学位論文題名 ●Adrenomedullin antagonist suppresses in vivo growth of human pancreatic cancer cells in SCID mice by suppresslngang10geneSlS

博 士 （ 医 学 ） 石 川 隆 久

     学位論文題名      ●

Adrenomedullin antagonist suppresses in vivo growth     of human pancreatic cancer cells in SCID mice     by suppresslngang10geneSlS

(Adrenomedullin antagonist は血管新生抑制を介して SCID mice におけるヒト膵癌細胞の増殖を抑制する）

学位論文内容の要旨

【背景・目的】

  膵 癌は難 治陸癌 のひと つであ り、摘 出手術 可能例で も5年生 存率は20％前後であり、

手 術 不 能 症例 では 化学療 法も放射 線も効 果はな く、1年 生存率 でさえ5％前後 である 。 こ のよう な難治 陸癌に 対する 新たな治 療法を 確立することは旧来の発想や考え方では困 難 であり 、新た な発想 にて膵 癌の病因 ・病態 に対するより詳細な分子生物学的理解をす る 必 要 が ある 。 最 近 、小 林 ら は 膵癌 細 胞株の 大部分(750/0)がHIF‑1a蛋 白を恒 常的に 発 現して いるこ と、恒 常的に 発現して いる膵 癌細胞がアポトーシスにより抵抗性である こ とを報 告した 。この 報告は 低酸素適 応応答 が膵癌細胞の生存にとって重要な働きをし て いるこ とを示 唆して いる。 さらに、 彼らの グループより低酸素下で発現亢進する遺伝 子としてautocrine motility factorカ潮告された。この報告のなかで、低酸素誘導遺伝子と し て 同 定 さ れ た38個 の 遺 伝 子 の ひ と っ がAdrenomedullin（ 以 下AM)で あ っ た 。AM は1993年に、pheochromocytoma由 来の血 管拡張 因子として幸睦告され、昂逝では血篭拡 張以外にもgjowth factor．survival factorとして働くことが報告されている。これらの報 告 か ら 、 低酸 素 下 で 発現 亢 進 す るAMが 血 管拡 張 や 血 管新 生 を 増強し て膵癌 細胞の 増 殖 に 有 利 に働 く 可 能 性カ 坪 想 さ れま た 逆にAdrenomedullin antagonist（ 以下AMA)が 血 管新生阻害や血管拡張阻害を介して膵癌細胞の増殖を抑制する可能陸カミ考えられる。

  以 上 の仮 説 に 基 づい て 、 本 研究 で は ま ず膵 癌 細 胞 を含 め て 各種癌 細胞株 でのAM発 現 を 正 常 酸素 分 圧 下 、低 酸 素 分 圧下 で 検 討 した 。 次 い でAMAの 膵癌細 胞の血vitro増 殖 お よ びin vivo増殖に 対する効 果につ いて検 討した 。さら に、AMAの 抗腫瘍 効果の メ カ ニ ズ ム を明 ら か に する た め にAMA投 与 後の膵癌 腫瘍組 織にお ける増 殖細胞 の比率 と 腫瘍血管数について検討した。

【方法および結果】

＠ 膵 癌 細 胞 株 を 正 常 酸 素 分 圧 下 と 低酸 素 分 圧 下で 培 養 後RNAを 抽 出 し 、AM mRNA．   発 現 をNorthern blot法 に て検 尉 し 、AMreceptorくCRLR，RAMP2) mRNAをRT‑PCR法   に て検 討 し た 。そ の 結 果 膵癌 細 胞 株 全て に お い て低 酸 素 分 圧下 で のAM mRNA発 現   の 増 強を 認 めた。AMreceptorは一 部の膵 癌細胞 株にの み発現 しており 、発現 量も少   ないと判断された。

◎心瓜1・25）とAMA（AM（22152・））のめ伽rDでの膵癌細胞増殖に対する効果を比較検討   し た 。AMreceptorの 発現カ ミ認め られた 脾垢湘 脆蛛を 用いてMTSassayにて増 殖に与

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  え る 効 果 を 検 討 し た 。 そ の 結 果AMとAMAの い ず れ も 、2種 類 の 膵 癌 細胞 株 の 増   殖に対してなんらの効果も与えなかった。

◎AM(1‑25)とAMA(AM(22‑52))のin vivoで の 膵 癌細 胞 増 殖 に対 す る 効 果を 比較検 討   し た 。 膵腫 瘍 はSaD miceに ヒ ト膵 癌 細 胞 株(P0‑43)を 皮 下 移 植し て 作 成し、AMと   AMAは50M g／mouSeを10日 間 連 続 で 腫 瘍 内 注 入 に て 投 与 し た と こ ろAMA投 与に   て増殖してきた腫瘍の完全退縮を認めた。

＠AMAの 抗 腫 瘍 効 果 の 機 序 を 明 ら か に す る た め に 、3日 お き に4回AMも し く は   AMAを 投 与 す る 実 験 系 を検 討 し た とこ ろ 、AMA投与 群 で 約 半分 に 腫 瘍 重量 が 落 ち   る 系 を 確 立 で き た 。AM投 与 群 ．AMA投 与 群 で 、 腫 瘍 重 量 は そ れ ぞ れ0．0483土   0．0089＠と0．0297土0．0001僻であった。

◎AMも し く はAMA投 与 後 の 膕 赫 臓 に お い てanti‐PCNA抗 体 お よ びanti‐ の31抗   体を用いて免疫染色を行い、増殖細胞数（p（NA‐labeling血dex）とCD31陽 陸細胞数・

  腫 瘍 血 管径 を 比 劇 食言 寸した 。PCNA‐1abeling耐eXはAM投一与 群．AMA投 与群で そ   ゎぞ捫25．8土3．9と613土5．2であった。両群でCI）31陽陸細胞数は有意差を認めなか   っ た が ヽ平 均 腫 瘍 血篭 径 はAM投 与 群 ．AMA投 与 群でそ 捫ぞゎ6．454土5313（ ルm）   と2．276土1112啖Um）であった。

【考案】

  本研究 におい て、加W旧にお けるAMAの抗腫壌5効果を確認したが、このネ古果Iあ塑に AMが所． レめに おける 膵腫瘍 形成に 重要で あること を示唆 する所 見であ る。最 近のい くつか の報告 で、AMが 癌細胞 でgrawthfactorと して作 用する ことが 報告さ れてい るた め、 脾 癌 細 脆蛛 のAM．AMrecepぬ 発 現 とAMAの 脾 謔 諦 田胞 の 加vむm増 殖 抑匍J効果を 検討 し た と ころ 、AMは低 酸 素 下 で強 く 発 現 して い た が 、AMr∞ep卿は ほ とん ど発現 して お ら ず 、加v面り で は問岨Aの膵癌 細胞の 増殖に たいす るAMA抑制 効果は 認めら れ なかっ た。こ の結果 から少 なくとも 膵癌細 胞ではAMはautoc血e様に作 用して おらず、

加Wmで の 増 殖 抑 市 崎 操 はAMの 間 接 的 効 果 に よ る こ と カ ミ 示 唆 さ れ た 。   次 にAMAの抗 腫 瘍 効 果の 機序を 調べるた めに、AM（1‐25）投与 群とAMA投 与群腫 瘍 組織 の 免 疫 染色 に て 増 殖細 胞 と 腫 瘍血 管 に つ いて 検 討 し たと こ ろ 、AMA投与群はAM 投与群 にくら べて有 意に増 殖細胞数 が少なかった。腫瘍血管数に有意差はなかったが、

問ゾ瞼 投与群 ではAM投 与群に くらべ て平均 腫瘍血管 径は有 意に小 さかっ た。こ れらの 結果 か らAMAの 膵癌 細 胞に 対する 増殖抑 制効果 は腫瘍 組織内 の比較 的大き い血管の 形 成を抑 制して 栄養・ 酸素の 供給を減 少させることによる間接的効果であることが示唆さ れた。

【結語】

  AMはmvivoで の 膵 癌細 胞 増 殖 にお い て 重 要な 役 割 を 果た し て お り、AMAは 膵 癌治 療に有効である可能性カ錺破された。

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学位論文審査の要旨

     学位論文題名

Adrenomedullin antagonist suppresses in vlVOgrOWth     OfhumanpanCreatiCCanCerCe11SinSCIDmiCe     bySuppreSSlngang10geneSiS

     （ AdrenomedumnantagoniSt は血管新生抑制を介して     SCIDmice におけるヒト膵癌細胞の増殖を抑制する）

   難 治 癌 の代 表 で ある 膵 癌の 治 療 法の 開発にはそ の特徴を より明瞭 にする必 要 が ある 。 最 近、 低 酸素 適 応 が膵 癌 増 殖に重要で あること 、低酸素 誘導遺伝 子の ひ とっ が adrenomedullin(AM) で あ るこ と、AM は血 管拡張因 子・血管新 生因子．

autocrine growth factor であることが報告された。このためA.M antagonist(AMA) は 癌 細胞 増 殖 を直 接 抑制 す る 可能 性 、 対血管効果 で間接抑 制の可能 性が考え られ る。本研究では最初に膵癌細胞株の低酸素下でのAM 発現を確認し、゛次にin vitro で の AMA の 効 果 を 検 討 し 、 最 後 に in vivo で の 効 果 を 検 討 し た 。    膵癌細 胞株の低 酸素下で の AM 発現を Northem blot および免疫染色にて検討し、

AM receptor 発現 を RI: PCR に て 検 討し た。低酸 素下では 膵癌細胞株 は AM 発現が 亢進し、receptor 発現は一部にのみ発現していた。次に膵癌の in vitro 増殖に対す る AMA の 抑 制 効果 を MTS assay に て検 討し たが、全 く効果がな かった。 さらにin vivo 増 殖に 対 す るAMA の 抑制 効 果 を膵 癌 移植 SCID マ ウ スモ デ ルを 用 いて検討 し た 結 果 、 AMA は 腫 瘍 増 殖 を 抑 制 し た 。 機 序 を 解 析 す る た めAMA 投 与で control に くら べ て 腫瘍 重 量が 半 分 に落 ち る 系を確立し 、増殖細 胞および 血管内皮 細胞 を 免疫 染 色 にて 検 討し た 結 果、 AMA 投 与で 増 殖細 胞 数 は減 少 し、 血 管数は変 わ ら ない が 内 径の 太 い血 管 の みが 減 少 して い た。 AMA は 内径 の 太い 血 管の新生 を 阻 害す る ことで膵 癌のin vivo 増殖 を抑制し ていた可能 性が示唆 された。 現在、

血 管新 生 は 未成 熟 血管 網 か ら複 雑 な remodeling 過程を経て 成熟血管 網となる 経 路 が 考 え ら れ る が 、そ の 詳細 は 不 明で あ る 。本 研 究で は AM は 血 管成 熟 機 構の

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林 藤

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太い血管形成過程に関与している可能性が示唆された。

   公開発表にあたって、副査の加藤教授からin vitro とin vivo でのAMA 量の差に ついて、太い血管のみ阻害との考察について、血管収縮作用による抑制効果の 可能性、 AMA 投与時 のHIF‑1a 発現の変化 について質 問があった。これに対し 申請者はAMA 濃度と作用時間の積で作用強度を考えた方がよいこと、remodeling 過程 に おける AMA の作用 の可能性、 AMA の血管 拡張阻害効 果の持続時 間から その可能 性が低いこ と、AMA 投 与時のHIF‑1a 発現亢 進の可能性について説明 した。副査の浅香教授からAM に着目した理由、in vitro とin vivo での増殖抑制効 果の差に ついて、HIF‑1a 発現により嫌気性代謝が亢進して膵癌が低酸素適応 するという従来の報告との関係、腫瘍縮小効果はnecrosis かapoptosls かについて 質問があ った。これ に対し申請者は低酸素下でAM がより強く発現したこと、

AMA が膵癌に対しautocdnegrowthfactor として作用していない可能性があるこ と、膵癌の低酸素適応には血管新生が重要であること、縮小効果はapoptosis を 考えてい ることを説 明した。主 査の小林教 授から AMA の AMreceptor に対する 作用について、invitro でAMA が分解され失活した可能性、腫瘍内に小さな血管 が残存し ているので now もあるのではとの指摘、大きな癌に対する AMA の効果 の有無について質問があった。これに対し申請者はAMA は競合阻害で作用する こと、 AMA がpe 襾daSe などで分解される可能性があること、小さな血管は酸素・

栄養の運搬に不十分なこと、大きな癌にもある程度AMA は効く可能性があるこ とについて説明した。会場の守内教授からAMA の静脈内投与の報告の有無、血 管病変に 対する AM の効果 にういて、 他の癌に対 する AMA の効果について質問 があった。これに対し申請者は静脈内投与の報告の無いこと、血管病変に対し AM は期待でき ること、他 の癌に対し ても AMA の効果は期待できることを説明 した。

   本研究によ り AMA が 内径の太い 血管の新生 を阻害することで膵癌の invivo

増殖を抑 制する可能 性を示したことは、AM が血管成熟機構の太い血管形成過

程に関与している可能性を示唆するもので、今後の癌治療への応用にも期待さ

れる。審査員一同はこれらの成果を高く評価し、申請者が博士（医学）の学位

を受けるのに十分な資格を有するものと判定した。