Effect of adriamycin entrapped in liposomes conjugated with monoclonal antibody to the nasopharyngeal carcinoma cell line Madoka KANEKO* Antibody-secr

耳 鼻 33: 352∼365, 1987.

モ ノク ローナ ル抗体 結 合 リポ ソー ム を用 い る

上 咽頭 癌 にお ける ミサ イル療 法 の基 礎 的研 究

金

子

ま ど か*

Effect of adriamycin

entrapped

in liposomes conjugated

with monoclonal

antibody

to the nasopharyngeal

carcinoma

cell line

Madoka KANEKO*

Antibody-secreting hybridoma was generated by fusion of mouse myeloma cells with

mouse spleen cells immunized with nasopharyngeal carcinoma (NPC) cell line (NPC 204). Only

the monoclonal antibody 5-9 reacted to NPC cells in vitro, and in vivo accumurated to the NPC

204 tumor site, implanted into mice subcutaneously.

This monoclonal antibody against NPC

cells was conjugated to liposomes containing adriamycin (ADM). And the specificity and

antitumor effects of the conjugates were examined in vitro, using NPC 204 cells as the target

tumor. The antibody conjugated liposomes were selectively bound to NPC 204 cells. The

studies on the cytotoxicity with NPC 204 cells in vitro was clarified that the

antibody-conjugated liposomes containing ADM exerted the selective effects on NPC 204 cells in the

inhibition assay of the incorporation of 3H-thymidine.

Key words:上 咽 頭 癌,ミ サ イ ル 療 法,モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体,リ ポ ソ ー ム

は

じ

め

に

上咽 頭癌 は頭頸 部悪性 腫瘍 の なか で と りわ け予 後

の悪 い癌 であ る.多 くの文献 によれ ば,5年

生存 率

は25%前 後 とされて い る1).こ れ は リンパ 節 や遠 隔

臓 器 に転移 しや すい ためで あ るが,さ らにその背 景

として患者 の免疫 能が極 端 に低下 してい る ことが指

摘 されて い る.そ れ故上 咽頭 癌 の治療 に は従 来 か ら

の放射 線療 法 に加 え,積 極 的な化 学療 法や免 疫療 法

が必要 で あ る とされ てい る2).

悪性 腫瘍 の化学 療法 として,こ れ まで に数 多 くの

抗 癌剤 が臨床 に応 用 され て きた が,抗 癌 剤 に は副作

用 を伴 う とい う問題点 が ある.た だ で さえ低 下 して

い る免 疫能 を さ らに障 害す る ものが少 な くない.こ

の副 作 用 の た め徹 底 的 な化学 療 法 が 行 えな い こ と

は,臨 床上 よ く経験 す る ところであ る.

そ こで抗癌剤 を腫 瘍細胞 だ け に選 択的 に作用 させ

る 目的 で,動 注療法 をは じめ としてい くつか の局所

投 与 法 が 試 み られ て き た.そ の 代 表 は 浅 側 頭 動 脈 か ら細 い チ ュ ー ブ を 挿 入 し,逆 行 性 に 上 顎 動 脈 に抗 癌 剤 を注 入 す る 上 顎 癌 の 治 療 法 で あ る.し か し上 咽 頭 癌 の よ う に転 移 を き た し や す い 腫 瘍 で は,こ の よ う に 原 発 巣 だ け を 目 当 て と した 治 療 法 で は 十 分 で は な く,全 身 に拡 が る す べ て の 病 巣 を根 治 さ せ る も の で な けれ ば な ら な い.そ の た め に は薬 剤 が 的 確 に そ れ らの 部 位 に 到 達 し,十 分 薬 効 を 発 揮 す る こ とが 望 ま れ る. そ の構 想 の も と に モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の 腫 瘍 細 胞 認 識 能 を活 か し,こ れ に 化 学 療 法 剤 を 組 み 合 わ せ た, 免 疫 化 学 療 法,immuno-chemotherapyに 期 待 が か け られ る よ う に な つ た.い わ ゆ る ミサ イ ル 療 法 で あ る.こ れ に よ れ ば,少 量 の 化 学 療 法 剤 で,従 つ て 全 身 的 な 副 作 用 も な く,的 確 な 効 果 が 期 待 で き る.こ の 治 療 法 は着 想 と し て は 大 い に 期 待 が もた れ るが, 実 際 の 臨 床 に 応 用 す る に は,な お 多 くの 基 礎 的 検 討 を 重 ね な け れ ば な ら な い.

*横 浜市立大学医学部耳鼻咽喉科学教室

Department

of Oto-Rhino-Laryngology,

School of Medicine, Yokohama City University, Yokohama

232,

Japan

金 子=モ ノ ク ロー ナル 抗体 結 合 リポ ソーム を用 い る上咽 頭 癌 に お け る ミサ イル療 法 の 基礎 的研 究 353 著 者 は 前 記 の よ う に,免 疫 現 象 が 深 くか か わ つ て い る上 咽 頭 癌 を モ デ ル と し て,こ の こ との 基 礎 的 研 究 を 試 み 二 ・三 の 知 見 を 得 た の で そ の 結 果 を報 告 す る. 材 料 お よ び 方 法 上 咽 頭 癌 に 特 異 的 な モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 開 発 し,そ の 抗 体 を結 合 さ せ た薬 剤 キ ャ リ ア ー を作 製 し た.薬 剤 キ ャ リ ア ー に は,人 工 脂 質 膜 リポ ソ ー ム を 用 い た.リ ポ ソ ー ム は,生 体 膜 の 主 成 分 で あ る リ ン 脂 質 の2重 層 か らな る 小 胞 で,作 製 の 際,溶 液 中 の 物 質 を一 部 取 り込 む こ と か ら薬 剤 キ ャ リア ー と し て 応 用 され て き て い る.こ の リ ポ ソー ム に,抗 癌 剤 と し て ア ド リ ア マ イ シ ン(ADM)を 封 入 し,in vitro に お け る 上 咽 頭 癌 由 来 細 胞 へ の 付 着 お よ び 選 択 的 な 細 胞 傷 害 性 を検 討 し た. 1. 上 咽 頭 癌 細 胞 に 対 す る モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の 作 製 方 法 上 咽 頭 癌 細 胞 に対 す る モ ノ ク ロー ナ ル 抗 体 をKo-hlerとMilstein3)に よ つ て 導 入 され た 細 胞 融 合 に よ る方 法 に 準 じて 作 製 した. 上 咽 頭 癌(nasopharyngeal carcinoma, NPC)由 来 細 胞 株(NPC204)を 免 疫 源 と し た.抗P3HR-1 (Burkitt's lymphoma(BL)由 来 細 胞 株)で 免 疫 し た ウ サ ギ,お よ び 抗Raji(BL由 来 細 胞 株)で 免 疫 し た ウ サ ギ の 血 清 で,こ のNPC204細 胞 を37℃ で1 時 間 処 理 し,生 細 胞 の ま ま6週 齢 の 雌BALB/c nu/+マ ウ ス に 尾 静 脈 か ら静 注 し て 免 疫 した.2週 間 お き に 同 様 に細 胞 を 静 注 し,全 部 で3回 免 疫 し た (図1).最 終 的 な 免 疫 操 作 よ り3日 後 に 脾 細 胞 を 分 離 し,polyethylenglycol4000で マ ウ ス 骨 髄 腫 細 胞 NS-1と 融 合 さ せ,モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 産 生 ハ イ ブ リ ドー マ 細 胞 を得 た. 2. モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の 反 応 性 の 検 討 に 用 い た 培 養 細 胞 NPC由 来 細 胞 株 で あ るNPC204, NPC501,喉 頭 癌 由 来 細 胞 株KKK-831, KKK-832, BL由 来 株 P3HR-1, Raji, Ramos Nut, BJABや,伝 染 性 単 核 球 症(IM)リ ンパ 球 由 来 の8202, 8207,正 常 リ ン パ 球 由 来 のMT, KS,リ ンパ 球 性 白 血 病 由来 細 胞 株 JM, S-2, S-4,骨 髄 球 性 白 血 病 由 来 細 胞 株K-562, 肺 癌 由 来 細 胞 株PC-7,マ ー モ セ ッ ト リ ンパ 球 由 来 のB95-8の18種 の 細 胞 株 を用 い,モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 との 反 応 性 を調 べ た. 3. モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の 特 異 性 の 検 討 抗 体 の 特 異 性 の 検 討 に は,膜 免 疫 螢 光 抗 体 法 (membrane immunofluorescence: MIF)を 用 い た.細 胞 の 浮 遊 液 を1×105cells/mlに 調 整 した もの を1mlず つ 試 験 管 に と り遠 心 し て得 た 沈 澱 に,ハ イ ブ リ ドー マ の 培 養 上 清 を100μl加 え,37℃ 恒 温 槽 で 30分 間 反 応 させ た.そ の 後phosphate buffer saline (PBS)で 洗 浄 し,2次 抗 体 と してfluorescein isoth-iocianate(FITC)標 識 抗 マ ウ スIgG抗 体 を 用 い さ ら に37℃ で30分 間 反 応 さ せ,PBSで 再 度 洗 浄 した 細 胞 を 蛍 光 顕 微 鏡 で 観 察 した.ま た 各 種 培 養 細 胞 の 細 胞 内 成 分 と の 反 応 性 を み る た め,細 胞 を ス ラ イ ド グ ラ ス 上 に ア セ トン で10分 間 固 定 し た の ち,生 細 胞 と同 様 に1次 抗 体 を ハ イ ブ リ ドー マ 培 養 上 清 と し, FITC標 識 抗 マ ウ スIgG抗 体 を2次 抗 体 と した 間 接 蛍 光 抗 体 法 に よ り検 索 し た. 4. モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の 濃 縮 お よび 精 製 方 法 得 られ た モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を,以 下 の リ ポ ソー ム を 用 い る 実 験 の た め に濃 縮 し精 製 した. す な わ ちNPC204細 胞 の 細 胞 表 面 膜 抗 原 に 対 す る モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 産 生 ハ イ ブ リ ドー マ5-9株 を,5日 前 に プ リ ス タ ン処 理 した 成 熟BALB/cマ ウ ス の 腹 腔 内 に1×107ceils/mouseで 投 与 し,腹 腔 内 で 増 殖 さ せ,2週 間後 に腹 水 抗 体 を採 取 した.こ の 腹 水 抗 体 を50%飽 和 硫 酸 ア ン モ ニ ウ ム 塩 析 お よ び protein Aカ ラ ム に よ りIgG分 画 に 分 離 し,精 製 し た.

5. モ ノ ク ロー ナ ル 抗 体 を結 合 した 蛍 光 多 重 層 リ ポ ソー ム(multi-lamellar vesicle: MLV)の NPC204細 胞 へ の 付 着 の 方 法(表1).

(a) 蛍 光 リポ ソ ー ム の 作 製 方 法

Dipalmitoyl phosphatidyl choline(DPPC)40μ mol, cholesterol(Chol)20μmol, FITC結 合dipal-mitoyl phosphatidyl ethanolamine(FITC-DPPE) 0.4μmolとdithiopiridyl基 結 合dipalmitoyl phos-phatidyl ethanolamine(DTP-DPPE)1μmolを ク ロ ロ ホ ル ム に 溶 解 し た もの を ナ シ 型 フ ラ ス コ に と り,エ バ ポ レー タ ー で 減 圧 下 に溶 媒 を 除 き フ ラ ス コ に 脂 質 薄 膜 を作 製 し た.そ こへHEPES bufferを 加 え,vortex mixerで 懸 濁 さ せ 多 重 層 リポ ソ ー ム (MLV)を 作 製 し た. (b) リ ポ ソー ム 表 面 へ の モ ノ ク ロー ナ ル 抗 体 の 結 合 Lesermanら4)の 報 告 し たS-S結 合 架 橋 剤N

354 耳 鼻 と 臨 床 34巻 補 冊1号 図1 NPC-204細 胞 に よ るBALB/cマ ウ ス の 免 疫 図2 5-9抗 体 とNPC204細 胞 との 反 応 性(膜 免 疫 蛍光 抗 体 法) 図3 5-9抗 体 と10種 類 の 培 養 細 胞 の 可 溶 性 抗 原 と の 反 応 (免 疫 沈 降 法,SDS-polyacrylamide gel electrophoresis) 5-9抗 体 がNPC204, SPC501, P3HR-1の 72Kの _{抗 原 を 認 識 し て い る こ と が わ か る .} -succinimidyl-3-(2-pyridyldithio)propionate (SPDP)お よ びdithiothreitol(DTT)を 用 い る 方 法 に 準 じ て お こ な つ た.す な わ ち,DTT-DPPEを リ ポ ソ ー ム の 膜 の 組 成 に あ ら か じ め 組 み 込 ん で お き dithiopiridyl基 を も つ リ ポ ソ ー ム を 作 製 し て お く. 図4 5-9抗 体 の 担 癌 ヌー ドマ ウ ス に お け る腫 瘍 部 位 へ の 集 積 性 125Iで標 識 した5-9抗 体 が_{,腫 瘍 部 位 へ 集} 積 して い る像 が得 られ た, 図5 5-9抗 体 結 合 蛍 光 リ ポ ソー ム のNPC204 細胞 へ の 結 合 蛍 光 標 識 して あ る抗 体 結 合 リポ ソ ー ム を NPC204細 胞 と反 応 さ せ た後,洗 浄 に よ り 付 着 し なか つ た リポ ソ ー ム を除 い た もの. 細 胞 の 周 囲 に リポ ソー ム が 結 合 して い るの が 確 認 で き る. 一 方_{,抗 体 の ほ う もSPDPで 処 理 し た の ち還 元 さ せ} る こ と で-SH基 を 露 出 させ る.こ の 両 者 を 混 合 さ せ る こ と に よ つ て,S-S結 合 を 介 し て 抗 体 を リ ポ ソ ー ム 表 面 に 結 合 さ せ る 方 法 で あ る.結 合 し な か つ た 抗 体 は 遠 心 し て 取 り除 い た. (c) モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 結 合 リ ポ ソ ー ム のNPC 204細 胞 へ の 付 着 の 検 討 NPC204細 胞 浮 遊 液 と,モ ノ ク ロ ナ ー ル抗 体 結 合 リポ ソ ー ム お よ び 抗 体 非 結 合 リポ ソ ー ム と を,そ れ ぞ れ37℃ で30分 反 応 さ せ た の ち,PBSで 洗 浄 し, 蛍 光 顕 微 鏡 に て リ ポ ソ ー ム が 細 胞 に 付 着 し て い る の を 観 察 し た.

金 子=モ ノ ク ロー ナ ル抗 体結 合 リポ ソー ム を用 い る上 咽頭 癌 にお け る ミサ イル 療法 の 基礎 的 研 究 355 図6 5-9抗 体 結 合ADM封 入 リ ポ ソ ー ム (SUV)のNPC204細 胞 に及 ぼ す細 胞 増 殖 抑 制 効 果 表1 モ ノ ク ロナ ー ル抗 体 結合 蛍 光 リポ ソー ム の作 製 方 法 6. モ ノ ク ロー ナ ル 抗 体 結 合ADMを 封 入 し た 小 さ な 単 層 リ ポ ソー ム(small uni-lamellar vesicle: SUV)の 作 製(表2)

Egg yalk sack phosphatidyl cholin(eggPC)40 μmol, Chol20μmol, dipalmitoyl phosphatidic acid(DPPA)4μmol, DTP-DPPE1μmolで 脂 質 薄 膜 を作 つ た.こ こに500μlのADM溶 液(20mg/ml

in water)を 加 え,vortex mixerに てADMを 封 入 し たMLVリ ポ ソ ー ム 懸 濁 液 を作 つ た.こ のMLV リポ ソ ー ム 懸 濁 液 を プ ロ ー ブ 型 ソ ニ ゲ ー タ ー に て 10分 間 超 音 波 処 理 し,小 さ な 単 層 リ ポ ソー ムSUV を得 た.過 剰 のADMはSephadex G-50カ ラ ム に か け,HEPE Sbufferで 溶 出 し除 去 し た. こ のADM封 入 単 層 リポ ソ ー ム に,蛍 光 リ ポ ソー ム と 同 様 の 方 法 でSPDP-DTT処 理 を し た モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を結 合 さ せ た の ち,Sephadex 4-Bカ ラ ム を 用 い て 抗 体 結 合 リポ ソ ー ム と リ ポ ソ ー ム に 結 合 し な か つ た 遊 離 の 抗 体 を 分 離 し た. リ ポ ソ ー ム に 封 入 さ れ たADMの 定 量 は,リ ポ 表2 抗 体 結合ADM封 入 リポ ソー ム(SUV)の 作 製 方 法

356 耳 鼻 と 臨 床 34巻 補 冊1号 ソ ー ム を0.3NHC1-50%エ タ ノ ー ル で 処 理 し た の ち に,蛍 光 光 度 計(励 起 波 長490nm,吸 収 波 長590 nm)で 定 量 した. 7. モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 結 合ADMを 封 入 し た リポ ソー ム に よ るin vitroで の 細 胞 傷 害 性 の 検 討 NPC204細 胞 を5×105cells/mlと な る よ う に, RPMI-1640培 地 で 調 整 し た細 胞 浮 遊 液0.5mlを 無 菌 的 に3本 の 試 験 管 に と り,そ こ ヘ モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 結 合ADM封 入 リ ポ ソー ム,抗 体 非 結 合ADM 封 入 リポ ソ ー ム,遊 離 のADM溶 液0.5mlを そ れ ぞ れ 加 え,CO2イ ン キ ュ ベ ー タ ー 内 で37℃ で30分 間 反 応 さ せ た.ADMの 濃 度 は,お の お の0, 2.5, 5, 10, 20μg/mlと な る よ う に 調 整 し た. 反 応 終 了 後,細 胞 をRPMI-1640培 地 で 洗 浄 し た の ち,再 び細 胞 浮 遊 液 を5×105cells/mlと な る よ う に 調 整 し,96穴 マ イ ク ロ プ レー トへ200μl/well (5×104celis/wel1)ず つ 入 れ,各wellに3H-thymidineを1μCi加 え,さ らにCO2イ ン キ ュ ベ ー タ ー 内 で37℃,18時 間 反 応 させ た 後,細 胞 内 に取 り 込 ま れ た 放 射 能 活 性 を 液 体 シ ン チ レ ー シ ョ ン カ ウ ン タ ー で 測 定 し た. 結 果 1. 作 製 し た モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の 各 種 培 養 細 胞 との 反 応 性 の 検 討 上 咽 頭 癌 由 来 細 胞 株NPC204で 免 疫 した マ ウ ス の 脾 細 胞 を用 い て 得 られ た ハ イ ブ リ ドー マ 細 胞 の 培 養 上 清 中 の 抗 体 と,NPC204細 胞 と の 反 応 をMIF で 調 べ て ス ク リー ニ ン グ し,NPC204細 胞 と反 応 す る モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体5-9を 作 製 した.さ ら に これ らの モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 と各 種 培 養 細 胞 と の 反 応 を 検 討 し た と こ ろ,5-9抗 体 はNPC204, NPC501お よ びP3HR-1と の み 反 応 す る こ とが わ か つ た(表 3)(図2). 以 上 よ り,5-9抗 体 はNPC由 来 細 胞 と特 異 的 に 反 応 す る 抗 体 で あ る と い う可 能 性 が 示 唆 され た. こ の5-9抗 体 が 対 応 す る抗 原 を検 索 す る た め,10 種 類 の 培 養 細 胞 の 可 溶 性 抗 原(soluble antigen extract)と の 反 応 を,免 疫 沈 降 法 とSDS-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)

を用 い て 検 討 し た.そ の 結 果,5-9抗 体 がNPC204, NPC501お よ びP3HR-1の72Kの 抗 原 を 認 識 し て い る こ とが わ か つ た(図3). な お,radioimmunoassayで 調 べ た と こ ろ,5-9抗 表3 モ ノク ロー ナ ル抗 体 と各種 培 養 細胞 との反 応性(膜 免疫 蛍 光 抗 体 法) 体 の 免 疫 グ ロ ブ リ ン の サ ブ ク ラ ス は,IgG1で あ つ た. 2. 5-9抗 体 と各 種 培 養 細 胞 の 細 胞 内 成 分 との 反 応 性 の 検 討 5-9抗 体 と,EB virusゲ ノ ム 陽 性 細 胞NPC204, NPC501, P3HR-1, Raji, B95-8の 細 胞 内 成 分 との 反 応 性 を 間 接 蛍 光 抗 体 法 で 調 べ た.ス ラ イ ドグ ラ ス 上 に ア セ トン で10分 間 固 定 し た 各 種 培 養 細 胞 に,1 次 抗 体 と し て5-9抗 体 産 生 ハ イ ブ リ ドー マ 細 胞 を腹 水 化 した も の を10倍 お よ び1,000倍 希 釈 して 反 応 さ せ,そ の 後2次 抗 体 と し てFITC標 識 抗 マ ウ ス IgG抗 体 を用 い,螢 光 顕 微 鏡 で 観 察 し た と こ ろ,す べ 表4 5-9抗 体 と各 種 培 養細 胞 の細 胞 内成 分 との 反 応(間 接 蛍 光抗 体 法)

金子=モ ノク ロー ナ ル抗 体 結 合 リポ ソー ム を用 い る上 咽 頭癌 にお け る ミサ イ ル療 法 の基 礎 的研 究 357 て の 細 胞 で 反 応 性 が 認 め られ な か つ た(表4).こ の こ と か ら,5-9抗 体 はNPC由 来 細 胞 の 細 胞 内 成 分 と は 反 応 せ ず,細 胞 膜 表 面 に 存 在 す る抗 原 を認 識 して い る こ とが わ か つ た. 3. 5-9抗 体 の 担 癌 ヌ ー ド マ ウ ス に お け る腫 瘍 部 位 へ の 集 積 性 の 検 討 5-9抗 体 を125Iで 標 識 し た もの を,NPC205細 胞 を 移 植 し た 担 癌 ヌ ー ドマ ウ ス に,100μCi腹 腔 内 投 与 し た.72時 間 後 に 腫 瘍 イ メ ー ジ ン グ をお こ な つ た と こ ろ,抗 体 が 腫 瘍 部 位 へ 集 積 し て い る像 が 得 られ た(図4).こ の こ とか ら5-9抗 体 は,生 体 内 で も腫 瘍 へ の 集 積 性 を も つ こ とが 示 され た. 4. モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の 腹 水 化 に よ る 抗 体 の 濃 縮 5-9抗 体 産 生 ハ イ ブ リ ドー マ 細 胞 を マ ウ ス の 腹 腔 内 で 増 殖 さ せ 抗 体 を 濃 縮 し,NPC204細 胞 を は じ め

とす るEB virusゲ ノ ム 陽 性 細 胞 に対 す るMIF活 性 を測 定 し た.NPC204細 胞 に 対 す るMIF活 性 を 培 養 上 清 と腹 水 化 抗 体 とで 比 較 し た と こ ろ,5-9抗 体 産 生 ハ イ ブ リ ドー マ 細 胞 の 培 養 上 清 で は32倍 希 釈 ま でMIFが 陽 性 で あ つ た の に 対 し,腹 水 抗 体 で は5万 倍 ま でMIFの 活 性 が 認 め ら れ,腹 水 化 に よ り抗 体 の 濃 縮 が 高 率 に 起 こ る こ とが 確 か め られ た (表5). 5. モ ノ ク ロー ナ ル 抗 体 結 合 リ ポ ソ ー ム のNPC 204細 胞 へ の 付 着 の 検 討 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 結 合 リ ポ ソ ー ム のNPC204 細 胞 へ の 付 着 性 を確 か め る た め,NPC204細 胞 浮 遊 液 とモ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 結 合 蛍 光 リポ ソ ー ム また は 抗 体 非 結 合 蛍 光 リポ ソ ー ム を 反 応 さ せ,蛍 光 顕 微 鏡 で 観 察 し た.こ の 場 合,顕 微 鏡 下 に リ ポ ソー ム の 小 胞 を確 認 す る た め に 多 重 層 リ ポ ソー ン(MLV)を 用 い た.そ の 結 果,モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を結 合 さ せ た 蛍 光 リポ ソ ー ム がNPC204細 胞 の 周 囲 に 結 合 し て い る像 が 得 ら れ た が(図5),一 方 抗 体 非 結 合 蛍 光 リ ポ ソ ー ム を 反 応 さ せ た もの で は そ の よ う な 現 象 は み 表5 5-9抗 体産 生 ハ イ ブ リ ドー マ の培 養 上 清 お よ び腹 水 の抗 体 価(膜 免 疫 蛍光 抗 体 法) られ ず,リ ポ ソ ー ム に抗 体 を 結 合 させ る こ と に よ り, 標 的 細 胞 へ 付 着 す る こ とが 可 能 に な る こ とが 確 認 さ れ た. 6. モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 結 合ADMを 封 入 し た リ ポ ソー ム に よ る上 咽 頭 癌 由 来 細 胞 の 細 胞 傷 害 性 の in vitroで の 検 討 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 表 面 に 結 合 さ せ,ADMを 封 入 した 単 層 リポ ソ ー ム(Ab-ADM-SUV),抗 体 非 結 合ADM封 入 単 層 リポ ソ ー ム(ADM-SUV)お よ び 遊 離ADM(free ADM)を そ れ ぞ れNPC204培 養 細 胞 と30分 間 反 応 さ せ,細 胞 へ の3H-thymidine の 取 り込 み を測 定 す る こ と に よ り,モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 結 合ADM封 入 リ ポ ソ ー ム が 選 択 的 にNPC 204細 胞 の 増 殖 を障 害 す る こ と を検 討 し た.そ の 結 果,Ab-ADM-SUVはfree ADMと ほ ぼ 同 じ程 度 の 細 胞 増 殖 障 害 性 を 示 し た が,一 方ADM-SUVで は Ab-ADM-SUVやfree ADMと 比 較 す る と細 胞 傷 害 性 が 低 くな つ て い た(図6).と くにADM濃 度 が 2.5μg/ml, 5μg/mlの と き に はADM-SUVで は freeADMに 比 べ,約2分 の1の 細 胞 傷 害 性 しか 示 さ な か つ た.す な わ ち,Ab-ADM-SUVとADM-SUVと を比 較 す る と,リ ポ ソー ム に 抗 体 を結 合 さ せ る こ とに よ り,リ ポ ソー ム 内 のADMが よ り強 く細 胞 を傷 害 し た と い う結 果 が 得 られ た.こ の こ とか ら, 5-9抗 体 結 合 リ ポ ソ ー ム に 封 入 さ れ たADMが 選 択 的 にNPC204細 胞 を傷 害 す る可 能 性 が 示 さ れ た. 考 察 1. モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 に よ る 悪 性 腫 瘍 治 療 の 問 題 点 化 学 療 法 や 放 射 線 療 法 を 主 とす る悪 性 腫 瘍 の 治 療 に お け る大 き な 問 題 点 は,腫 瘍 細 胞 に対 す る 特 異 性 に 欠 け る た め,い き お い 大 量 投 与 を余 儀 な く され, 副 作 用 を伴 い が ち な こ と で あ る.化 学 療 法 で は,薬 剤 が 腫 瘍 細 胞 に 選 択 的 に 到 達 で きれ ば 理 想 的 で あ る.そ こ で 案 出 され た の が,腫 瘍 が 占拠 し て い る 部 位 の 支 配 動 脈 に薬 剤 を 注 入 す る い わ ゆ る動 注 療 法 で あ る.頭 頸 部 領 域 で は 上 顎 癌 で 浅 側 頭 動 脈 か ら カ テ ー テ ル を 挿 入 し,逆 行 性 に上 顎 動 脈 か ら腫 瘍 部 位 に薬 剤 を 到 達 さ せ る 方 法 が 広 く行 わ れ て い る.し か し この 方 法 で も健 常 細 胞 の 損 傷 は 避 け られ な い.こ の た め 薬 剤 に腫 瘍 選 択 性 を も た せ る い わ ゆ る ミサ イ ル 療 法 が 考 え 出 さ れ た.薬 剤 に 腫 瘍 選 択 性 を与 え る

358 耳 鼻 と 臨 床 34巻 補 冊1号 手 段 と し て腫 瘍 に 特 異 的 な モ ノ ク ロー ナ ル 抗 体 と結 合 させ る方 法 が 注 目 さ れ,著 者 もそ の 方 法 に よ り, 上 咽 頭 癌 を 対 象 と し て 基 礎 的 研 究 を試 み た. KohlerとMilsteinら3)に よ つ て 細 胞 融 合 法 に よ る モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の 作 製 が 開 発 さ れ,腫 瘍 抗 原 に対 す る モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の作 製 や 基 礎 的 実 験 を 経 て 臨 床 に 応 用 さ れ る よ う に な り,癌 の 診 断,治 療 に大 き な 役 割 り を果 た す よ う に な つ た. モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 単 独 投 与 の 臨 床 的 応 用 は,す で に 白血 病 や 悪 性 リ ンパ 腫 に試 み られ て い る.1980 年Nadlerら5)が,B-cellリ ンパ 腫 に 対 し て治 療 を 試 み た の を契 機 と して,Ritzら6)がNull-ALLに,

Millerら がT-cell白 血 病7)お よ び 皮 膚T-cellリ ン パ 腫6)を 治 療 した が,い ず れ も部 分 的 効 果 を認 め た の み で あ つ た.し か しMiller9)ら のB-cellリ ン パ 腫 の 抗 イ デ ィオ タ イ プ抗 体 に よ る 治 療 で は完 全 寛 解 状 態 を 得 る こ とが で き た と報 告 さ れ て い る. 他 方,メ ラ ノ ー マ 患 者 へ の モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の 直 接 投 与 に よ る 治 療 の 試 み が,Sobolら10),Oldahan ら11),Goodmanら12)に よ り行 わ れ た が,臨 床 効 果 は あ ま り認 め られ て い な い.そ の ほ かSearsら13)が 大 腸 癌 患 者 に モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 直 接 投 与 し,腫 瘍 の 増 殖 抑 制 効 果,肝 転 移 巣 の 縮 小 を認 め た と報 告 し て い る. これ らの モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の 治 療 実 験 上 の 問 題 点 と し て は,血 中遊 離 抗 原 とモ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 と が 結 合 し抗 体 が 中和 さ れ る と同 時 に,免 疫 複 合 体 が 形 成 さ れ 腎 臓 障 害 を き た す 可 能 性 が あ る とさ れ て い る が,こ れ まで の 臨 床 例 で は 重 篤 な 腎臓 障 害 は報 告 さ れ て い な い. も うひ とつ の 問 題 点 と し て,こ れ まで に作 製 さ れ て い る モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の 多 くが,マ ウ ス 型 免 疫 グ ロ ブ リ ンで あ るた め,投 与 後,体 内 に抗 マ ウ ス 抗 体 が 出 現 し,モ ノ ク ロー ナ ル 抗 体 の 作 用 を 抑 制 し た り,ア ナ フ ィ ラ キ シ ー 反 応 を ひ き起 こす 可 能 性 が あ る こ と で あ る.実 際 に は 担 癌 体 の 免 疫 能 の 低 下 も あ り,重 篤 な 副 作 用 が あ つ た と の 報 告 は み られ な い が, 連 続 投 与 や 大 量 投 与 の 際 に は 考 慮 さ れ る べ き 点 で あ る.こ の 問 題 点 を解 決 す る た め に,現 在 ヒ ト型 モ ノ ク ロー ナ ル 抗 体 の 開 発 が す す め ら れ,Shlomら14)が 乳 癌 に対 す る ヒ ト型 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を報 告 し て 以 来,数 多 くの 研 究 が な さ れ て い る.人 体 に 安 全 に 投 与 で き る ヒ ト型 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 大 量 に産 生 で き る よ う に な れ ば,臨 床 へ の 応 用 の 可 能 性 が 高 く な る もの と思 わ れ る. 一 方 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 と細 胞 傷 害 性 を持 つ 薬 剤 と を 結 合 させ る こ と に よ り,標 的 とす る臓 器 や 細 胞 に直 接 的 に し か も効 率 的 に送 り込 み,腫 瘍 細 胞 を選 択 的 に傷 害 す る い わ ゆ る ミサ イ ル 療 法 も モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の 開 発 が 進 む と と も に い くつ か 試 み られ て い る. 頭 頸 部 領 域 の 扁 平 上 皮 癌 に 対 す る モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 は,現 在 は まだ そ の 作 製 に 主 眼 が お か れ て い る 段 階 で あ る.Zerner15)の 喉 頭 癌 培 養 細 胞 を用 い た モ ノ ク ロ ー ナ ル抗 体 の 作 製 や,Careyら16)の 口腔 底 癌 の 培 養 細 胞 を 用 い た 実 験 な ど の マ ウ ス 型 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の 作 製 の 報 告,Pickeringら17)の 口 腔 癌 の 転 移 リ ンパ 節 の リ ンパ 球 を 用 い た ヒ ト型 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の 作 製,高 橋18)の 上 顎 癌 由 来 扁 平 上 皮 性 培 養 細 胞 に 対 す る モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の 作 製 な ど が あ る が,上 咽 頭 癌 由 来 細 胞 に 対 す る モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 に関 し て は い まだ 報 告 を み て い な い. 著 者 の 実 験 は,上 咽 頭 癌 由 来 培 養 細 胞 株NPC204 を 用 い,上 咽 頭 癌 細 胞 に 対 す る モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 5-9を 作 製 し,種 々 の 培 養 細 胞 と の 反 応 性 を 調 べ,そ の 特 異 性 を 明 らか に し た も の で あ る.ま た,NPC204 細 胞 を皮 下 へ 移 植 し た ヌ ー ドマ ウ ス の 実 験 で,1251 で 標 識 し た モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 が 腫 瘍 に集 積 した こ と か ら,こ の 抗 体 がin vivoに お い て も腫 瘍 に 特 異 性 を も つ こ と が 明 ら か に な つ た.ま た こ の モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を産 生 す る ハ イ ブ リ ドー マ を,マ ウ ス の 腹 腔 内 で 増 殖 さ せ る こ とに よ り抗 体 を 濃 縮 で き る こ とが 確 認 さ れ,モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 大 量 に産 生 さ せ る た め の 一 助 と な る可 能 性 が 示 され た.さ ら に こ の 抗 体 を用 い る 上 咽 頭 癌 の ミサ イ ル 療 法 に つ い て 検 討 し,in vitroに お け る 有 効 性 が 示 さ れ た. 2. モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の ミサ イ ル 療 法 へ の 利 用 モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を利 用 した ミサ イ ル 療 法 の 方 法 と し て は,毒 素 や 抗 癌 剤 の よ う な 細 胞 傷 害 性 を も つ 物 質 と抗 体 と を直 接 結 合 さ せ る 方 法 と,薬 剤 キ ャ リア ー を介 し て 結 合 させ る 方 法 とが あ る.毒 素 と抗 体 と を 直 接 結 合 させ る実 験 で は,ricinや ジ フ テ リ ア 毒 素 のA鎖 と モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 との 結 合 に よ る immuno-toxinを 用 い,in vitroお よ びin vivoで 良 好 な成 績 が 得 られ て い る が19)-21),immuno-toxinの 体 液 内 で の 安 定 性 や,代 謝 ・排 泄 の 機 構 が 不 明 な点 が あ り,毒 素 に よ る 生 体 の 傷 害 性 な どが 問 題 と な る た め,ヒ トへ の 直 接 投 与 は試 み られ て い な い.

金 子=モ ノク ロ ーナ ル抗 体 結 合 リポ ソ ーム を用 い る上 咽頭 癌 にお け る ミサ イル 療法 の 基礎 的 研 究 359 Krolicら22)は 白 血 病,悪 性 リ ンパ 腫 に お い て,寛 解 時 に 採 取 した 骨 髄 細 胞 を,自 家 移 植 す る過 程 で, 腫 瘍 細 胞 を除 去 す る際 に有 効 な 手 段 で あ る と報 告 し て い る.し か し頭 頸 部 領 域 の 悪 性 腫 瘍 の 治 療 に は 直 接 投 与 が 主 とな る た め,こ のimmuno-toxinの 臨 床 応 用 は 難 し い と思 わ れ る. そ こ で 安 全 性 や 副 作 用 が 詳 細 に確 認 され す で に 臨 床 に使 用 さ れ て い る化 学 療 法 剤 を モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 と結 合 させ て,治 療 に用 い る 方 法 が 注 目 され る よ う に な つ た.こ の よ うな 化 学 療 法 剤 とモ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 との 結 合 体 の 開 発 に よ り,使 用 す る薬 剤 の 量 を少 な く し,し た が つ て 副 作 用 を軽 減 し,か つ 治 療 効 果 を あ げ る こ とが 期 待 さ れ る.著 者 は 将 来 の 臨 床 へ の 応 用 を前 提 と し て,こ の 基 礎 的 研 究 を 行 つ た. 3. 薬 剤 キ ャ リ ア ー と し て の リポ ソ ー ム 薬 剤 キ ャ リ ア ー と し て 現 在 多 方 面 か ら注 目 を あ び て い る の が,人 工 脂 質 膜 小 胞 リ ポ ソ ー ム で あ る.リ ポ ソー ム の 応 用 範 囲 は き わ め て 広 く,生 体 膜 そ の も の の モ デ ル と し て の 物 理 的 研 究,膜 結 合 性 た ん ぱ く 質 の 再 構 成 実 験23),細 胞 間 相 互 作 用 の モ デ ル24),膜 に 作 用 す る 種 々 の 化 学 物 質 の 作 用 機 序 の 解 明25),免 疫 学 へ の 応 用26)な ど広 い 分 野 で 用 い られ,薬 剤 担 体 と し て の 生 体 へ の 応 用 に 関 し て も研 究27)-29)が す す め ら れ て い る. 人 工 脂 質2重 層 の 球 状 小 胞 の な か に,種 々 の 物 質 を封 入 し よ う とい う試 み はBanghamら30)に よ つ て始 め られ た.リ ポ ソ ー ム が 薬 剤 キ ャ リア ー と し て す ぐれ て い る理 由 と し て は,(1)細 胞 膜 の 構 成 成 分 で あ る 脂 質 を使 用 す る の で 毒 性 が 少 な い.(2)生 体 は 自己 の 細 胞 膜 を こわ す の と同 じ よ うな 方 法 で リポ ソ ー ム を 処 理 し う る.(3)容 易 に し か も大 量 に 作 製 し う る.(4)同 じ組 成 の も の を使 用 し同 じ条 件 で 作 製 す る こ とで,常 に 均 一 な 性 質 を 持 つ リポ ソ ー ム を 作 製 し う る と 同 時 に,構 成 す る脂 質 を 変 え た り,作 製 の 条 件 を 変 え る こ と で,大 き さや 表 面 の 荷 電 状 態 の 異 な る種 々 の リ ポ ソ ー ム を 作 製 し う る.(5)小 胞 内 に閉 じ込 め る だ け な の で,封 入 す る薬 剤 の 性 質 を 変 化 さ せ な い.(6)脂 質2重 層 で 外 界 か ら隔 離 さ れ て い る た め,血 液 中 の 酵 素 な ど に よ る破 壊 を 免 れ う る.(7)同 様 の 理 由 で 免 疫 機 構 に よ る薬 物 の 認 識 を 避 け う る.(8)リ ポ ソ ー ム の 種 類 に よ つ て は 細 胞 と 融 合 し う る し,ま た 貪 食 能 を もつ 細 胞 は リポ ソ ー ム 内 に封 入 し た 薬 剤 を有 効 に 細 胞 内 へ 取 り入 れ る こ と が 可 能 で あ る.(9)リ ポ ソ ー ム の 表 面 に 修 飾 を加 え る こ と に よ り,抗 体 な ど と結 合 させ る こ とが 可 能 で あ る,な どの 点 が あ げ ら れ て い る. さ ら に利 点 を追 加 す れ ば つ ぎの よ う な こ とが あ げ られ る.(1)リ ポ ソ ー ム に よ り薬 剤 を直 接 細 胞 内 へ 送 り込 め る な らば,従 来 細 胞 膜 を通 過 し得 な い た め に 利 用 さ れ な か つ た 抗 癌 剤 も,水 溶 性 で な い と い う こ とで 従 来 か え りみ られ な か つ た 薬 剤 も,効 果 を発 揮 で き る よ う に な る.(2)薬 剤 の 膜 透 過 性 を 変 え る こ とに よ つ て,薬 剤 耐 性 を獲 得 し た 癌 細 胞 へ も薬 剤 を効 果 的 に 送 り込 む こ とが 可 能 に な り,抗 癌 剤 の 選 択 範 囲 の 幅 を広 げ る こ とに な る,な ど の 点 で あ る. 4. 薬 剤 封 入 リポ ソ ー ム の 臨 床 へ の 応 用 以 上 の よ う な 利 点 か ら,リ ポ ソ ー ム に よ る 抗 癌 剤 の 封 入 は,薬 剤 キ ャ リ ア ー と して 期 待 さ れ,各 種 臓 器 の 癌 の 理 想 的 な 治 療 法 と して 意 欲 的 に 研 究 され て い る.用 い られ る 抗 癌 剤 は,メ ソ トレ キ セ ー ト31)32), ブ レオ マ イ シ ン33),ア ク チ ノ マ イ シ ンD34)35),Ara -C36)_{,ADM29)37)な ど で,動 物 で の 実 験 腫 瘍 の 系 で,} す で に 多 く試 み ら れ,効 果 が 認 め られ て い る. 著 者 の 実 験 で は,リ ポ ソ ー ム に 封 入 す る薬 剤 と し てADMを 用 い た.ADMは 抗 癌 剤 と し て 広 い ス ペ ク トラ ム を も ち,頭 頸 部 領 域 の 扁 平 上 皮 癌 に 有 効 な 薬 剤 と さ れ,現 在 広 く臨 床 例 に適 用 さ れ て い る.し か し,細 胞 膜 構 成 成 分 で あ る 脂 質,と く に カ ル ジ オ リ ピ ン を は じ め とす る陰 性 荷 電 の リ ン 脂 質 に 親 和 性 が 高 い た め,静 脈 内 投 与 で 心 臓 障 害 を起 こ しや す い. そ の た め に し ば し ば 投 与 を続 け られ な くな る 例 に 遭 遇 す る.し か し逆 に い え ば,細 胞 膜 との 親 和 性 が 高 い こ とか ら リポ ソ ー ム 膜 と の 親 和 性 も高 く,他 の 抗 癌 剤 と比 較 す る と リ ポ ソー ム 内 へ の 封 入 率 が 高 く, と く に陰 性 荷 電 の 単 層 リ ポ ソー ム で 顕 著 で あ る と さ れ て い る.ま た リポ ソ ー ム に 封 入 す る こ とに よ つ て, 心 臓 障 害 性 が 軽 減 した と い う報 告 も あ り38)―40),これ に よ つ て 応 用 価 値 が よ り高 くな る こ とが 期 待 さ れ る.ADMを 使 用 す る も う ひ と つ の 有 利 な 点 と して, こ れ が 蛍 光 を発 す るの で,蛍 光 光 度 計 で リポ ソ ー ム 内 に 封 入 され た 量 を簡 単 に測 定 す る こ とが で き る 点 が あ げ られ る. この 他 の 薬 剤 と し て シ ス プ ラ チ ン が 注 目 され,こ れ を封 入 した リポ ソー ム の 研 究 も す す め ら れ て い る41).こ れ は現 在 頭 頸 部 領 域 癌 の 治 療 に お い て 主 力 的 な 薬 剤 と な つ て い る も の で あ る.Freiseら42)は, リポ ソ ー ム に 封 入 す る こ と に よ つ て,シ ス プ ラ チ ン のdose limitting factorと され て い る 腎 障 害 を軽 減

360 耳 鼻 と 臨 床 34巻 補 冊1号 さ せ る こ とが で き る 可 能 性 を マ ウ ス で の 実 験 で 示 し て お り,今 後 臨 床 へ の 応 用 が 期 待 され る. 抗 癌 剤 封 入 リ ポ ソー ム の 治 療 効 果 を さ ら に 高 め る 試 み と して,Weinsteinら43)は メ ソ トレ キ セ ー トを 封 入 し た 温 度 感 受 性 リ ポ ソー ム を作 製 し,ま た 前 川 ら44)は,ブ レ オ マ イ シ ン封 入 温 度 感 受 性 の リポ ソ ー ム を ラ ッ トの腫 瘍 モ デ ル に 適 用 し,温 熱 療 法 と リポ ソ ー ム との 併 用 効 果 に つ き検 討 し,抗 癌 剤 の リ ンパ 節 集 中 と温 熱 療 法 との 相 乗 効 果 が 得 られ た と報 告 し て い る. さ ら に,熊 井 ら45)は 消 化 器 癌 の 肝 転 移 症 例 に ADM封 入 リポ ソ ー ム を肝 動 脈 に 注 入 し,重 篤 な 副 作 用 は 認 め ら れ ず,有 効 例 も あ つ た と報 告 し,今 後 臨 床 の 実 用 に耐 え る モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 が 完 成 した 際 に,ミ サ イ ル 療 法 に 役 立 つ 可 能 性 を 示 し て い る. しか し上 咽 頭 癌 患 者 に この リポ ソ ー ム を応 用 す る ま で に は,解 決 す べ き点 が い くつ か あ る.そ の ひ と つ は 抗 癌 剤 を封 入 し た リポ ソ ー ム を どの よ う に して 腫 瘍 組 織 に 到 達 させ るか とい う 問 題 で あ る.肝 臓, 脾 臓,リ ンパ 節 や 貪 食 能 を 有 す る癌 細 胞 で は,リ ポ ソ ー ム を 捕 捉 す る こ とが で き る が,こ れ 以 外 の 癌 の 場 合,肝 臓 や 脾 臓 に よ る貪 食 を逃 れ,い か に リ ポ ソー ム を 選 択 的 に癌 細 胞 へ 送 り込 む か が 問 題 で あ る.こ の た め リポ ソ ー ム の荷 電 を 変 え た り,小 さ い1枚 膜 の リポ ソ ー ム に か え て 貪 食 され に くい 形 に し た り, さ ま ざ ま な 工 夫 が な さ れ て い る.Hashimotoら35) の 報 告 の よ う に,細 胞 内 皮 系 に よ る捕 捉 を 防 ぐた め に,薬 剤 封 入 リポ ソ ー ム を 投 与 す る の に先 立 つ て あ ら か じ め 薬 剤 未 封 入 リ ポ ソー ム を投 与 す る こ とで 網 内 系 を ブ ロ ック す る 方 法 も そ の ひ とつ で あ る.し か し最 も期 待 さ れ る の は,強 力 な 腫 瘍 選 択 的 特 異 性 を もち か つ 臨 床 に 応 用 で き るモ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を開 発 し,リ ポ ソ ー ム と結 合 させ,リ ポ ソー ム に腫 瘍 特 異 性 を もた せ る方 法 で あ る. 5. リ ポ ソ ー ム へ の 抗 体 の 結 合 抗 体 を リポ ソー ム に結 合 さ せ る に は,抗 体 に 疎 水 性 の 物 質 を つ け る こ と で,リ ポ ソ ー ム の 膜 に挿 入 さ せ る方 法46),あ る い は,phosphatidylethanolamine (PE)と 抗 体 を グ ル タ ー ル で 架 橋 さ せ る 方 法47)な ど が 試 み られ て きた が,現 在 最 も有 効 な 方 法 と して 期 待 され て い る の は つ ぎ の2つ の 方 法 で あ る.ひ と つ はS-S結 合 を 介 し て 抗 体 と リ ポ ソ ー ム を 結 合 さ せ る 方 法 で あ る.す な わ ちPEに-SH基 と反 応 す る試 薬 を共 有 結 合 させ た も の を合 成 し,リ ポ ソー ム を作 製 す る と き に あ らか じ め膜 内 に 組 み 込 ん で お く.こ れ に抗 体 をSH化 し た もの,あ る い は抗 体 間 のS-S 結 合 を は ず し てSH化 し た も の を結 合 さ せ,S-S結 合 を 作 製 す る.こ の 際 の 架 橋 剤 と し てN-succin-imidy1-3-(2-pyridyldithio)propionate(SPDP)を 用 い た 方 法 が,Lesermannら4)お よびMartinら48) に よ つ て ほ ぼ 同 時 に報 告 され て い る.著 者 は こ の う ちLesermannら4)の 方 法 を用 い,抗 体 を 結 合 さ せ た. も うひ とつ の 方 法 は,リ ポ ソー ム 内 に あ らか じ め 糖 脂 質 を組 み 込 ん で お き,過 ヨ ウ素 酸 処 理 で 生 じ た ア ル デ ヒ ド基 と抗 体 と を 反 応 さ せ る 方 法 で あ る. Heathら49)は 糖 脂 質 と し て ガ ラ ク トセ レ ブ ロ シ ド や ガ ン グ リオ シ ドを用 い,過 ヨ ウ素 酸 塩 で2時 間 処 理 し,リ ポ ソ ー ム 表 面 を ア ル デ ヒ ド化 し,つ い で NaBH3CNな ど の 存 在 下 で 抗 体 と リ ポ ソー ム と を 結 合 さ せ た. こ の 二 つ の 方 法 は と も に リポ ソ ー ム 内封 入 物 質 に は 全 く影 響 を及 ぼ す こ と な く,効 率 よ く抗 体 を リポ ソー ム 表 面 に 結 合 さ せ る方 法 で あ る が,抗 体 結 合 部 位 が ラ ン ダ ム に な り,ひ とつ の リ ポ ソ ー ム に 結 合 す る 抗 体 の 数 に もば ら つ き が あ る こ と,お よ び 結 合 し た 抗 体 が す べ て有 効 で あ る か ど う か と い う点 で 問 題 が あ る.今 回 の 蛍 光 リ ポ ソー ム を細 胞 に付 着 させ た 実 験 で も,必 ず し も す べ て の 抗 体 結 合 リポ ソ ー ム が 標 的 細 胞 に効 率 よ く付 着 した わ け で は な か つ た.結 合 す る 抗 体 の 数,安 定 性,有 効 性 に つ い て は今 後 さ ら に改 善 が 望 ま れ る. 6. モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を利 用 し た 薬 剤 封 入 リポ ソ ー ム に よ る ミサ イ ル 療 法 の 試 み 現 在 臨 床 応 用 が 可 能 な モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 用 い る リポ ソ ー ム の ミサ イ ル 療 法 は まだ 実 現 に 至 つ て い な い が,細 胞 実 験 や 動 物 実 験 で は モ ノ ク ロー ナ ル 抗 体 と結 合 させ た 抗 癌 剤 封 入 リ ポ ソ ー ム の 選 択 的 腫 瘍 効 果 の 試 み が な さ れ,有 効 性 が 認 め られ て い る.す で にLesermanら50)-52)は マ ウ ス のH-2抗 原 やIa 抗 原 に 対 す る モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体,さ ら に ヒ ト β2 -マ イ ク ロ グ ロ ブ リ ン に 対 す る 抗 体 結 合 リポ ソ ー ム をSPDP法 で 作 製 し,リ ポ ソ ー ム 封 入 薬 剤 が 選 択 的 に抗 原 陽 性 細 胞 の み を 抑 制 で き る か を,基 礎 的 な 実 験 に 基 づ い て 確 か め,さ ら に ヒ ト白 血 病 細 胞 へ の 応 用 も報 告 し て い る. Hashimotoら35)は,マ ウ ス の 乳 癌 の 系 で,ア ク チ ノ マ イ シ ンD封 入 抗 体 結 合 リポ ソ ー ム に よ る 治 療 効

金子=モ ノ クロ ーナ ル抗 体 結 合 リポ ソー ム を用 い る上 咽 頭癌 にお ける ミサ イ ル療 法 の基 礎 的研 究 361

果 を,in vitroお よ びin vivoで 示 し て い る.ま た 多 田 隈 ら29)は α-fetoprotein(AFP)陽 性 ヒ ト肝 癌 細 胞 を 用 い,ADM封 入 抗 体 結 合 リ ポ ソ ー ム の 抗 腫 瘍 効 果 をin vitroな ら び にin vivoで 検 討 し,抗 体 結 合 リポ ソ ー ム が 抗 体 非 結 合 リ ポ ソ ー ム に比 べ て 高 い 治 療 効 果 を 示 す こ と を 報 告 し て い る.さ ら に Onumaら53)は ウ シ 白 血 病 細 胞 の 腫 瘍 関 連 抗 原 に 対 す る モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 と結 合 さ せ たADM封 入 リポ ソ ー ム に よ る 抗 腫 瘍 効 果 をin vitroとin vivo で 示 し て い る. 著 者 の 上 咽 頭 癌 由 来 細 胞 を 用 い た 実 験 に お い て も,ヌ ー ドマ ウ ス に移 植 し た腫 瘍 へ の モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の 集 積 が 認 め ら れ て お り,こ の 抗 体 を リ ポ ソ ー ム に結 合 さ せ てin vivoへ 利 用 で き る こ とが 示 唆 さ れ た. モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 結 合 リポ ソ ー ム が よ り有 効 な 治 療 手 段 と し て 実 用 化 さ れ る に は,ま だ まだ 検 討 ・ 改 良 す べ き点 が 多 い.安 定 な リポ ソ ー ム 内 に で き る だ け大 量 の 薬 剤 を封 入 し,運 搬 し う る か とい う こ と も重 要 な 因 子 で あ る.リ ポ ソー ム をin vivoに 投 与 す る と,フ ォ ス フ ォ リパ ー ゼ な どの 破 壊 酵 素 や,血 清 蛋 白 の付 着,血 中 の 脂 質 と の 入 れ 換 え な ど の 影 響 を う け,長 時 間 安 定 性 を 保 つ こ と は で き な い. Gregoriadisら54)は リ ン脂 質 に 対 して 混 合 す る コ レ ス テ ロ ー ル の 量 が リ ポ ソ ー ム の 安 定 の た め に 非 常 に 重 要 な 因 子 で あ り,こ れ の 混 合 比 を 増 す と安 定 性 も 増 す とい う成 績 を 示 して い る. つ ぎ に リポ ソ ー ム の な か に い か に し て 効 率 よ く薬 剤 を 封 入 し,そ れ を長 期 間 保 持 さ せ る か が 問 題 に な る.と くに低 分 子 の 薬 剤 の 場 合,薬 剤 が 次 第 に漏 出 す る こ と は 避 け ら れ な い.こ れ を 避 け る た め に polyglutamic acidやDNAを 結 合 させ て 封 入 す る 工 夫 もな さ れ て い る55). リポ ソ ー ム に 封 入 さ れ や す い 薬 剤 を 選 択 す る こ と も重 要 で あ る.た と え ば 多 田 隈 ら28)はADMの ほ う が マ イ トマ イ シ ン(MMC)よ り も脂 質 親 和 性 が 高 く,リ ポ ソー ム 内 封 入 率 が 高 い と し て い る.ま た 疎 水 性 の 薬 剤 は脂 質 と結 合 す るた め,リ ポ ソー ム の 膜 そ の も の に 組 み 込 む こ とが 可 能 な た め,封 入 率 が 高 くか つ リポ ソ ー ム 内 に 長 く と ど ま る こ とが で き る と され て い る.こ の 点 か ら疎 水 性 あ る い は 脂 質 と親 和 性 を も つ 抗 癌 剤 も将 来 有 望 と な つ て くる で あ ろ う. 一 般 に 荷 電 さ れ た リ ポ ソー ム の ほ う が 膜 と膜 との 間 に 電 気 的 な 反 発 が あ る た め 内 腔 が 広 く な り,封 入 量 が 多 くな る と い わ れ て い る.ま たSUVで は封 入 量 が 非 常 に 少 な い の で,SUVよ り大 きな 一 枚 膜 リ ポ ソー ム(large unilamellar vesicle: LUV)を 用 い る必 要 性 が で て くる と考 え ら れ る.LUVは 現 在 の と こ ろ で は 作 製 法 が 複 雑 で あ る が,単 位 脂 質 あ た り の 保 持 容 量 が 大 き く,保 持 効 率 も よ く,高 分 子 も保 持 で き る こ と か ら,こ れ か ら応 用 面 の 研 究 が 盛 ん に な る もの と思 わ れ る. 著 者 の 実 験 で 細 胞 傷 害 性 を検 討 す る の に 用 い た リ ポ ソ ー ム は,膜 の 組 成 と して コ レ ス テ ロ ー ル を ふ く ませ て 膜 の 安 定 性 を は か り,他 方phosphatidicacid (PA)を 用 い て 負 の 荷 電 を与 え て 薬 剤 封 入 率 を 高 め たSUVを 用 い た.以 上 の こ と か ら今 後 こ の 治 療 法 を臨 床 に応 用 す る に あ た り,リ ポ ソ ー ム の 種 類 と組 成 の 選 択 を廻 り,さ ら に改 良 が 加 え られ な け れ ば な ら な い と考 え る. 以 上 の 問 題 点 が そ れ ぞ れ 克 服 で き,薬 剤 を封 入 し た リポ ソ ー ム を 有 効 に標 的 細 胞 に 到 達 で き た と し て リポ ソ ー ム 内 に 封 入 さ れ た 薬 剤 を い か に 効 率 良 く癌 細 胞 内 へ 移 行 させ る か が 問 題 点 と して 残 る.貪 食 能 が な い 細 胞 の場 合,膜 流 動 性 の 高 い 脂 質 を用 い た リ ポ ソー ム で は細 胞 膜 と融 合 す る こ と に よ り,逆 に膜 流 動 性 の 低 い リポ ソ ー ム で は 細 胞 に エ ン ドサ イ トー シ ス さ れ る こ と に よ つ て 細 胞 内 に 入 る と さ れ て い る が,こ の 点 は ま だ 必 ず し も確 か に は さ れ て い な い. リポ ソ ー ム と細 胞 との 相 互 作 用 お よ び 血 清 の 影 響 に 関 し て,多 田 隈 ら27)は 蛍 光 色 素 で あ る carboxyfluorescein(CF)を 封 入 し た リポ ソー ム を 用 い て 検 討 し て い る.そ の 結 果,リ ポ ソ ー ム 内 に 封 入 し たCFは,in vitroで 血 清 の 非 存 在 下 で は効 率 良 く細 胞 内 へ 移 行 し た が,血 清 の 濃 度 を あ げ て い く に つ れ て 移 行 が 抑 制 され た こ と を示 して い る.し た が つ てin vivoの 血 清 の 存 在 下 で の 細 胞 と リポ ソー ム の 融 合 に は,血 清 の 影 響 を取 り除 く工 夫 な ど,さ ら に詳 細 な 検 討 が 必 要 で あ る. 抗 体 結 合 リポ ソ ー ム は,抗 体 を介 し て標 的 細 胞 の 細 胞 膜 と結 合 した の ち,膜 と膜 との 相 互 作 用 に よ り 薬 剤 が 細 胞 へ 移 行 す るが,そ の 移 行 率 が 抗 体 が な い 場 合 と比 較 し て 高 くな る こ とが 予 想 さ れ て い る.著 者 のin vitroに お け る細 胞 傷 害 性 試 験 で も,抗 体 を 結 合 させ た 抗 癌 剤 入 り リ ポ ソー ム の 方 が 抗 体 を結 合 さ せ な い リポ ソ ー ム に比 べ て,明 らか に 高 い細 胞 傷 害 性 を示 し て い た.し か し リ ポ ソ ー ム に 封 入 され た 薬 剤 が 細 胞 に 移 行 す る機 序 に 関 す る基 礎 的 検 討 は ま

362 耳 鼻 と 臨 床 34巻 補冊1号 だ ほ と ん ど な され て い な い の が 現 状 で あ る. また リポ ソ ー ム 膜 に融 合 装 置 を組 み 込 ん で 融 合 能 を 高 め よ う とす る試 み がin vitroで は す で に な さ れ て お り,グ リセ ロ ー ル,ポ リエ チ レ ン グ リ コー ル 処 理 を行 つ た り56),セ ン ダ イ ウ イ ル ス(HVJ)のF蛋 白 を組 み 込 む 方 法57)も 試 み ら れ て い る が,in vivo に も応 用 で き る よ り普 遍 的 な 手 段 が 明 らか と な れ ば,ミ サ イ ル 療 法 の 臨 床 的 応 用 に む け て よ り強 力 に 進 む こ とに な る で あ ろ う. 8. 上 咽 頭 癌 ミサ イ ル 療 法 の 可 能 性 悪 性 腫 瘍 に対 す る モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 と そ れ を利 用 した ミサ イ ル 療 法 の 開 発 を め ざ して 現 在 各 分 野 で 研 究 が 進 め ら れ て い る.著 者 の 上 咽 頭 癌 由 来 細 胞 に 対 す る モ ノ ク ロー ナ ル 抗 体 結 合 抗 癌 剤 封 入 リポ ソ ー ム の 細 胞 傷 害 性 の 検 討 はin vitroの 段 階 で は あ る が,そ の 特 異 性 が 確 認 さ れ,臨 床 へ の応 用 が 期 待 さ れ る こ と を明 ら か に し た. 上 咽 頭 癌 は リ ンパ 節 お よ び 全 身 諸 臓 器 に転 移 しや す く,頭 頸 部 癌 の な か で 最 も予 後 の 悪 い 癌 で あ る. そ の理 由 と し て 患 者 の 免 疫 動 態 の 極 端 な低 下 が 把 握 され て い る.治 療 成 績 を 向 上 さ せ る た め に は,従 来 の 放 射 線 照 射 に よ る局 所 療 法 だ けで は 不 十 分 な こ と は い う ま で も な い.そ れ だ け に 全 身 的 治 療 が 不 可 欠 で,化 学 療 法 お よ び 免 疫 療 法 に 期 待 が か け ら れ る. 化 学 療 法 に つ い て い え ば 矢 継 ぎ ば や に 新 しい 製 剤 が 開 発 さ れ,あ る程 度 有 効 性 が 認 め ら れ て い る もの の,こ れ の み で 上 咽 頭 癌 を根 治 さ せ る こ とが で き る もの は未 だ 出 現 し て い な い.化 学 療 法 に よ つ て 効 果 を発 揮 す る た め に は 大 量 投 与 を必 要 と し,い き お い 各 種 の 副 作 用 を 招 きが ち で あ る.一 方,た だ で さ え 低 下 し て い る 免 疫 能 を さ ら に抑 制 す る恐 れ が あ る. 免 疫 療 法 と し て現 在 行 わ れ て い る の は,各 種 の 多 糖 類 そ の 他 に よ る非 特 異 的 免 疫 療 法 で,詳 し い 検 定 の 結 果,生 物 活 性 体biological response modifier と し て認 め られ,多 数 例 の 検 定 で 有 用 で あ つ た との 報 告58)-61)は あ る もの の,未 だ 理 想 的 な 製 剤 は 得 ら れ て い な い.た と え ば上 咽 頭 癌 の 可 溶 性 膜 抗 原 な ど を素 材 と した,特 異 的 免 疫 療 法 に 出 現 が 望 まれ る. こ の よ う な 状 況 の も と で,少 量 の 抗 癌 剤 を リ ポ ソー ム に封 入 し,モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 の 上 咽 頭 癌 細 胞 の 認 識 能 を応 用 し,腫 瘍 細 胞 が 全 身 の ど こ に存 在 し て い て も,つ ま り原 発 巣 お よ び 転 移 巣 の す べ て を 目標 と し て 確 実 に そ こ に到 達 さ せ る こ とが で き る, い わ ゆ る ミサ イ ル 療 法 は,こ の癌 の 治 療 法 と して 理 想 的 な もの とい え る.著 者 は そ の 可 能 性 を 目指 し, in vitroの 実 験 を試 み た.そ し てin vitroの 実 験 に 関 す る 限 りそ の 可 能 性 を把 握 す る こ とが で き た.こ の 治 療 法 を 臨 床 に 応 用 す る に は 克 服 し な けれ ば な ら な い い くつ か の 課 題 が 伏 在 し て い る.そ の こ と に つ い て も考 察 を加 えた.著 者 の 実 験 が 上 咽 頭 癌 の よ り 理 想 的 な 治 療 と し て 実 用 化 さ れ,こ の 癌 の 治 療 成 績 を飛 躍 的 に 向 上 させ る き つ か け に な れ ば と願 つ て い る. ま と め 頭 頸 部 癌 の な か で 予 後 の 最 も悪 い 上 咽 頭 癌 の 理 想 的 な 治 療 法 を 案 出 す る た め,免 疫 療 法 と化 学 療 法 と を有 機 的 に結 合 さ せ た い わ ゆ る ミサ イ ル 療 法 の 開 発 を 目指 して 基 礎 的 実 験 を試 み,つ ぎ の 結 論 を得 た. 1. 上 咽 頭 癌 由 来 細 胞NPC204を 免 疫 源 と し て, マ ウ ス ― マ ウ ス融 合 細 胞 に よ る モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 を 作 製 し,種 々 の 細 胞 との 反 応 性 を 調 べ た 結 果, NPC由 来 細 胞 に特 異 的 に 反 応 す る モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体5-9を 得 た. 2. NPC204細 胞 を 移 植 し た ヌ ー ドマ ウ ス に,ア イ ソ トー プ で 標 識 し た5-9抗 体 を投 与 し,腫 瘍 へ の 集 積 が 認 め られ,こ の 抗 体 がin vivoで 腫 瘍 特 異 性 を も つ こ とを 明 らか に し た. 3. 5-9抗 体 を 薬 剤 キ ャ リア ー と して の リ ポ ソー ム に 結 合 させ,NPC204細 胞 に特 異 的 に付 着 さ せ る こ と を確 か め た. 4. 抗 癌 剤ADMを 封 入 し た リ ポ ソ ー ム に5-9 抗 体 を結 合 さ せ,in vitroに お け る細 胞 傷 害 性 を検 討 した と こ ろ,抗 体 を結 合 し な い 場 合 に比 べ て 高 い 細 胞 傷 害 性 が 認 め られ,理 想 的 な 免 疫 化 学 療 法 い わ ゆ る ミサ イ ル 療 法 の 臨 床 へ の 応 用 の 可 能 性 が 示 唆 さ れ た. 稿 を終 え る に あ た り,御 指 導,御 校 閲 を 賜 り ま した 澤 木 修 二 教 授 に深 甚 な る感 謝 の 意 を 表 し ま す.ま た 実 験 の機 会 を 与 え 手 法 に つ い て 御 指 導 い た だ い き ま し た 東 京 大 学 医 科 学 研 究 所 川 村 明 義 名 誉 教 授 お よ び 保 田 立 二 助 教 授 ほ か の 諸 先 生,神 奈 川 県 立 が ん セ ン タ ー 頭 頸 科 佃 守 博 士, 日 水 製 薬 株 式 会 社 岩 瀬 昇 さ ん に 感 謝 い た し ま す.最 後 に さ ま ざ ま な 面 で 御 協 力 い た だ き ま し た横 浜 市 立 大 学 医 学 部 耳 鼻 咽 喉 科 学 教 室 員 各 位 に 感 謝 い た し ま す. 本 論 文 の 要 旨 は1985年5月,第86回 日本 耳 鼻 咽 喉 科 学 会 総 会,お よ び 同 年10月,第4回 日

金子=モ ノ クロ ー ナル 抗体 結 合 リポ ソー ム を用 い る上 咽 頭 癌 に お け る ミサ イ ル療 法 の基 礎 的研 究 363 本 癌 学 会 に お い て 報 告 した. 本 論 文 の 一 部 は1983年 度 文 部 省 科 学 研 究 費 (一 般 研 究(C)課 題 番 号58570719)に よ つ た. 文 献 1) 澤木 修 二: 上咽 頭 癌 の 基礎 と臨 床. 宿 題 報 告 モ ノ グ ラ フ. 1978. 2) 澤 木 修 二 他: 上 咽 頭 癌 の 診 断 と治 療. 耳 鼻 臨 床 80: 173-186, 1987.

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