Ⅱ型 DNAトポイソメラーゼと神経細胞分化

II型DNAト

ポ イ ソ メ ラー ゼ と神 経細 胞 分 化

筒

井

公

子

岡山大学大学院医歯学総合研究科

神経機能構造学

キ ー ワ ー ド;II型DNAト ポ イ ソ メ ラ ー ゼ,神 経 細 胞 分 化,遺 伝 子 発 現 誘 導,初 代 培 養,シ ナ プ ス タ ン パ ク 質 緒 言 神 経 幹 細 胞 が 発 見 され,神 経 細 胞 の再 生 能 を利 用 し た脳 ・神 経 疾 患 の治 療 も夢 で は な くな っ た と考 え られ る.ま た,ES細 胞 か ら再 生 した 臓 器 に よ る移 植 医 療 (例 え ば 網 膜 の 再 生 と移 植 に よ る視 力 障 害 の 治 療)の 進 展 に も期 待 が 寄 せ ら れ て い る.い ず れ に お い て も multipotentな 細 胞 を一 定 の 方 向 に正 し く分 化 させ て い く過程 が 重 要 とな るが,こ の プ ロ セ ス は ま だ十 分 には 明 らか に な っ て い ない. 幹 細 胞 が 特 定 の 成 熟 した細 胞 に分 化 して い く過 程 で は,多 様 な タ ンパ ク質 が 決 め られ た タ イ ミ ング で順 序 よ くつ く られ,特 異 的 な細 胞 の構 造 と機 能 が獲 得 され る.こ の こ と は細 胞 の核 内 で 多 種 類 の遺 伝 子 が,整 然 と した 制御 下 で順 次mRNAに 読 まれ て い くこ とを意 味 して い る.我 々 は,遺 伝 子 転 写 機 構 の最 上 流 に位 置 す る転 写 制 御 にII型DNAト ポ イ ソ メ ラ ーゼ が 深 く関与 し て い る こ とを見 出 した.II型DNAト ポ イ ソ メ ラー ゼ は 細 胞 核 内 で 遺 伝 子DNAの 折 りた た み(高 次 構 造)を 制御 す る と考 え られ る.本 総 説 で は,小 脳 の顆 粒 神 経 細 胞 の 分 化 を中 心 に,神 経 細 胞 分 化 の メ カ ニ ズ ム で ト ポIIが 担 う役 割 につ い て述 べ る. II型DNAト ポ イ ソ メ ラ ー ゼ(ト ポII) 二 重 らせ ん 構 造 の 遺 伝 子DNAは 折 り た た ま れ,捻 れ て,細 胞 核 と い う 微 小 な 空 間 に 詰 め 込 ま れ て い る. 細 胞 が 増 殖 す る 時 に 複 製 さ れ たDNAは,さ ら に 互 い に 絡 ま り合 っ て い る.絡 ま っ たDNAを 分 離 させ た り, 捻 れ たDNAか ら捻 れ を 除 くた め に,DNAの2本 鎖 を 切 断 し再 結 合 す る酵 素 が 細 胞 核 内 に存 在 す る.DNA分 子 の トポ ロ ジ ー を 変 換 す る 働 き か ら,II型DNAト ポ イ ソ メ ラ ー ゼ(ト ポII)と 呼 ば れ る1).細 胞 分 裂 時 に 絡 ま っ たDNAを 分 離 さ せ る こ とが 出 来 る の は トポIIの み で,こ の 酵 素 が 失 活 す る と細 胞 は 増 殖 出 来 な くな る2). こ れ に 着 目 し,ト ポIIの 酵 素 活 性 を 特 異 的 に 阻 害 す る 薬 剤 が 優 れ た 抗 ガ ン 剤 と し て 開 発 さ れ3),同 時 に タ ー ゲ ッ トで あ る トポIIの 研 究 も飛 躍 的 に進 展 し た. トポIIは 長 い 間,分 裂 し て い る細 胞 の 核 に の み 存 在 し て い る と考 え ら れ て い た4)が,我 々 は 分 裂 能 を も た な い 成 熟 し た 神 経 細 胞 の 核 に トポII活 性 が 認 め ら れ る 事 を発 見 し5),ラ ッ ト脳 か らcDNAを ク ロ ー ニ ン グ し て,神 経 細 胞 で 発 現 し て い る の は 従 来 知 ら れ て い る ト ポIIで は な く,1987年 に 見 出 さ れ た 新 規 ア イ ソ フ ォ ー ム,ト ポIIβ で あ る こ と を 報 告 し た6).従 来 の トポII は トポIIα と呼 ば れ て い る. トポIIα と βは異 な る遺 伝 子 に コー ドさ れ て い るが7,8), 酵 素 学 的 性 質 は ほ ぼ 同 じ で9),ア イ ソ フ ォ ー ム を 明 瞭 に 区 別 で き る 阻 害 剤 も無 い.酵 母 や シ ョウ ジ ョ ウバ エ な ど無 脊 椎 動 物 に は 単 一 分 子 種 の トポIIし か 存 在 せ ず1), 脊 椎 動 物 が 誕 生 す る 頃 に ト ポII遺 伝 子 の 重 複 が 起 こ り,そ れ ぞ れ が 変 異 を 蓄 積 して 別 個 の 遺 伝 子 と な っ た も の と 考 え ら れ る.し か し,酵 素 の 反 応 機 構 は 無 脊 椎 動 物 の トポIIか ら脊 椎 動 物 の トポIIア イ ソ フ ォ ー ム ま で よ く保 存 さ れ て い る10).簡 単 に 述 べ る と,2量 体 を 形 成 し た トポIIの サ ブ ユ ニ ッ トの 問 に 二 重 鎖DNAが 取 り込 ま れ て 両 鎖 と も切 断 さ れ,DNAの5'端 と トポ IIの チ ロ シ ン 側 鎖 が ホ ス ホ ジ エ ス テ ル 結 合 を つ く る (ク リ ー バ ブ ル コ ン プ レ ッ ク ス と呼 ば れ る).切 断 さ れ たDNAの 間 隙 を他 の 二 重 鎖DNAが 通 過 し た 後,切 断 端 が 元 通 り再 結 合 さ れ,ト ポIIとDNA端 と の 共 有 結 論 文 請 求 先:〒700-8558岡 山 市 鹿 田 町2-5-1 電 話:086-235-7096 FAX:086-235- 7103 E-mail:[email protected]. ac.jp

104 筒 井 公 子 合 も解 消 さ れ る(図1).ト ポIIα は 染 色 体 の 凝 縮 と 分 離 過 程 で 働 き,細 胞 増 殖 に 必 須 で あ る が,ト ポIIβ は トポIIα の こ れ ら の 機 能 を 肩 代 わ りす る こ と は で き な い11). トポIIの 研 究 は 主 と し て 酵 母,シ ョ ウ ジ ョ ウ バ エ お よ び 培 養 細 胞 を 用 い て 進 め ら れ た.酵 母 や シ ョ ウ ジ ョ ウ バ エ で は トポIIは ま だ ア イ ソ フ ォ ー ム に 分 か れ て お ら ず,培 養 細 胞 で は トポIIβ の 発 現 量 が 非 常 に低 く, 細 胞 種 に よ っ て は 検 出 限 界 以 下 の 場 合 もあ る1).ま た, トポIIα と異 な り,ト ポIIβ は 細 胞 周 期 に よ る 量 的 な 変 動 も 見 ら れ な い9).こ の よ う な 状 況 下 で トポIIβ の 生 理 機 能 を 明 ら か に す る の は 困 難 で あ っ た.我 々 は 神 経 細 胞 の 分 化 過 程 を解 析 し,神 経 前 駆 細 胞 が 最 終 分 裂 を 終 了 し た 後,神 経 細 胞 に 分 化 す る 時 期 に 一 致 し て ト ポIIβ の 急 激 な 発 現 増 加 が 起 こ り,分 化 の 完 了 と共 に 減 少 す る こ と を 見 出 し12),一 群 の 神 経 特 異 的 タ ン パ ク 質 の 発 現 誘 導 に トポIIβ の 酵 素 活 性 が 必 須 で あ る こ と を 示 し て,こ の 酵 素 が 遺 伝 子 の 転 写 制 御 に深 く関 わ っ て い る こ と を 明 ら か に し た13). 小脳顆粒細胞 の誕生 と分化 成 熟 した小 脳 の皮 質 で は比 較 的 大 き な プ ル キ ンエ細 胞 とサ イズ の小 さい 顆 粒 細 胞 の2種 類 の 神 経 細 胞 が 層 図1  II型DNAト ポ イ ソ メ ラ ー ゼ(ト ポII)の 作 用 機 構 トポIIは ダ イ マ ー を 形 成 し て 二 重 鎖DNAを 捉 え,切 断 す る. 切 断 したDNAの 断 端 に トポIIが 共 有 結 合 し,反 応 中 間 体 で あ るcleavable complexを 形 成 す る.切 断 され たDNAの 間 隙 を他 の 二 重 鎖DNAを 通 過 させ,断 端 を 元 通 り に結 合 し て 次 の サ イ ク ル に 入 る.Berger,JMetal.,Nature vol.379,225-(1996)よ り 改 変 し て 引 用. 状 に 配 列 して い る(図2,P20).ラ ッ トで は,プ ル キ ン エ 細 胞 は 胎 生14日 頃 最 終 分 裂 を 終 了 し て 分 化 を し な が ら移 動 し,小 脳 表 面 の 直 下 に 一 列 に並 ぶ14).と こ ろ が,顆 粒 細 胞 の 誕 生 と分 化 は 脳 の 他 の 神 経 細 胞 と か な り様 相 を異 に して い る.胎 生16日 頃 か ら脳 室 壁 にgermi-nal trigoneと 呼 ば れ る 細 胞 分 裂 の 盛 ん な 部 位 が 出 現 し,こ こ で 生 み 出 さ れ る 細 胞 は 一 時 的 に 細 胞 分 裂 を 停 止 し て(G1期 に 留 ま っ て い る と思 わ れ る),小 脳 表 面 と そ の 直 下 の プ ル キ ン エ 細 胞 と の 間 に 割 り込 む よ う に 移 動 し,胎 生21日 の 出 生 直 前 に は 米 粒 程 度 の 小 脳 の 表 面 を 完 全 に 覆 う 薄 い 細 胞 層(external germinal layer, EGL)を 形 成 す る(図2,NB).EGLを 構 成 す る 細 胞 は 小 脳 顆 粒 前 駆 細 胞(幹 細 胞 の 中 で も分 化 の 程 度 が 進 ん だ も の を 前 駆 細 胞 と 呼 ぶ)と 呼 ば れ,こ の 細 胞 集 団 か ら顆 粒 細 胞 が 生 み 出 さ れ る.出 生 直 前 か らEGLの 小 脳 顆 粒 前 駆 細 胞 は 細 胞 分 裂 を 再 開 し,何 度 か 分 裂 を 繰 り返 し た 後,最 終 分 裂 を行 な っ て細 胞 周 期 を抜 け 出 し, EGL直 下 に 集 積 し て 顆 粒 細 胞 へ の 分 化 を 開 始 す る. Germinal trigoneで 誕 生 し て 小 脳 表 面 を遊 走 し,EGL で 再 び 分 裂 す る 期 間 を通 じ て 検 出 限 界 す れ す れ だ っ た

トポIIβ は,最 終 分 裂 終 了 後 急 激 に 発 現 量 を増 す(図 3).最 終 分 裂 前 後 で トポIIの 発 現 がIIα か らIIβ に 切 り替 わ る 様 は 見 事 で あ る.ト ポIIβ の 発 現 は 分 化 し な が ら小 脳 内 部 に 向 か っ て 移 動 し て い る 細 胞 で 増 加 を 続 け,目 的 部 位 に 到 達 し て 顆 粒 細 胞 へ 分 化 し て い る 細 胞 集 団 で 最 も 高 く な る.ト ポIIβ の 高 発 現 は 小 脳 の 発 育 が 完 了 す る 生 後3週 間 ま で 続 き,そ の 後 低 下 した. ト ポIIβ 発 現 量 の 一 過 性 の 増 加 は ウ ェ ス タ ン ブ ロ ッ トに よ る 定 量 で も 明 瞭 に 示 さ れ,さ ら に顆 粒 細 胞 分 化 の 盛 ん な 時 期 に 一 致 し て トポIIβ の 酵 素 活 性 も上 昇 し て い る こ と が 明 ら か に な っ た13).前 述 の よ う に トポII は 酵 素 と し て 働 く と き,酵 素 一 基 質 反 応 中 間 体(ク リ ー バ ブ ル コ ン プ レ ッ ク ス)を _{形 成 す る .こ の 中 間 体 を} トポII阻 害 剤 で 安 定 化 し,DNAを 分 画 す る と,酵 素 と し て 働 い て い る トポIIを 分 離 す る こ とが 出 来 る.こ の 方 法 で 生 後1日 目 か ら26日 目 ま で の 小 脳 の トポIIβ 活 性 を 詳 細 に 調 べ る と,顆 粒 細 胞 の 分 化 が 最 も盛 ん な 生 後9∼10日 目で 活 性 は ピ ー ク と な り,そ の 後 急 速 に 下 が り,小 脳 が 成 熟 を 完 成 す る 生 後25日 目 に は 検 出 限 界 に ま で 低 下 した.

図2  ラ ッ ト 小 脳 の 生 後 発 育 出 生 直 後{NB)の 小 脳 皮 質 は 表 層 の 外 胚 芽 層(EGL)と 直 下の プ ル キ ン エ 細 胞 層(PL)の み か ら な る が,EGLの 細 胞 が 増 殖 し,内 部 に 向 か っ て 遊 走 し て プ ル キ ン エ 細 胞 層 の ド部 に 顆 粒 神 経 細 胞 層(GL)を 形 成 す る.顆 粒 神 経 細 胞 層 は 生 後 の 発 育 に つ れ て 厚 さ を 増 す.生 後10日 目(P10)の 小 脳 皮 質 は 表 層 か ら 外 胚 芽 層(EGL),分 子層(ML),ブ ル キ ン エ 細 胞 層(PL),顆 粒 神 経 細 胞 層(GL)か ら 形 成 さ れ る.生 後20日 目(P20)ま で に 外 胚 芽 層 は 消 夫 し.表 層 か らML,PL,GLの3層 か ら な る 完 成 し た 小 脳 皮 質 構 造 が 形 成 さ れ る.Altman,J.,J.Comp.NeuroL.vol.136,269-294Ｉ19691よ り改 変 し て 引 用. A B C D E F 図3  小 脳 皮 質 の トポIIア イ ソ フ ォー ム 発 現 細 胞 の 解 析

分 裂 細 胞 を抗PCNA(proliferating cell nuclear an tigen)ポ リ ク ロ ー ナ ル 抗 体 で,ト ポIIア イソ フ ォ ー ム(α と β)発 現 細 胞 を そ れ ぞ れ に特 異 的 な モ ノ ク ロ ー ナ ル抗 体 で 検 出 し たP10ラ ッ ト小 脳 皮 質 の2重 免 疫 組 織 染 色 標 本 を 共 焦 点 レ ー ザ ー 顕 微 鏡 で 観 察 した.EGL

とMLを 示 す.分 裂 細 胞 か ら な るEGLmの 細 胞 で はPCNAと 共 に トホIIα の 発 現 が 見 られ た.最 終 分 裂 を 終 え,EGLmの 直 下に あ つ ま っ た 細 胞 か ら な るEGLdで は,ト _{ポIIα の 発 現 が 停 止 し,入 れ 替 わ り に トポIIβ の 発 現 が 急 激 に増 加 す る.ト ポIIβ の 発現 増 加}

と神 経 細 胞 へ の 分 化 の 開 始 が 一致 した. 神 経 細 胞 分化 と トポIIβ の 役 割 生 後8口 目 の ラ ッ ト小 脳 か ら初 代 培 養 細 胞 を 調 整 す る と,約1週 間in vitroで 神 経 細 胞 へ の 分 化 を 継 続 す る.培 養 期 間 を 通 じて トポIIα の 発 現 は 見 ら れ な い が, ト ポIIβ の 発 現 は 培 養 経 時 的 に 急 速 に 上 昇 す る, EGLd(図3)か ら 小 脳 内 部 の 顆 粒 細 胞 層(図2,GL) に 移 動 し て い る 小 脳 顆 粒 前 駆 細 胞 の 分 化 過 程 を,in vitroで 再 現 した も の と考 え ら れ る.初 代 培 養 顆 粒 神 経 細 胞 は 培 養 開 始 後,神 経 シ ナ プ ス に特 異 的 な タ ン パ ク 質amphiphysin Iの 発 現 を 開 始 し,培 養6日 間 で 発 現 量 が10倍 以 上 に 増 加 す る(図4A）.培 養 初 期 か ら トポ IIの 阻 害 剤,VP-16,あ る い はICRF-193を 培 地 に 加 え て お く とamphiphysin Iの 誘 導 は 抑 制 さ れ た(図4A/. 培 養 後 期 に 阻 害 剤 を 加 え て も 誘 導 抑 制 の 効 果 は 無 く,

ま た,培 養 中 期 に 阻 害 剤 を 抜 く と誘 導 が 開 始 さ れ た 事 か ら,ト ポIIβ 酵 素 活 性 はamphiphysin I遺 伝 子 の 転 写 開 始 に 必 要 で あ る こ とが 示 唆 さ れ た.ノ ー ザ ン プ ロ ッ トに よ り トポIIβ の 調 節 は 転 写 レ ベ ル で 行 わ れ て い る こ とが 明 ら か に な る と 同 時 に,神 経 関 連 遺 伝 子 で あ

106 筒 井 公 子

A

B

a

b

図4  初 代 培 養 神 経 細 胞 で の 神 経 シ ナ プ ス タ ンパ ク 質 発 現 誘 導 を トポII阻 害 剤 が 抑 制 す る

A:神 経 シ ナ プ ス タ ンパ ク質amphiphysin Iは ラ ッ ト小 脳 の 初 代 培 養 顆 粒 神 経 細 胞 で 培 養 初 期 に発 現 が 誘 導 さ れ,培 養 経 時 的 に発 現 が 増 加 す る こ と をWestern blotで 示 した.ト ポII阻 害 剤 で あ るVP-16お よ びICRF-193存 在 下 で はamphiphysin Iの タ ン パ ク 質 発 現 は 抑 制 さ れ た.B:Amphiphysin I(a)とsynaptophysin(b)のmRNAの 発 現 をNorthern hybridizationで 検 出 し た.両 シ ナ プ ス タ ン パ ク質 のmRNAは 培 養 経 時 的 に 増 加 し た が(白 丸),ト ポH阻 害 剤ICRF-193存 在 下 で は発 現 が 抑 制 さ れ た(黒 丸). るsynaptophysinも 転 写 開 始 に トポIIβ を 必 要 とす る こ とが 示 唆 さ れ た(図4B). 分 化 し て い る 神 経 細 胞 で トポIIβ が 転 写 誘 導 を 制 御 し て い る 遺 伝 子 群 を網 羅 的 に 検 索 す る た め,初 代 培 養 1日 目 と5日 目 の 小 脳 顆 粒 神 経 細 胞,お よ びICRF-193 で トポII酵 素 活 性 を 阻 害 し た 条 件 下 で5日 間 培 養 し た 小 脳 顆 粒 神 経 細 胞 か らmRNAを 調 整 し,マ ク ロ ア レイ フ ィ ル タ ー で 遺 伝 子 発 現 プ ロ フ ァ イ ル を 調 べ た.培 養 期 間 中 に 発 現 誘 導 を 受 け た 遺 伝 子 の 内,33%の 遺 伝 子 が トポIIβ の 制 御 下 に あ る こ とが 明 ら か に な っ た13). トポIIβ に よ る 転 写 調 節 の 下 流 に あ る こ れ ら の 遺 伝 子 群 は,イ オ ン チ ャ ネ ル,レ セ プ タ ー や タ ン パ ク 質 リ ン 酸 化 酵 素 な ど,神 経 機 能 発 現 に 関 与 し て い る タ ン パ ク 質 を コ ー ド して い る 遺 伝 子 が 多 か っ た.神 経 細 胞 分 化 過 程 で の トポIIβ の 重 要 な 役 割 を 示 唆 して い る. お わ り に 細 胞 分 化 の 過 程 で様 々 な 遺伝 子 の発 現 誘 導 が 厳 密 な 制 御 下 で進 行 す る の は神 経細 胞 だ け で は ない.発 生 初 期 の胎 児 ラ ッ トで は トポIIβ のmRNAが 胎 児 の殆 ど全 て の部 位 で 高 発 現 して い る15).殆 ど全 て の細 胞 が 遺 伝 子 発 現 誘 導 に トポIIβ を必 要 とす る こ と を示 唆 して い る.し か し,胎 児 期 の こ れ ら の 細 胞 は 分 化 す る と 同 時 に 盛 ん に 細 胞 分 裂 を し て お り,ト ポIIα と トポIIβ が 同 一 の 細 胞 で 同 時 に 発 現 し て い る.ト ポIIα 存 在 下 で は トポIIβ の 機 能 を 明 確 に す る の は 困 難 で あ る.神 経 細 胞 の 分 化 で は 最 終 分 裂 を 終 え た 細 胞 は トポIIα の 発 現 を 停 止 し,こ れ が 合 図 に な っ て い る か の よ う に トポ IIβ の 発 現 量 が 急 速 に 増 加 す る.ト ポIIβ の 細 胞 核 内 で の 役 割 を解 明 す る に は 理 想 的 な 解 析 系 で あ る.ま た, 分 化 し て い る 神 経 細 胞 で トポIIβ の 発 現 量 が 非 常 に 多 い の は,神 経 関 連 遺 伝 子 の 発 現 に トポIIβ の 働 き を必 要 とす る も の が 多 い 事 を 物 語 っ て い る.現 在,ト ポII βの 制 御 下 に あ る 遺 伝 子 の 中 か ら,Rad GTPase(ras-related protein associated with diabetes)遺 伝 子 を モ デ ル 系 と し て 選 択 し,ト ポIIβ に よ る 制 御 の 分 子 機 構 を 解 析 し て い る.神 経 細 胞 で の 遺 伝 子 発 現 制 御 の 新 た な機 構 が 明 らか に な る も の と期 待 さ れ る.

文 献

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