学位論文題名Analysis of月カ7n51，aDNA Recombinational Repair Geneinthe Rice Blast Fungus

博 士 （ 農 学 ）    ン デ イ ン デ ン サ 1J ア タ ン ガ

     学位論文題名

Analysis of 月カ7n51 ，aDNA Recombinational     Repair Geneinthe Rice Blast Fungus

（ イ ネ い も ち病 菌の DNA 組換 え修復 遺伝 子Rhm51 の解 析）

学位論文内容の要旨

1. Introduction

        Rice Blast Disease caused by Magnaporthe oryzae, is one of the most devastating disease of rice world wide. Mutations in avirulence genes have undermined breeding of blast resistance varieties. Mutation and rearrangement in M. oryzae have been shown to drive genetic variation and evolution at the molecular level (Dean et al, 2005). Increases in homologous recombination (HR)‑mediated events (such as unequal sister‑chromatid exchange (SCE) and ectopic HR between non‑allelic DNA fragments) or in end‑joining between non‑homologous DNA fragments can result in gross chromosomal rearrangements such as translocations, duplications, inversions or deletions. The common substrate of these rearrangement events are DNA double‑stranded breaks (DSBs) (Aguilera & Gomez‑Gonzalez, 2008; Agmon et al, 2009).

The overall objective of this study was to assess the role of homologous recombination in the variability and pathogenicity of M.  oryzae, specifically, the role of the RAD51 homolog, Rhm51 in this respect. RAD51 is the key recombinational repair protein that forms a nucleoprotein fdament that searches for homologous sequences needed for the repair of DSBs in Saccharomyces cerevisiae, human and other eukaryotes.

2. Cloning and sequencing of Rhm51 and analysis of disruption mutants        Sequencing and expression analysis showed that Rhm51 is a single copy gene that was constitutively expressed at low levels during the cell‑cycle and at higher levels when the pathogen came in contact with mutagens. Rhm51 was disrupted in two pathogenic strains of M.

oryzae; Ina168 and Ina86‑137. Deletion mutants of Rhm51 (Arhm51) showed reduced mycelial

growth in normal and DNA damaging media. Conidia formation of Arhm51 was reduced by 94

and 51  % to that of Ina168 and Ina86‑137 respectively and conidia were unable to survive in a

0.3 % MMS (methyl methane sulfonate). Virulence assay by spray inoculation demonstrated

that Arhm51 form fewer lesions on compatible rice cultivars compared to wild‑type. This was

mainly because appressoria formation was also reduced in Arhm51 by 41 and 63 % to that of

       ‑ 289 ‑

Ina168 and Ina86‑137 respectively. These results indicated that Rhm51 is involved in DNA repair, and participates in the growth and pathogenicity development of M. oPyzae.

3. Mechanism of reduced pathogenicity in Arhm51

  '     In order to understand the mechanisms behind the observed phenotypes, cytological observation of Arhm51 was performed.   .

       In M. oryzae, the completion of mitosis during germ tube formatjon? nuclei migration into the appressoria and cell death (autophagy) of the germinated spore is necessary for the :infection‑related morphogenesis: Therefore nuclei of wild type and mutant strains were stained with DAPI (4', 6‑diamidino‑2‑phenylindole), after appressoria formation 24 hours post inoculation (hpi). In Arhm51 mutant, nuclei were still present in the conidia, in contrast to the wild type conidia in which no nucleus was detected.   The result showed that autophagy of the conidia during pathogenicity development was inhibited in Arhm51.        .

       Inhibition of autophagy in Arhm51 raised the question whether cell‑cycle progression was normal or not in other cells. Nuclei distribution and septation was studied by fluorescent microscopy. Propidium iodide (PD and calcofluor white (CW) were used for the staining of nuclei and septa, respectively. The nuclei in wild‑type were dist:inct, compact and brightly coloured demonstrating mitotic nucleiwhereas those in Arhm51 were not distinct, smeared‑like appearance. Septum formation was delayed in Arhm51, as only one basal septum was formed compared to three in wild‑type 10 hpi.

      DSBs, which occur frequently during cell growth, are the substrates of HR repair events.

 Their accurate repa:ir is critical for cell‑cycle progression. DSBs quantified by the neutral comet assay were significantly high in Arhm51 as estimated from the tail moment and the amount of  DNAin comet tail compared to wild‑type where DSBs were absent. These results indicated that cell cycle was arrested in Arhin51 mutants; probably due to the cell cycle checkpoint system that was induced by DSBs that occurred during the growth.

      Reactive oxygen species (ROS), which are important signal molecules for growth and the pathogenicity‑related morphogenesis of M. oryzae, are candidates for the cause of DSBs.

Therefore ROS production was quantified using p‑Nitroblue Tetrazolium (NBT) staining.

 Arhm51 showed low levels of ROS production compared to wild type in vegetative hyphae and appressoria. This may indicate the existence of a negative controlling mechanism of ROS production, which is mediated by unrepaired DSBs.

4. Conclusion

      This study is the first to demonstrate the participation of the key HR repair gene, Rhm51 to growth and pathogenicity of M. oryzae mainly by assuring the accurate repair of DSBs  In addition the study has demonstrated the link between HR repair, ROS production, autophagy, nuclei distribution and septation in filamentous fungi. These results showed that target

‑ 290 ‑

inhibition of Rhm51 might be beneficial not only in controlling rice blast disease but fungal diseases of importance to plant and human.

―291 ‑

学位論文審査の要旨

主 査    准 教 授    曾 根 輝 雄 副 査    教 授    浅 野 行 蔵 副 査    教 授    橋 床 泰 之 副 査 客 員 教 授 鎌 形 洋 一 副 査特任 准教授田中みち子

     学位論文題名

Analysis of Rh7n51 ， aDNA Recombinational     Repair Geneln the Rice Blast Fungus

（イネいもち病菌のDNA 組換え修復遺伝子Rhm51 の解析）

・ 本 論 文 は ， 英 文

142

頁 ， 図

28

， 表

4

，

6

章 か ら な り ， 参 考 論 文

3

編 が 付 さ れ て い る ．

  

イネい もち病 はイネい もち病菌

cVagnaporthe oryzae

の感染によって発生する，イネの最重 要 病害 の

1

つで あ る．いも ち病菌 の非病原 性遺伝 子の変異 は，い もち病抵 抗性イネ 品種を 無 カ化し てしまう ．いも ち病菌に おいて ，突然変 異や染 色体再編 成は遺伝 子の多 様化や進化を も た ら し て い る ． 不 等 姉 妹 染 色 分 体 交 換 や 非 対 立 遺 伝 子 間 の 相 同 組 換 え

(homologous recombination

；HR）や非相同末端再結合（nonーhom010gousendjoining；NHEJ）等が染色体再編成 の要因 と考えら れるが ，これらの共通の開始点はDNAの

2

重鎖切断（doublestrandbreak：

DSB

） である ．本研究 の目的 はいもち 病菌の 可変性や 病原性 に於ける 相同組換 えの役 割，特に酵母 凡4D5｜のいも ち病菌 ホモ口グ である

R

轟

mW

の 役割を 明らかに すること である ．凡4D5Jは酵母 駈cc轟ロ′

0

刪c館ce′evむfロ8，ヒトやその他の真核生物において，DSBの相同組換え修復に必須で あ り， 一 本 鎖DNAと 複合体 フィラメ ントを形 成し相 同配列を 探索す るという 中心的 な役割を 果たす蛋白質である，

1

．

R

轟朋1鉗遺伝子のクローニングと破壊株の性質

R

カmH遺 伝子 は ゲノ ム配列 情報から クローニ ングさ れ，変異 源の処 理によっ てその 転写が強 く誘導 されるこ とがわ からた．

R

轟

mW

遺伝子破 壊株Ina168幺′カmM及びIna86ー

137

ロめmHを作 成した ．これら の遺伝 子破壊株 は生育 速度の低 下，分 生子の形 成量の低 下，相 同組換え能の

―292 ‑

欠如 が確認さ れた． イネに対 する接種 試験で は，病斑 の形成 は認めら れ病原性は保持してい たが ，その病 斑数に 顕著な減 少が見ら れた． この病斑 数の減 少は欠失 変異株の付着器形成が 低 下 した こ と によ る と 考え ら れ た． 以上の ことか ら，Rhm51はイネ いもち病 菌の

DNA

相同組 換え 修復に関 与する 遺伝子で あり，さ らに生 育や病原 性にお いても機 能していることが明ら かとなった，

2. Arhm51

変異株における病原性低下のメカニズムの細胞学的解析

  

イネ いもち病 菌にお いて，病 原性発 現のため の分化（ 付着器 形成）に は，分生子のオート ファ ジー（細 胞死） が必要で あること がわか っている．そこで

thm51

破壊株とその親株の分生 子形成時の核動態を

DAPI

（

4

｜，6‑diamidino‑2‑phenylindole)を用いて可視化したところ，

thm51

破壊 株でオー トファ ジーが阻 害されて おり， 付着器形 成率が 低下して いる一因であることが 示唆 された． ロ

thm51

変異株に おいて 全般的に 細胞周期が異常になっていることが考えられた た め ，栄 養菌 糸中の核 と隔壁 の配置を 観察し たところ ，ロ

thm51

株では 核の輪郭 がはっ きり せず ，有糸分 裂が停 止してい ることが 示唆さ れた．ま た，隔 壁形成に も遅れが見られた．以 上の ことから ，ロthm51変異株 におい ては有糸 分裂が正常に行われず，隔壁形成も遅延するこ と が ， そ の 生 育 の 遅 延 ， 付 着 器 形 成 の 阻 害 の 原 因 で あ る こ と が 示 唆 さ れ た ．

  

ロthm51変異株 の有糸 分裂の異 常は，

DNA

のDSBが蓄 積し，cell‑cycle checkpointが活性化 さ れ たこ と に よる と 考 えら れ た ．そ こで， 核のDSBの定量 を試み た．DSBを中性 コメット ア ッセ イにより 定量し たところ ，Arhm51変異 株で顕著 な蓄積 が認めら れた，また，GFPーRhm51 融 合 夕ン バク 質を発現 させる ことによ り，DSBを螢光 夕ンバク の凝集

(foci)

として 可視化す る こ とで ，野 生株の栄 養成長 ，付着器 形成， イネ感染 時の侵入 菌糸に おいても

DSB

を 検出す るこ とに成功 した． さらにロ

thm51

変 異株では 栄養菌糸と付着器において内因性の活性酸素種

(reactive oxygen species; ROS)

産生量の低下が観察された，

DSB

の蓄積によりROSの産生量が低 下する調節機構の存在が示唆された，

  

本研 究 は，い もち病菌 の生活 環におい てDNAの切断が 起こっ ており， 相同組換 え修復 によ り 修 復 が行 わ れ てい る こ とを 明 ら かに し た ，相 同 組 換え 修 復 に 関与 す る 主要 因 子 であ る

Rhm51

がイネい もち病 菌の生育 と病原 性に関与 すること から，

Rhm51

を特 異的に阻害すること に よ り， イネ いもち病 の防除 にっなが る可能 性を示し た．また ，いも ち病菌の

DNA

切 断を可 視化 する技術 を構築 した，こ れらの成 果は植 物病理学 的に重 要なもの である．よって審査員 一同 は，

Ndindeng Sali Atanga

が博士（農学）の学位を受けるに十分な資格を有するものと認 めた．

    

―293―