Nagoya City University Academic Repository
学 位 の 種 類 博士 (医学) 報 告 番 号 甲第１７７９号 学 位 記 番 号 第１２５８号 氏 名 Mariyam Akter 授 与 年 月 日 令和 2 年 9 月 25 日 学位論文の題名
Dynamic alteration in the neurogenic potential in the ventricular-subventricular zone of the common marmoset during postnatal development
(生後発達過程のコモンマーモセット脳室下帯におけるニューロン新生の 動的変化)
Cerebral Cortex, in press
論文審査担当者 主査： 飛田 秀樹
Dissertation Summary
The ventricular-subventricular zone (V-SVZ) and the subgranular zone (SGZ) in the hippocampal dentate gyrus produces new neurons throughout life. Most of our knowledge about the fate of these neurons has been obtained using rodent brain due to the ease of their experimental use. Although, the basis of adult neurogenesis is similar among different mammalian species, the extent of neurogenesis and directions of neuroblast migration vary from rodents to primates with a relatively larger and more complex brain. Therefore, studying primate brain are more practical to understand the endogenous neurogenic potential of humans. We demonstrated dynamic changes of the neurogenic potential in the V-SVZ and fate of postnatally born neurons during postnatal development in common marmoset, a New World non-human primate.
Methods
Postnatal day (P) 0-3 (n=8), 1-month (n=11), 2-month (n=3), 4-month (n=3) and 6-month (n=3) and adult (29- to 34-month, n=3) common marmosets (Callithrix jacchus) in a domestic animal colony were used. Animals were deeply anesthetized with isoflurane, perfused transcardially and then cut into 60-μm-thick and 200-μm-thick coronal sections for immunohistochemistry and electron microscopy respectively.
Organization and neuroblast distribution of the V-SVZ during postnatal development The adult marmoset V-SVZ can be divided into two parts: ventrolateral wall (LW), along the lateral walls lining the main body of the lateral ventricle and dorsolateral wall (DW) between the striatum and the corpus callosum that contain the wall delineating a small ventricular space containing the cerebrospinal fluid (DW-open). We also found a dense accumulation of DCX+ neuroblasts in a small area that extended laterally from the dorsal tip of the DW-open, which we refer to as the “extension (EX)”. We observed the V-SVZ and the EX from the section immunostained for DCX and also under electron microscope. The EX contained many neuroblasts at 1 month, and they sharply decreased by 6 months and completely disappeared in the adult. In contrast, DW-open contained chain-forming neuroblasts at all ages examined, even in adulthood. Taken together, these findings show that during postnatal development, the distribution of neuroblasts in the V-SVZ is drastically changed in a region-specific manner.
Migration of V-SVZ neuroblasts toward the postnatal brain parenchyma
We counted the number of DCX+ neuroblasts in the RMS in 1-, 4- and 6-month-old animals and found that addition of new neurons in the olfactory bulb gradually declines with age.
Numerous DCX+ neuroblasts with migratory morphology were observed in the neocortex at 1 month and then those were significantly reduced at 4 and 6 months. In young adult animals (30 months old), no DCX+ neuroblasts were observed in the neocortex. Together, these findings indicate that neuroblast migration toward the postnatal neocortex occurs only during the early neonatal period.
We also found neuroblasts with migratory morphology present in the striatum. They were very sparse at 1 month, sharply increased at 4 and 6 months, and then declined in the adult.
Taken together, our findings indicate that V-SVZ-derived neuroblasts show distinct time-windows for their active migration, depending on their destination.
Spatiotemporal differences in proliferation activity in the postnatal V-SVZ
We compared the density of Ki67+Mash1+ proliferating progenitors in each subregion of the V-SVZ. The Ki67+Mash1+ cell density was similar among the LW, DW and EX at 0 and 1
month; however, it tended to be higher in the DW than in the other regions at 4 months, suggesting that the DW retains neurogenic potential longer than the other areas after birth. Taken together, our findings show that while high neurogenic activity is maintained throughout the V-SVZ for more than a month after birth, it declines with age in an area-specific manner in the postnatal marmoset brain.
The fate of postnatally born neurons
To trace the short-term fate of the postnatally born cells, marmosets were injected EdU every 2 days from P1 to P15 and from P31 to P45, and then fixed at P30 (1 month) and P60 (2 months), respectively. For long term, BrdU were injected three times a day from P1 to P7, followed by EdU injection from P31 to P37 and animals were fixed at 4 or 6 months of age. We investigated the fate of postnatally born neurons in the following regions:
In the olfactory bulb
A large number of BrdU+ neonatal-born and EdU+ 1-month-born new neurons that expressed NeuN, were observed both in the 4- and 6-month olfactory bulbs. In both the neonatal-born and 1-month-born populations, the majority of labeled neurons were distributed in the outer granule cell layer. However, notably, while about 11% of neonatal-born neurons resided in the glomerular layer, very few 1-month-born neurons were observed there.
Therefore, while the number and survival rate of olfactory interneurons are very similar between the neonatal-born and 1-month-born populations, their final destination and differentiation are distinctive.
In the neocortex
The density of 1-month-born neuroblasts was much lower than that of neonatal-born neuroblasts in both 4-month and 6-month neocortex. Moreover, only a few BrdU+ cells, and no EdU+ cells, were found to be positive for NeuN at 4 and 6 months. Taken together, these facts support the notion that while neonatal-born and 1-month-born neuroblasts migrate extensively toward the neocortex, their final destination, and survival rate and maturation potential are altered depending on their birth-date, and all of these appear more limited in 1-month-born cells than neonatal-born cells.
In the striatum
At 2 months, the number of neuroblasts was increased than 1 month, some of which were labeled with EdU. Although there were many DCX+ neuroblasts in the 6-month striatum close to the V-SVZ, we could not find BrdU-labeled neonatal-born or EdU-labeled 1-month-born cells expressing DCX or NeuN. Therefore, at least a fraction of the neuroblasts observed in the striatum during the later postnatal period were generated postnatally. However, they did not stay or differentiate inside the striatum.
Our findings shed light on the capacity and limitations of endogenous neurogenesis in the primate brain.
論文審査の結果の要旨 【目的】 発達を終えた脳内でも、側脳室外側壁の脳室下帯や海馬歯状回では、神経幹細胞・前駆細 胞が増殖し、新たなニューロンを持続的に産生している。齧歯類を用いた多くの研究により、新生ニ ューロンが脳内を活発に移動して、嗅球や脳傷害部で分化・成熟し、脳の可塑性や再生に関与するこ とが明らかになった。一方、近年の死後脳を用いた研究から、ヒト脳では生後のニューロン新生は乳 児期までのごく限られた期間に限定されること、新生ニューロンの一部は大脳皮質に移動することな ど、霊長類に特徴的な生後のニューロン新生の動態が示唆されている。しかし、倫理的側面からヒト 脳の研究手法には限界があり、詳細な解析はできない。本研究では、実験動物として確立された小型 霊長類であるコモンマーモセットを用いて、生後発達期の脳内で産生された新生ニューロンの移動・ 成熟過程を解析し、霊長類脳における生後のニューロン新生の時空間的プロファイルを調べた。 【方法】 本学医学研究科動物実験施設内に樹立したコロニーから得られた新生児(0-3 日齢)、１ヶ 月、2 ヶ月、4 ヶ月、6 ヶ月齢、成体（29-34 ヶ月齢）のコモンマーモセット(Callithrix jacchus)を用い た。一部の個体には、チミジン誘導体である BrdU、EdU（30mg/kg）を腹腔内投与して、新生細胞の 標識を行なった。4％PFA を灌流して固定した脳を用いて切片を作成し、新生ニューロン（Dcx）、神 経前駆細胞（Mash1）、増殖細胞（Ki67）、各種成熟ニューロン・グリア細胞のマーカー、新生細胞 のマーカー（BrdU, EdU）の蛍光免疫染色を行なった。共焦点レーザー顕微鏡を用いて、脳室下帯、 大脳皮質、嗅球、海馬の各領域における細胞分布を定量的に解析した。 【結果】 コモンマーモセット脳内における Dcx 陽性の新生ニューロンの分布・数を新生児期から経時的に解析 し、比較した。1 ヶ月齢までは脳室下帯の全領域に多数の新生ニューロンが分布し、鎖状の細胞塊を 形成していたが、その後急激に減少していき、6 ヶ月以降は背外側壁のみに少数の細胞塊が分布して いた。ヒト新生児脳における報告と同様に、この部位から大脳皮質に向かって移動する新生ニューロ ンが見られた。これらの細胞は、血管への接着、細胞塊の形成などの移動様式が月齢とともに変化し ていた。脳室下帯における細胞増殖は 1 ヶ月齢までは非常に活発で、その後は急激に減少していた。 チミジン誘導体である BrdU を生後 1-7 日に、EdU を生後 31-37 日に投与して標識した新生細胞をの 分布や分化を 4 ヶ月、6 ヶ月齢の脳内で解析した。標識細胞は介在ニューロンに分化して嗅球に定着 していたが、特定のサブタイプ（傍糸球細胞）のニューロンは、新生児期にしか産生されていないこ とが分かった。一方、大脳皮質では、標識細胞はニューロンへの分化途上の未成熟な状態であり、ニ ューロンへの分化速度は脳領域によって異なることが示唆された。BrdU 標識された幼若ニューロン は大脳皮質内の広範囲に、EdU 標識細胞は皮質深層のみに集中して分布していた。このような分布の 差異は、海馬歯状回の新生ニューロンにも見られた。 【結語】 コモンマーモセットの生後脳におけるニューロン新生能力、新生ニューロンのポテンシャルは、領域 や産生時期によって異なるが、出生後 1 ヶ月の間に急激に多様性が低下していくことが分かった。本 研究によって、生後発達期における、霊長類脳に特有のニューロン新生の時空間的プロファイルが明 らかになった。 【審査の内容】 主査の飛田教授から 1）コモンマーモセットの発達過程と月齢の関係、2）Dcx 等のマーカータンパク質 の種差、3)新生細胞の長期追跡時に見られた転写因子 Olig2 を発現する Dcx 陽性細胞の解釈、4）BrdU, UdU の検出方法など 9 項目、第 1 副査の松川教授からは 1）誕生時期依存的な海馬歯状回における新
生ニューロンの分布について、2）本研究の今後の発展性についての 2 項目、第 2 副査の山川教授か ら 1）齧歯類と霊長類であるコモンマーモセットとの遺伝学的な差異、2）生後脳におけるニューロン 新生の障害と疾患の関連性など 3 項目の質問がなされた。これらの質問に対して、申請者は一部答え に窮する場面もあったが、おおむね適切に回答した。以上より、本論文の著者は学位論文の内容を充分 に把握し、また,大学院修了者としての学力を備えていると判断した。本研究は、霊長類の生後発達期 の脳内で産生されるニューロンの挙動を詳細に解析した初めての研究であり、ヒトの脳発達過程の理 解に向けて重要な知見として高く評価される。よって本論文著者は博士（医学）の学位を授与するに 値するものと判定した。 論文審査担当者 主査 飛田 秀樹 副査 松川 則之 山川 和弘
