンドトキシンを添加した溶液を調製する。 ●Standard：0.125，0.0625，0.0313，0.0156EU/mL ●Sample（エンドトキシン無添加） ●Sample（エンドトキシン添加）：0.125，0.0625，0.0313，0.0156EU/mL 各サンプルn ＝ 2 横軸を実際に添加したエンドトキシン量（Es）、縦軸を測定より算出されたエンドトキシン回収量（Eapp）として プロットします。 このとき実際に添加した量より算出されたエンドトキシン量が多い（促進傾向）場合直線の傾き（R）が1 より 大きくなり、添加量より算出量が少ない（阻害傾向）場合直線の傾きが1 より小さくなります。 実際にEs の値を求めたときのEapp との関係を、最小自乗法で求めると以下の回帰式が得られます。 局方などを参考にして50 ～200%を影響なしとするのであれば、R＞2.00のとき促進、R＜0.75のとき阻害と判断できます。 仮定が成り立つかどうかは 式で表される回帰式への実際のデ－タの適合性を検定することによって判断できます。 ❶ 式と❷式より、 ここでEapp ＝ R（Ec ＋ Es）
＝ R・Ec ＋ R・Es
Eapp ＝ a ＋ b × Es
a ＝ R × Ec
b ＝ R
R ＞ 1 のとき 促進
R ＝ 1 のとき 影響なし
R ＜ 1 のとき 阻害
測定方法 ❶ ❷ ❸14 グラフのy 切片がサンプルのエンドトキシン混入量となりますが、その値はサンプルの阻害又は促進の影響を受け ているため（❸式参照）、活性出現率（直線の傾き）で割ると実際のエンドトキシン混入量が算出されます。 Eapp ＝ 0.90 × Es ＋ 0.0035 エンドトキシン混入量＝ 0.0035 / 0.9 ＝ 0.0039 EU/mL Eapp ＝ 0.95 × Es － 0.001 エンドトキシン混入量＝－ 0.001 / 0.95 ≒ 0 Spiked endotoxin（EU/mL） Detected endotoxin（EU/mL） 0.15 0.10 0.05 0.00 0.00 0.05 0.10 0.15 Spiked endotoxin（EU/mL） Detected endotoxin（EU/mL） 0.15 0.10 0.05 0.00 0.00 0.05 0.10 0.15 クエン酸ナトリウム 0.25％ （pH 調整済み） 生理食塩水
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生物学的製剤中のエンドトキシン測定
参考 平成5 年10 月1 日付けの生物学的製剤基準の改正で、一般試験法に新たにエンドトキシン試験法が追加されまし た。エンドトキシン試験法では比濁時間分析法を用いた場合製剤の内在エンドトキシン量の算出に平行線定量法 を用いることが規定されています。 （現在エンドトキシン試験法が規定されているのは人血清アルブミン、加熱人血漿タンパク、インターフェロン製剤の一部） ● 2 つの用量反応直線が平行である場合 図で S1 がサンプル原液，S2 がサンプルの 4 倍希釈液であるとす る．この場合、S1 のエンドトキシン定量値（検量線からの計算値） が1.OEU/mL ならば、S2 の定量値はS1 の 4 分の1 の 0.25EU/mL になり、S2 を用いて求められるサンプル原液中のエンドトキシン 濃度は0.25EU/mL に希釈倍率 4を乗じた1.OEU/mL であり、S1 か ら求めた値と－致する。 ● 2 つの用量反応直線が平行でない場合 図で S1 がサンプル原液，S2 がサンプルの 4 倍希釈液であるとす る。この場合、S1 のエンドトキシン定量値（検量線からの計算値） が1.OEU/mL ならば、S2 の定量値はS1 の 4 分の1 の 0.25EU/mL になるはずだが、この図の場合 0.5EU/mLとなってしまう。よって、 S2 を用いて求められるサンプル原液中のエンドトキシン濃度は、 0.5EU/mL に希釈倍率 4 を乗じた2.OEU/mL となり、S1 から求め た値とずれてしまう。 一般的にはあるサンプルの内在エンドトキシンを定量するには検量線法が用いられています。この方法では標準品のエンドト キシンの各農度に対するゲル化時間をプロットし用量反応直線（検量線）を作成し、これに希釈サンプルによるゲル化時間を 当てはめ希釈サンプルのエンドトキシン量を求めます。そして、求められた希釈サンプル中のエンドトキシン量に希釈倍率を乗 じてサンプルの内在エンドトキシン定量値としています。 この方法には、エンドトキシン濃度の変化にともなうゲル化時間の変化はサンプルでも標準品でも同じ割合であり、サンプルを どんな希釈倍率（ただし、エンドトキシンの検出限界内）で定量しても求められるサンプル中のエンドトキシン定量値は同じに なる、という仮定が含まれています．これはすなわち、標準希釈系列の用量反応直線とサンプル中のエンドトキシン濃度によ る用量反応直線は平行であるということを暗黙的に認めていることに相当します。 しかし、生物学的製剤等では反応系によっては、前述の仮定が正しくないこともあります。2 つの用量反応直線が平行でない 場合、測定に用いたサンプルの希釈率によって、製剤の内在エンドトキシン量の計算値が大きく異なってしまうことになります。 平行線定量法は、標準品とサンプルのそれぞれの希釈系列による用量反応直線を作成し、統計的手法を用いて標準品とサン プルの用量反応直線の平行性を検定することによって、両用量反応直線が互いに平行である場合に、サンプル中の被検物質 （エンドトキシン）量を標準品に対する相対力価として定量する方法です。 平行線定量法とは Log（相対濃度） Log Log Tg 標準品 （検量線） 4 倍差 4 倍差 サンプル S2 S1 Log Log Tg 標準品 （検量線） 4 倍差 2 倍差 サンプル S2 S1 Log（相対濃度） Log Log Tg 標準品 （検量線） 4 倍差 4 倍差 サンプル S2 S1 Log（相対濃度） Log Log Tg 標準品 （検量線） 4 倍差 2 倍差 サンプル S2 S116
価格表
コードNo. 品名 感度（EU/mL） 容量 希望納入価格（円） ●ライセート試薬 298-22341 カブトガニ血球抽出物 J 0.25 50回用 18,000 294-22441 カブトガニ血球抽出物 HS-J 0.03 50回用 19,000 298-52511 カブトガニ血球抽出物 F 0.25 50回用 18,000 290-52711 カブトガニ血球抽出物 HS-F 0.03 50回用 19,000 292-51213 カブトガニ血球抽出物 ES-II 0.015 100回用 55,000 295-51801 カブトガニ血球抽出物ES-Ⅲ ― 100回用 55,000 291-25701 PYROSTAR™ ES-F without CSE 0.015 100回用 56,000 297-75301 PYROSTAR™ ES-F/Plate without CSE ― 200回用 64,000 ●マルチテストキット（ライセート試薬＋CSE） 290-21941 リムルス Jテストワコー 0.25 50回用 23,000 296-22141 リムルス HS-Jテストワコー 0.03 50回用 24,000 293-52701 リムルス HS-Fテストワコー 0.03 50回用 24,000 299-51201 リムルス ES-IIテストワコー 0.015 60回用 35,000 297-75801 PYROSTAR™ ES-F CSE 0.015 80回用 48,000 293-75401 PYROSTAR™ ES-F/Plate CSE ― 160回用 56,000 291-53101 リムルスカラー KYテストワコー ― 60回用 54,000 ●シングルテストキット（試験管入ライセート試薬＋CSE ※ただし、PSにはCSE添付無） 290-22041 リムルス Jシングルテストワコー 0.25 25回用 26,000 292-22241 リムルス HS-Jシングルテストワコー 0.03 25回用 30,000 297-52601 リムルス Fシングルテストワコー 0.25 25回用 26,000 299-52801 リムルス HS-Fシングルテストワコー 0.03 25回用 30,000 299-53401 リムルス HS-Tシングルテストワコー ― 25回用 30,000 295-51301 リムルス ES-IIシングルテストワコー 0.015 25回用 33,000 295-72301 PYROSTAR™ ES-Fシングル 0.015 25回用 39,000 291-53601 リムルスカラー KYシングルテストワコー ― 25回用 50,000 299-54501 リムルス PSシングルテストワコー ― 20回用 98,000 ●標準品 638-01021 日本薬局方エンドトキシン標準品 ― 照会 531-13371 USP 標準エンドトキシン 10,000units 照会 293-16541 CSE E.coli UKT-B株製 500ng 6,000 ●エンドトキシンフリー緩衝液 201-10421 0.1Mトリス塩酸緩衝液（ライセート試薬溶解用） pH7.3 at 30℃ 5mL×10 12,500 ●エンドトキシン検出用抽出液 293-51601 エンドトキシン検出用抽出液 20倍濃縮液 10mL×4 15,000 ●エンドトキシン試験用試験管 292-32751 リムルステストチューブ-Sアルミキャップ付 φ12×75mm 10本×8 16,000 293-26551 リムルステストチューブ-S φ12×75m 10本×10 12,000 293-28251 アルミキャップ-S φ14.7×18mm 10個×10 11,200 ●エンドトキシン試験用プレート 293-35211 バイオクリーンプレートワコー 96ウェル 50枚 30,000 ●エンドトキシンフリーチップ 294-35011 バイオクリーンチップ ワコー®エクステンドSⅡ 200 μL用 100本 6,000 291-35021 バイオクリーンチップ ワコー®200Ⅱ 200 μL用 100本 3,200 298-35031 バイオクリーンチップ ワコー®1000Ⅱ 1000 μL用 100本 3,20015200機01 本 社 〒540-8605 大阪市中央区道修町三丁目1番2号 TEL：06-6203-2759（機器システム部） 東 京 支 店 〒103-0023 東京都中央区日本橋本町二丁目4番1号 TEL：03-3270-8124（機器システム部） ●九 州 営 業 所 TEL：092-622-1005（代） ●中 国 営 業 所 TEL：082-285-6381（代） ●東 海 営 業 所 TEL：052-772-0788（代） ●藤 沢 営 業 所 TEL：0466-29-0251（代） ●筑 波 営 業 所 TEL：029-858-2278（代） ●東 北 営 業 所 TEL：022-222-3072（代） ●北海道営業所 TEL：011-271-0285（代） URL：www.wako-chem.co.jp/ お問い合わせ先：www.wako-chem.net/bms 機器お見積り：www.wako-chem.net/estimate/index.php
