Title
究 : バクテリオンンの産生およびその性状
Author(s)
吉元, 房枝; 今村, 禎祐
Citation
琉球大学保健学医学雑誌＝Ryukyu University Journal of
Health Sciences and Medicine, 2(2): 131-140
Issue Date
1979
URL
http://hdl.handle.net/20.500.12001/2205
琉大保医誌2(2):13ト140, 197< 琉球大学保健学部微生物学教ギ
吉元房枝 今村禎祐
は じ め に 「バクテリオシンはタンパク質性の物質であり, バクテリオシンの産生は,産生菌にとって致死的な 過程であるo バクテリオシンは産生菌と同種または 放線の細菌にのみ作用し,その感受性は特異的なリ セブタ-の存在によって決定されるoJとJacobら11 は述べているO これまでに腸内細菌(?*> tlscherichia coliによって産生されるコリシン2):う>, Pseud0-monasによって産生されるビオシンl>.-,)について は比較的詳細な研究がなされているo 嫌気性グラム 陰性稗菌のB. fragHisは,腸管の常在細菌某の最優 位構成薗櫨でIcr-'Vgに存Il三L,また臨床材料から 分離されるBackOl′idesのうち6()-70%は本南柏で ある<>!。しかL本薗椎の産生するバクテリオシンの 研究は少fJ:く, Beerensら ォ), Podhaisky らn およびBoothら10)の報告があるに過ぎないO 著者らはヒト腸管から分離したB.fragilis のバTable 1. Bacterial strains used m this study
131 クテリオンン産生性およびバクテリオシン感受性の 検索を行った。また一部のバクテリオシンの性状に ついても比較検討を加えた。 材料 と 方 法 供試菌:表1に示すように腸管分離株37株すなわ ちss. fragilis 15株, ss. thetaiotaomicron 12株, ss. vulgatus 7株, s.s. distasonis 2株,その他1 株と岐阜・大学医学部上野一恵教授より分与を受けた 標準菌株4株すなわちss. fragMs 株, S5. the-taiotaomicron l株およびs.s. distasonis l株合計 41株であるO 培地:菌株の保存はGAM半流動高層培地(日水) に炭酸カルシウム粉末を 0.5%になるように添加し た培地を使用した。バクテリオシン産生用培地およ び感受性菌の増菌用培地はVPI manualのBHI--Sブイヨン培地(ブレイン--トインヒュ-ジョン ブイヨン,栄研,3.7g 酵母エキス,オリエンタル,
Origin : Human intestinal tract
B. fragihs ss.fragihs; F-l, F-4, G-2, G-5, G-6, G-10, G-ll, M-1, N-5, 0-4, 419, 544, 559, 622, 663. ss. thetaiotaomicron; A-3, G-9, H-10, H-ll, K-1, L-5, 0-1, Q-4, 37, 550, 559, 690, 707. ss. vulgatus; B-4, B-5, H-2,I-1,I-4, L-1, 520. ss. distason伝; K-5, 744. other ; I-5 : Referens strains ss. fragihs : 2536, 5118. ss. thetaiotaomicron ; C0- 1 - 2. ss. distasonis : C0-1-7.
•c
が産生するバクテリオシンの研究
-バクテリオシンの産生およびその性状---0.5g+ビタミンK--ミン溶液, 1.0ml+L-シス テイン塩酸塩0.05g +蒸留水100ml)を使用した。 バクテリオシン感受性テスト培地はGAM混合寒天 培地(GAM寒天培地,日水,とペプトンー酵母エキ ス寒天培地との混合寒天培地1 : 1)を使用した。 バクテリオシン産生株および感受性株の検索: 1) 培養上清渡液の作製- GAM半況動高層培地で予備 培養した菌を新鮮BHI-Sブイヨン培地に接種し, 37℃. 48時間スチールウール法で窒素ガス存在下で 嫌気培養する(以下嫌気培養と記す)。培養後遠心し, メンブレンフィルター(ミリポア:口径0.45〃m) で波過し,培養上清櫨液を採取し,使用するまで4 ℃で保存した。2) cross culture spot test一上 述の方法で嫌気培養した培養菌液をGAM混合寒天・ 培地に拡げて,表面を乾燥後,培養上清液液を注射 器で一滴スポットし,嫌気培養した。培養後,漣液 により発育の阻害を受けた菌を感受性菌,阻害物質 を産生した菌を産生菌とした。また阻止部と感受性 菌とをBHI-Sにとり,活性の増強の有無について も検討し,バクテuオフア-ジと区別した. バクテリオシンの産生: 1)種々の液体培地におけ るバクテリオシンの産生-培地は次のような培地を 使用した。すなわちHIブイヨン(-ートインヒュ ージョンブイヨン,栄研), HI-Sブイヨン(VPI manualのBHI-SのBHIの代りにHIを使用), BHIブイヨン, BHトSブイヨン, PYG ブイヨン
(VPI manual のbasal medium), GAMブイ ヨンおよびメジウム10である GAM半流動高層培 地で前培養の産生菌をそれぞれの培地に接種し, 48 時間嫌気培養後,日立分光度計139型にて660m〃に おいて濁度を測定した。そのご遠心し,上清をミリ ポアフィルタ-で櫨過し,櫨液についてバクテリオ シン活性を測定した。 2)バクテリオシン産生の経時 間的変化-GAM半流動高層培地で前培養の菌を BH卜S ブイヨン培地に接種後,嫌気培養した。経 時的に取り出し,濁度とバクテリオシン活性を前述 の方法で測定した。 3)園型培地におけるバクテリオ シン産生-GAM混合寒天培地に-白金耳の産生菌 株をスポットし, 24時間, 48時間それぞれ嫌気培養 級,菌をクロロホルムで殺菌した。その上に感受性 菌B-5株を砿げて乾燥後, 37℃,一晩嫌気培養後, 阻止円の直径を測定した。 バクテリオシン活性の定量: B-5株の一晩培養液 をGAM混合寒天培地に拡げ,表面を乾燥後,これ にあらかじめ希釈した試液を-白金耳スポットし, 37℃,一夜嫌気培養後に透明な阻止円を形成する最 高希釈度を求め,その逆数を試液0.01mlあたりの バクテリオシン活性とした。 温度, pHおよび透析の条件:温度は0.05M T-ris-HCl緩衝液pH7.2において100℃, 5分, 30分, オートクレーブで120℃, 5分および15分加熱した 級,急冷し残存活性を測定した。 pHおよび透析に 関する実験は前に報告した方法で調整し,同様に実 験を行った。】1) 各種試薬の調製およびその条件:ド)ブシンDi-fco, l :250), α-キモト1)ブシン P-L Bio-chemicals, Inc.), DNase (P-L Bi∝hemicals. Inc.), RNase (P-L Biochemicals, Incふ ペ プシン(石津製菓, i :lo.ooo)による作用は次の ように調製し, 37℃, 1時間インキュベ-ト後,戟 存活性を測定したoトリプシン,I α-キモトリプシ ン, DNase,およびRNaseのそれぞれ1mg/ml を0.05M Tris-HCl緩衝液pH7.7に,ペプシン1 mg/mlは0.05M酢酸緩衝液pH3.6に溶解し,作用 後pH7.2に修正した。クロロホルム,エチルエーテ ルによる影響を調べるために37℃,一時間インキュ ベ-ト後,クロロホルム,エチルエーテルを除去し, 残存活性を測定した。硫酸アンモニウムによる塩析 は硫酸アンモニウム(関東化学,特級)を20-80% 飽和になるように培養上清漉液に加えて,冷室に24 時間放置後, 10,000rpm, 30分間冷却遠心し,上清 と沈澱に分けた。沈澱を50倍量の0.05M Tris-HCl 緩衝液pH7.2に溶解し,上清と溶解液のバクテリオ シン活性を測定した。 実 験 結 果 産生株および感受性株の検出:腸管分離株および 標準菌株のcross culture spot testの結果, 41 株中6株(ss. 株とss. vulgatus l株) は他の菌株の発育を阻止するバクテリオシン産生株 であった。表2はこれらの産生株によって産生され るバクテリオシンの活性スペクトルを示したもので ある。産生株はいずれも自己の産生するバクテリオ シンに対して感受性がないO他方41株中39株はいず れかの培養上清により発育が阻止される感受性菌で あったOその中の一株B-5はすべてのバクテリオシ ンに感受性を示したので以後,感受性菌として使用 したoまた全く発奮阻害を受けない株が2株(II 1,662株)があり,それらはいずれも産生株であ as
血cteroides fragilisのバクテリオシン
Table 2. The susceptibility of strains of B. fragilis to six supernatant fluids
133
N o . o f stra in s
S usc ep tib ility to b a cterio cin s o f
I - 1 0 P 4 4 19 544 6 22 663 A - 3 + + + 十 + -B - 4 - - + .十 -B 一 5 + + + 十 + + F - 1 - + - - -F 一 4 - + - + -G - 2 - + - - -G - 5 - + + + -G 一 6 + + + + -G 一 9 + - + -G - 10 + 十 + G - ll - + - + H - 2 + + + + H ー 10 + + - -H - 1l I 一 l I - 4 + + + + + + 1 一 5 - + - + -K 一 1 - + - + -K 一 5 - + - + -L P 1 + + - + -L - 5 + - -M ー 1 + + -N 一 5 + + -O - 1 + - + -0 - 4 - - + -Q - 4 - + + .十 37 + - - + -・H 9 + + + 5 20 + + + 544 - + + 5 50 - + + + 5 59 + + - + -6 22 6 63 + + 6 90 + + + - -7 0-7 , + + - + + 744 I - -C 0 - 1 - 2 - + + + C 0 - 1 - 7 + - + -2536 - + -51 18 I .+
-The activities against strain B-5 0f bacteriocins produced by strains 1 - 1 ,0- 4 ,419, 544, 622 and 663were 8, 8, 2, 2, 4 and 2 A. U.,respectively.
0-4株, 622株の座するバクテリオシンは41株中 33株(約81%)の広範囲に発育阻止を示し,他方I -1, 419, 544,および663株のバクテリオシンは狭 い範囲の菌の発育を阻止した。表3はバクテリオシ ン感受性について亜種別に整理したものである。 ss_ fragilisによって産生されるバクテリオシンは亜種 を適えて活性を示すが, ss. vulgatusのそれは同 亜種のみに限定して活性があり,亜種特異性を示し た0本実験において, ss. distasonisおよびss. thetaiotaomicronから産生株は検出されなかったD これら産生株のなかで産生量が安定で,広範囲に 活性を示す0-4, 622晩と狭い範囲に強い活性凌 示すI- 1株の座するバクテリオシ・ンの諸性状につ いて,さらに詳しく研究した。 バクテリオシンの産生:予備実験として,バクテ リオシン産生用培地の最適培地を選択するために種 々のブイヨン培地におけるバクテリオシン産生を比 較t吏(表4)。 BHI-S, GAMブイヨン培地におい ては菌の発育も良く,またバクテリオシン産生量も 多い。しかし基礎培地であるPYGブイヨン培地に おいては,菌の発育も悉く,活性も低い。一方沈査 のバクテリオシン活性についても音波処理をしたあ と測定したが,その準性は1A.U.であった。この 知見より,バクテリオシン産生用培地としてBHト Sブイヨン培地を以後の実験に使用した。図1はブ イヨン培地におけるバクテリオシン産生の経時的変 化を示した。三つのバクテリオシンの産生様式にわ ずかな差異が認められた。すなわち, I-1-, 622 株のバクテリオシン活性は培養後, 6時間頃から培 養上清中に認ゆられ,後期定常期に貴高となった。 また3株中最も発育の良い622株はバクテリオシン 産生量が少なく,その活性は2-4A.U.であった。 一方0-4株は骨に他の2株より発育が遅かったが, バクテリオシンの産生は菌の発育と平行しており, その活性は定常期の初期に車高( 8A.U.)となった。 同型培地におけるバクテリオシン産生を表5に示 し,阻止円の形態を図2に示したb 固型培地の0--14株がつくる阻止円の直径は,三株のなかで一番 小さく, 48時間後も等径であった。一方I-1,622 株の阻止円の直径は培養時間が長くなるにつれて変
Table 3. The number of sensitive strains to B. fragilis bacteriocin
su b spe cies
N o . o f N u m b e r of sen sitive stra in s to ba cten o cin s . stra in s ￡ested pro d u ced by I - 1 0 - 4 419 544 622 6 63 ゐ tas on is 3 0 3 0 0 2 0 f rag ilis 17 0 13 1 3 13 0
th eta io由om icron 13 0 ll 6 5 ll 2
vu lg a tns 7 6 5 1 3 6 1
o th er 1 0 1 0 0 1 0
tota l n o . 4 1 6 33 8 l l 33 3
( % ) (37 ) 8 1 20 27 81 ; s i
Table 4. Bacteriocin production in liquid media
」
卜 1
0 - 4
O . D . A ctiv ity O . D . A c tiv ity O . D . 0 .ll 1 A .U . 0 .03 0 A . U . 0 .175 0 .70 2 0 .35 8 0 .8 4 0 .4 1 2 0 .28 4 0 .52 1 .17 8 0 一58 8 1 .27 0 .2 35 0 0 .0 3 1 0 .38 1 .29 8 0 .62 8 1 .28 0 .3 7 4 0 .16 5 4 0 .37
Bacteroides fragiltsのバクテl)オシン 化し,大きくなっている0 0-4株の阻止円の形態 は透明なはっきりしたものであったD 他方I-1, 622株のそれは,透明になった部分(完全発育阻止) とhalo の部分(不完全発育阻止)とから成るもの であった。 Time(hours)
Fig. 1. Production of bactenocms by B. fragihs in BHI-S broth.
Samples were assayed for optical density (solid lines) and bacteriocin activity
(broken lines). Symbols : I- 1 (×), 0-4 (Oi, 622 (▲).
Fig. 2. Growth inhibition of strains B 5 due to three bacteriocins from B. fragilis
135
Table 5. The differences in diameter of the inhibition zone among three
bactenocins, obtained from 且 fragihs, to B. fragilis ss. vulgatus B5 on solid media
C u ltiv atio n tim e D ia m e ter of in h ib itio n zo n e b y stra in I - 1 0 一 4 6 22 24 h 21mm llmm 20 mm 48 h 2 9 ll 28
The results shown are the average of ten experiments. バクテリオシンの理化学的性状について:表6よ l),これらのバクテリオシンはいずれも耐熱性を示 したが,高温部における様態が異なっている100℃, 30分の加熱処理により 622株のバクテリオシン活性 は完全に不活化したが, I-1, 0-4株のバクテ リオシン活性は安定であった。しかしいずれのバク テリオシンも120℃, 15分の処理により完全に不活化 した。またこれらのバクテリオシン活性は広範囲の pH 3-10において安定であり, pH安定性については 明確な差異は認められなかった。ただし 622株バク テリオシンは2回の実験において, pH3-5およ びpH 9 -10で約50%の活性低下を認めた. 表7はバクテリオシンを種々の試薬で処理した結 果をまとめたものである。これらのバクテリオシン に共通する性状は,ペプシン, DNase, RNase, 尿素おj:び有機溶媒抵抗性である0 -万トリプシン, α-キモトリプシン感受性は異なっている。すなわ ち, 0-4株バクテリオシンは両物質に感受性, I -1株バクテリオシンはトリプシンやや感受性, α -キモトリプシン抵抗性,.622株バクテリオシンは両 物質に抵抗性を示した。またこれらのバクテリオシ ンは,透析したあと活性はセロファンチュ一一ブ内に 残っており,非透析性の物質であった。 これらのバクテリオシンはいずれも40-80%飽和 硫酸アンモニウムで沈澱したo 他菌種に対する作用:三つのバクテリオシンの他 菌種に対する影響を表8に示した。好気性菌,通性 嫌気性菌,嫌気性菌のグラム陽性菌およびグラム陰 性菌のなかでBacteroides 属以外の菌株は発育の 阻止を受けなかった。
Table 6. The effect of heat and pH on the activity of crude bacteriocins obtained from
B.ノ晦ins
T em pe ratu re 3 7 " l o o ℃ 12 0 ℃ 2 3 - 5 6 - 8 9 - 10 1 h 5 m m . 3 0 m m . 5 m in . 1 5 m in . 8 * 8 8 8 0 0 8 8 8 8 8 8 0 0 8 8 8 8 0 0 0 0 蝣1 8 * :A.VTable 7. The effect of various treatments on the activity of bacteriocins isolated from B. fragihs
C on d itio n
B a cten o c in a c tiv ity (A 一U .)
I - 1 O - I 62 2
co n tro l trea ted c o ntr ol tre ate d co n trol tre ated
T ry psin (1 m g ′m 1) 37 C , 1 h 32 16 32 0 3 2 32
αch y itlo try p sin
(1 m g /m l) 37 C , 1 h 3L 32 32 0 3 2 32 P ep sin (I m g /m l) 37 ′C , 1 h 32 32 32 3 2 3 2 32 D N a se (1 m e /m l) 37 C , 1 h 32 32 32 3 2 3 2 32 R N a se 1 m e /m l 37 C , 1 h 32 32 32 3 2 3 2 32 C h loro fo rm (50 % ) 37 C , 1 h 32 32 32 3 2 32 32 E th y leth er (50 % ) 37 C , 1 h 32 32 32 o !_ 32 32 U rea 6 M 4 C , 24 h 32 32 32 3 2 32 32 ロ D= 0 .05 M T n s-H C l b u ffe r 4 C , 24 h 32 32 3 2 3 2 32 32 t< 盟. d istilled w ater 4 C , 24 h 32 32 3 2 3 2 32 32 考 察
B. fragHis 41株についてcross culture spot test法により6株の産生菌を確認した。他方39株の 菌株はいずれかのバクテリオシンに感受性を示し 感受性のない2株はいずれも産生株であった。また Bacteroides属以外の菌桂はこれらのバクテリオシ ンにより発育を阻止されない.この知見はBeerens ら8)やBoothら10)の報告と一致する。 ss. fragilis の0-4, 622株バクテリオシンは同頻度に亜種間の 菌株の発育を阻止し, ss. fragilisに特異的に作用 することはなかったo この結果はss. fragilis に感 受性菌が多いというPodhaiskyら9)の報告とは一 致しない.他方ss. vulgatus バクテリオシンは同 亜種のみに特異的に活性を示した。これらの結果は 例数は少ないが,これまでB. fragilisの分類に使 用されている生化学的性状のほかに,バクテリオシ ン感受性が一つの形質として利用できる可能性を示 唆しているO とくにI-1株バクテリオシン感受性 は亜種レベルの同定に価値のあるものと考える。 バクテリオシンの産生と培地との関係は,基礎培 地とされているPYGブイヨン培地における産生量
Bacteroides fmgilisのバクテリオシン
Table 8. The susceptibility of various organisms to bacteriocins isolated from B. fmgi伝
137
O rganism s N o. of strains
tested
N um ber of sensitive strains to b acten ocin produced by
I P 1 0 - 4 622
B . fragilis 41 6 33 33
B . m elam n ogen ic船 3 1 1 1
B . oralis 1 0 0 0 F usobacten um 1 0 0 0 Veillonella 1 0 0 0 C lnstn dium 12 0 0 0 B ifidobacterium 1 0 0 0 P eptococcus 2 0 0 0 P eptostreptococcus 2 0 0 0 K colt 1 0 0 0 Salm onella 3 0 0 0 Shigella 3 0 0 0 P seudom onas 1 0 0 0 P roteus 1 0 0 0 Staphylococcus 3 0 0 0
Table 9. Some differential properties among three bacteriocins from B. fragilis
B acten ocins A ctive spectrum Inhibition zone loo ℃, 30' T rypsin
I 一l narrow large halo resistant less sensitive
0 ー4 broad sm all resistant sensitive
622 broad large halo sensitive resistant
は最も低く,栄養豊富なBHI-SおよびGAMブイ ヨン培地で最も良いO この知見は産生量が菌量に平 行することを示唆しているo また-ミン添加培地で 発育が良いのはBacteroidesの-ミン要求性を再確 認するものである。時間的にみると,活性は定常期 に達した時,最高(4-8 A.U.)となっており, その後24時間経過しても活性は低下せず,安定な物 質であることが示唆された。また固型培地において 0- 4株の産生する阻止円の直径は11mmで非常に 小さいが,産生性は安定であった。この結果は小さ な阻止帯を有するバクテリオシンの産生が安定しな いというPodhaiskyら9)の報告とは異なっているO ブイヨン培地で産生量の黄も少なかった622株バク テリオシンは,固型培地上での阻止円の直径が0-4株バクテリオシンの直径よl)も大きかった。この 結果は園型培地において産生量が多いためではなく 拡散性の問題と考えている。なぜならば32A.U.の 014株バクテリオシンを-白金耳平板培地-スポ ットした時に形成された阻止円は11-15mmで,一 方8A. U.の622株バクテリオシンを同様にスポッ トした時形成された阻止円は25-30mmであった。 すなわち0-4株バクテリオシンが非拡散性のも ので, I-1,および622株バクテリオシンが拡散 性のものである可能性がある。 本報告は主として1-1, 0-4および622株の 培養上清硫安濃縮バクテリオシンの理化学的性状に ついて比較検討した。これまで報告されているBac-teraidesのバクテリオシンはB. convexa によって 産生され,易熱性でクロロホルム耐性のものと,B. thetaiotaomicronにより産生され,耐熱性で蛋白分 解酵素感受性のものの二種類であるO 今回報告する 0-4株バクテリオシンは後者のバクテリオシンと
類似のものと思われるがI-1, 622株バクテリオ シンは耐熱性で,蛋白分解酵素抵抗性なのでいずれ とも異なるものと考える。またこれら三つのバクテ リオシンは活性スペクトル,阻止円の形態,蛋白分 解酵素感受性および100℃, 30分の加熱処理の影響 について考慮すると,三種頬に区別できる(表9)0 今後,これらのバクテリオシンの本体およびその差 異を明らかにしていくために,バクテリオシンの精 製を行うことが望まれる。またバクテリオシン感受 性を分類に応用していくために,精製バクテリオシ ンの活性スペクトルについても再検討が必要である。 ^^^^K^^^E& ヒト腸管由来37株および標準菌株4株の合計41株 のB. fragilisについて,バクテリオシン産生性およ びバクテリオシン感受性の検索を行い,次のような 結果を得た. 1.バクテリオシン産生株6株が得られた。その うち5株 0-4, 419, 544, 622, 663)はss. fra-aHisに属し, 1 -1株はss. vulgatusであった。 2.供試菌41株中39株のほとんどの菌株がいずれ かのバクテリオシンに感受性があり,そのうち1株 (B-5, ss. vulgatus)は分離したすべそのバクテ リオシンに共通して感受性があった。また全く感受 性のない株が一株あり,それらはいずれも産生株で あった。産生株はいずれも自己の産生するバクテリ オシンに対して感受性がなかった。 3. 0-4および622株バクテリオシンはB.frag-gilisの41株のうち33株(約81%) <r>発育を阻止し, 広域活性スペクトルを示し,一方419, 544, 663お よびI-1株バクテリオシンはいずれも抗菌スペク トルが狭城であった。 4.バクテリオシン感受性を亜種間でみると, B. fragHisによって産生されたバクテリオシンは亜種 を越えて活性を示したが, ss. vulgatusのバクテリ オシンは同亜種のみに活性を示すという興味ある知 見を得た。 5.いずれのバクテリオシンもBacteroides 属 以外の菌種については感受性を示さなかった。 I-1, 0-4および622株バクテリオシンはさ らに次の諸点が明らかになった。 6.いずれのバクテリオシンもBHトSおよびG AMブイヨン培地でもっとも多く培養液中に産生さ れ,活性は定常期で貴高 4-8, A. U.)となった。 7. 100℃, 30分の加熱処理によ・), 622株バクテ リオシンは失活したが, 1-1および0-4株バク テリオシンは安定であった。 8. 0-4株バクテリオシンはトリプシン感受性, I - 1株バクテリオシンはやや感受性, 622株バク テリオシンは抵抗性であった。 9.その他の理化学的性状は3つのバクテリオシン でほぼ同様であった。 標準菌株を分与下さった岐阜大学の上野一恵教授 に感謝します。 本論文の要旨の一部は第30回日本細菌学会九州支 部総会(1977年11月)において発表した。 文 献
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Bacteriocin-bildung und Bacteriocinsensilit芝t bei Bacteroides fragilis und Bacteroides thetaio-taomicron aus Klinischem Material. Zbl.
励cteroides fragtlisのバクテリオシン
Bakt, I. Abt. Ong. 215, 475-482, 1970. 10) Booth, S. J., Johnson, J. L., Wilkins, T. D∴
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