環境水由来レジオネラ属菌の選択培地による効率的検出法の検討1）

序 文

環境水中の

属菌を選択的に分離して その菌数を測定するには，検水中に混入している

Legionella

属菌以外の菌を除去しなければならな

い．そのため， 「レジオネラ症防止指針」

および 「新 版レジオネラ症防止指針」

では，酸または熱によ る検水の前処理法が採用されている．我々は環境

水中から分離された

属菌およびそれ以 外の細菌を用いて，これらの前処理法による各菌 の発育について検討し，検水の熱処理後に酸処理 を組み合せる前処理法により，

属菌の発 育に対してはほとんど影響せず，

属菌の 菌数測定時に環境水中から分離される構成比率の 高いグラム陰性桿菌の

お

よび

spp.を効率よく除去できること

を報告した

．その後，この前処理法，すなわち，

検水の遠心濃縮液を 50℃ で 20 分間熱処理した 後，0.2M HCl-KCl 緩衝液（pH 2.2）を添加する酸

環境水由来レジオネラ属菌の選択培地による効率的検出法の検討

1）株式会社田辺 R&D サービス東京分析部，^2）栄研化学株式会社生物化学研究所

春日 修

三沢 均

高木紀美子

谷 佳都

池戸 正成

（平成 13 年 6 月 20 日受付）

（平成 13 年 10 月 4 日受理）

Legionella属 菌 の 培 地 上 で の 発 育 至 適 pH を 調 べ る た め に，pH を 0.5 間 隔 で 6.0〜8.0 に 調 整 し た BCYEα寒天培地，WYOα寒天培地および MWY 寒天培地を用い，それぞれの培地での菌の発育状態を 比較検討した．Legionella pneumophilaの 2 株およびL. micdadei1 株の発育は，選択培地の WYOα寒天培 地において，pH6.5 と 7.0 以外では著しく影響を受け，両選択培地は非選択培地の BCYEα寒天培地と比 べ，発育至適 pH の狭いことが確認された．選択培地組成中の vancomycin（VCM）添加濃度の影響を検 討した結果，Legionella属菌の中にはその濃度に依存して発育が抑制される菌株があり，それらの発育抑 制の程度は菌種および菌株により異なることが確認された．同様に，Legionella属菌以外の菌についても VCM 添加濃度が選択性に影響することから，用いる選択剤の量は検水中のLegionella属菌の種類やそれ 以外の菌の種類によって使い分ける重要性が示唆された．Legionella属菌の検出におよぼす抗真菌剤 amphotericin-B（AMPH-B）の効果を MWY 寒天培地に添加して検討した．AMPH-B はLegionella属菌 の発育にはほとんど影響せず，冷却塔水中から分離された糸状菌のAspergillussp.，Trichodermasp.，Scole-

cobasidiumsp.およびMucorsp.に対して，80µg!ml の添加濃度で顕著な発育抑制効果を示した．さらに，

分離糸状菌の 4 株とLegionella属菌 3 株を用いた各 1 株づつの混合培養において，培地中に AMPH-B を 80µg!ml 添加することにより糸状菌の発育が抑制され，その結果として，Legionella属菌が効率的に検 出されることを見出した．

〔感染症誌 76：41〜50，2002〕

要 旨

別刷請求先：（〒335―8505）埼玉県戸田市川岸 2―2―

50

株式会社田辺 R&D サービス東京分析部

春日 修

Key words： Legionella, selective medium, environmental water

処理を組み合わせる方法により，検水中に混在し て い る

属 菌 以 外 の 菌 を 除 去 し，Le-

gionella

属菌の効率的な生菌数計測を実施してき

た．一方，

属菌以外の菌の除去を目的と して，すでにいくつかの分離選択培地が工夫され 市販されている．これら各種の分離培地には，環 境水，とくに冷却塔水中の

属菌の検出 において，それぞれに特徴を有していることが示 されている

．前報

では， 市販選択培地の特性を 環境水から分離された各種菌株を用いて確認し，

一部の培地，とくに，WYO

寒天培地が

属菌以外の菌の除去に加えて，

属菌に対 しても発育を抑制する可能性のあること，また，

10 種類の抗菌薬について，Legionella 属菌とそれ 以外の細菌に対する感受性試験を行い，市販選択 培地に使用されている polymixin-B の添加量につ

いては，

属菌の発育には影響を与えず，

一般細菌の発育を効果的に抑制することを報告し た．そこで，このような

属菌の発育抑制 に対する選択培地の特性を明らかにするため，培 地 pH および培地に添加する選択剤のうち vanco- mycin （VCM） の影響について検討した． さらに，

冷却塔水からの

属菌の検出に抗真菌剤 として anisomycin を使用している MWY 寒天培 地を用いた場合，糸状菌の発育により

属菌が分離できない例を日常業務中に多く経験し た．そこで，WYO

寒天培地に添加されている amphotericin-B（AMPH-B）を MWY 寒天培地に 添加して糸状菌に対する抑制作用を確認した．ま た，AMPH-B を添加した MWY 寒天培地に糸状 菌と

属菌を混合培養し，Legionella 属菌 に対する影響と糸状菌の抑制を確認した．それら の結果から，選択剤を添加した培地では

属菌の発育至適 pH が狭いこと，選択剤として添 加されている VCM は一部の

属菌の発 育を阻害するものの，

属菌以外の菌，特 にグラム陽性菌に対して抑制効果のあることが確 認できた．また，AMPH-B は糸状菌の発育抑制に 効果を示し，MWY 寒天培地にこれを添加するこ とにより，

属菌の発育に影響することな く選択性を高めることが確認できた．

材料と方法

1．試験菌株

使用した菌株とその由来を Table 1 に示した．

環境水中からの細菌および糸状菌は 1999 年 5 月 か ら 2000 年 6 月 ま で に 入 手 し た 冷 却 塔 水 中 の

Legionella

属菌の菌数測定時に，分離選択培地上に

発育してきたグラム陽性菌 7 株およびグラム陰性 菌 6 株ならびに糸状菌 10 株の計 23 株である．こ れらの菌株の分離は，検水を遠心濃縮し，50℃，

20 分間の熱処理の後，同量の 0.2M HCl-KCl 緩衝 液 （pH 2.2） を加えて，さらに 25℃，4 分間処理し，

その処理液を MWY 寒天培地（OXOID）平板に塗 布して 37℃，5 日間培養することにより行った．

平板上に発育してきた細菌および糸状菌集落を分 離し，細菌は市販同定キットにより，糸状菌は培 養所見ならびに形態学的観察により同定した．い ずれの菌株も検水の採取場所および時期などから 由来の異なると思われるものを選んだ．

2．各培地での生菌数測定

試験菌株のうち，Legionella 属菌は BCYE 寒天 培地（OXOID）で 37℃，5 日間，それ以外の細菌 は標準寒天培地（栄研化学）で 18〜20 時間培養し た集落を，滅菌水に McFarland No. 1 （約 10

CFU

!

ml）に懸濁し，それを約 10

CFU

ml になるよう に希釈したものを試験懸濁液として用いた．糸状 菌はポテトデキストロース寒天培地（PDA，栄研 化学）の斜面培地で 25℃，5 日間培養した集落の 分生子を滅菌水に懸濁し，Burker-Turk の血球計 算板により分生子数を測定し，約 10

CFU

ml に なるように希釈したものを試験懸濁液として用い た．これらの試験懸濁液 0.1ml を各平板培地上に 接種し，コンラージ棒で均一に展開した．所定の 条件で培養後，平板培地表面に発育した集落数を 計測し，平板 2 枚の平均値として表示した．培養 条件は，培地 pH の検討を除いてすべて

属菌は 5 日間，それ以外の細菌は 18〜24 時間，糸 状菌は 5 日間，いずれも 37℃ で行った．

3．培地 pH の検討

BCYE

寒天培地と WYO

寒天培地は奥田ら

の記載に準じて調製し，培地の最終 pH がそれぞ

れ 6.0， 6.5， 7.0， 7.5， お よ び 8.0 に な る よ う に pH

Table 1 List of 32 strains and their descriptions used

The 7 strains of Legionella species

ATCC^a 33152 serogroup 1

Legionella pneumophila 3677

ATCC 33156 serogroup 4

Legionella pneumophila 3681

ATCC 33217 Legionella bozemanii

3684

ATCC 33218 Legionella micdadei

3685

ATCC 33279 Legionella dumoffii

3686

ATCC 33297 Legionella gormanii

3687

ATCC 33462 Legionella longbeachae

3689

The 2 strains of reference organisms

FDA^b 209P JC-1 Staphylococcus aureus

5084

NIHJ^c JC-2 Escherichia coli

5079

The 23 strains isolated from cooling tower water Staphylococcus sp.

RB114

Staphylococcus sp.

RB232

Corynebacterium aquaticum RB002

Corynebacterium aquaticum RB005

Corynebacterium aquaticum RB007

Corynebacterium aquaticum RB250

Corynebacterium aquaticum RB1H2

Pseudomonas alcaligenes RB003

Sphingobacterium multivorum RB006

Pseudomonas pseudoalcaligenes RB025

Acinetobacter sp.

RB106

Moraxella sp.

RB125

Pseudomonas picketti RB242

Aspergillus sp.

RF001

Aspergillus sp.

RF002

Aspergillus sp.

RF003

Aspergillus sp.

RF010

Aspergillus sp.

RF020

Aspergillus sp.

RF029

Aspergillus sp.

RF033

Tricoderma sp.

RF017

Scolecobasidium sp.

RF030

Mucor sp.

RF036

a : American Type Culture Collection

b : Food an Drug Admistration

c : National Institute of Health, Japan

メ ー タ を 用 い て 調 整 し た．MWY 寒 天 培 地 は growth supplement（OXOID）溶液をそれぞれの 最終 pH になるように調整して調製した．これら の培地に

3677 株，3681 株と

dadei

3685 株の試験懸濁液を接種し，3，6，9 および

11 日後の集落数を計測した．

4．選択剤の検討

1）Vancomycin（VCM）の添加量の検討 WYOα 寒天培地組成のうち，VCM を 0（無添

加），1.25， 2.5， 5

g

ml（現処方）に添加した培地を 作製した．また，同様に BCYE 寒天培地に VCM を添加し，MWY 寒天培地は VCM の添加量を 1

g

ml（現処方）および 5

g

ml に添加した培地を 作製した．これらの培地に Table 3 に記載した

gionella

属 7 菌株の試験懸濁液を接種し，平板上に

発育した集落数を計測した．また，VCM の選択効 果を確認するため，WYO

寒天培地（VCM：5

g

!

ml）と MWY 寒天培地（VCM：1µg! ml）に冷却

Table 2 Viable counts of 3 strains of Legionella spieceis on the selective agar plate adjusted at various pH Growth（CFU/plate） at the incubation days

pH

Strain BCYEα agar WYOα agar MWY agar

11 9 6 3 11 9 6 3 11 9 6 3

    4     4     0     0     0     0     0     0     0     0     0     0 6.0 L. pneumophila 3677

（serogroup 1）

194 194 192   12 180 180 179   17 244 244 238 189 6.5

206 206 202 148   10   10     5     0 236 236 236 213 7.0

104 104 104   40     0     0     0     0 161 161 161 105 7.5

    0     0     0     0     0     0     0     0     2     2     2     0 8.0

    4     0     0     0     0     0     0     0     0     0 0     0 6.0 L. pneumophila 3681

（serogroup 4）

304 298 296     6 265 265 212     0 382 382 379 338 6.5

256 254 254   86 254 254 254     6 288 288 287 276 7.0

152 150 150   34     0     0     0     0 177 177 177 146 7.5

    0     0     0     0     0     0     0     0     0     0     0     0 8.0

    0     0     0     0     0     0     0     0 246 246 192     0 6.0 L. micdadei 3685

259 256 253   25 242 242 240 233 361 361 361 341 6.5

255 255 251   82 200 200 199 180 311 310 308 299 7.0

  33   33   30     0     0     0     0     0   28   28   25     0 7.5

    0     0     0     0     0     0     0     0     0     0     0     0 8.0 Incubation : 37℃.

Table 3 Influence of vancomycin in the selective media on the growth of Legionella sp.

Growth（CFU/plate）

Strain Concentrations of vancomycin（μg/ml）

MWY agar（pH6.7）

WYOα agar（pH6.7）

BCYEα agar（pH6.9）

5.0 1.0

5.0 2.5

1.25 0

5.0 2.5

1.25 0

4.5 × 10² 7.4 × 10²

4.0 × 10² 6.3 × 10²

8.2 × 10² 8.4 × 10²

7.1 × 10² 9.2 × 10²

1.1 × 10³ 1.3 × 10³

L. pneumophila 3677

（serogroup 1）

4.6 × 10² 4.4 × 10²

3.4 × 10² 3.8 × 10²

3.2 × 10² 2.8 × 10²

4.5 × 10² 4.8 × 10²

5.0 × 10² 6.9 × 10²

L. pneumophila 3681

（serogroup 4）

3.7 × 10  6.2 × 10 

2.7 × 10  3.4 × 10 

4.8 × 10  6.6 × 10 

1.2 × 10  1.5 × 10 

4.4 × 10  2.2 × 10²

L. bozemanii 3684

1.7 × 10² 1.7 × 10²

5.6 × 10  1.1 × 10²

5.3 × 10  6.2 × 10 

1.4 × 10² 1.5 × 10²

1.5 × 10² 1.8 × 10²

L. micdadei 3685

1.9 × 10² 2.7 × 10²

1.4 × 10² 2.2 × 10²

2.2 × 10² 2.7 × 10²

1.3 × 10² 1.2 × 10²

1.2 × 10² 1.4 × 10²

L. dumoffii 3686

3.5 1.9 × 10 0

0 0

3.0 × 10  4.2 × 10²

4.7 × 10² 4.6 × 10²

5.0 × 10² L. gormanii 3687

5.1 × 10² 7.3 × 10²

6.2 × 10² 4.8 × 10²

5.0 × 10² 7.9 × 10²

1.4 × 10² 1.7 × 10²

2.0 × 10² 2.5 × 10²

L. longbeachae 3689 Incubation : 37℃ for 5 days

塔水から分離した

属菌以外のグラム陽 性菌 8 株，グラム陰性菌 7 株（Table 4）の試験懸 濁液を接種し，発育した集落数を計測した．対照 培地として，

属菌は BCYE 寒天培地を，

それ以外の菌には標準寒天培地を用いた．

2）Amphothericin-B（AMPH-B）の添加の検討 MWY 寒天培地に，AMPH-B を 0 （無添加） ，40，

80 および 160

g

ml に添加した培地を作製した．

Legionella

属菌に対する AMPH-B の影響を試験す

るため，これらの培地に Table 5 に記載した

gionella

属 7 菌株の試験懸濁液を接種し，平板上に

発育した集落数を計測した．また，糸状菌に対す

る抑制効果を試験するため，冷却塔水から分離し

た糸状菌 10 株（Table 6）の試験懸濁液を接種し，

Table 4 Growth of co-existing microbe strains on the selective media refered to standard agar

Growth（CFU/plate）

Strain^a

MWY agar WYOα agar

Standard agar

4.3 × 10² 0

7.3 × 10² Staphylococcus sp. RB114

7.7 × 10² 0

1.2 × 10³ Staphylococcus sp. RB232

1.7 × 10² 0

5.9 × 10² Corynebacterium aquaticum RB002

2.5 × 10² 0

9.0 × 10² Corynebacterium aquaticum RB005

5.7 × 10² 0

7.3 × 10² Corynebacterium aquaticum RB007

2.4 × 10² 0

3.1 × 10² Corynebacterium aquaticum RB250

5.5 × 10² 0

7.6 × 10² Corynebacterium aquaticum RB1H2

0 0

5.2 × 10² Staphylococcus aureus. 5084

2.2 0

1.5 × 10⁵ Pseudomonas alcaligenes RB003

6.0 × 10² 2.5 × 10²

5.4 × 10² Sphingobacterium multivorum RB006

1.1 × 10² 0

5.2 × 10² Pseudomonas pseudoalcaligenes RB025

1.6 × 10² 1.2 × 10 

1.2 × 10² Acinetobacter sp. RB106

2.5 × 10² 2.5

8.6 × 10³ Moraxella sp. RB125

1.4 × 10² 0

1.6 × 10² Pseudomonas picketti RB242

1.5 0

2.0 × 10² Escherichia coli 5079

Incubation : 37℃ for 2 〜 5 days

a : The strains were isolated from cooling tower water samples together with Legionella sp.

Table 5 Influence of amphotericin B in MWY agar on the growth of Legionella sp.

Growth（CFU/plate）

Strain Concentration of amphotericin B（µg/ml）

160 80

40 0

2.0 × 10³ 2.9 × 10³

2.9 × 10³ 2.5 × 10³

L. pneumophila 3677

（serogroup 1）

1.9 × 10³ 2.7 × 10³

2.4 × 10³ 2.1 × 10³

L. pneumophila 3681

（serogroup 4）

2.8 × 10² 1.9 × 10²

1.3 × 10² 1.7 × 10²

L. bozemanii 3684

2.9 × 10³ 2.3 × 10³

3.6 × 10³ 3.1 × 10³

L. micdadei 3685

2.0 × 10³ 2.3 × 10³

2.9 × 10³ 3.5 × 10³

L. dumoffii 3686

9.6 × 10  9.6 × 10 

9.3 × 10  1.4 × 10²

L. gormanii 3687

3.8 × 10³ 4.5 × 10³

4.5 × 10³ 4.6 × 10³

L. longbeachae 3689 Incubation : 37℃ for 5 days

集落数を計測した．この際，対照として WYO

寒天培地と PDA を同時に試験した．また，実際の 検体からの

属菌の検出を想定して，L.

pneumophila

2 菌株，L. micdadei 1 菌株と冷却塔水 から分離した糸状菌 4 株を各々混合し，AMPH- B を添加した MWY 寒天培地での培養を行った

（Table 7） ．それぞれの試験懸濁液を等量混合した もの 0.1ml を各培地に接種して培養後，平板上に

発育した各菌の集落数を計測した．接種菌量は混 合前の試験懸濁液を測定して算定した．

成 績

1．Legionella 属菌の生育におよぼす 選 択 培 地 pH の影響

培 地 の pH を 0.5 間 隔 で 6.0〜8.0 に 調 整 し た

BCYE

寒天培地，WYO

寒天培地および MWY

寒天培地での

属菌の発育状態を培養日

Table 6 Effect of amphotericin B in the selective media on the growth of co-existing fungus strains

Growth（CFU/plate）

Strain^a Concentration of amphotericin B（µg/ml）

Potato-dextrose 

agar MWY agar WYOα agar

80 80

40 0

3 2.0 × 10

1.9 × 10² 1.9 × 10²

1.8 × 10² Aspergillus sp. RF001

0 0

2.3 × 10  1.6 × 10²

2.0 × 10² Aspergillus sp. RF002

0 0

5.1 × 10  1.8 × 10²

1.9 × 10² Aspergillus sp. RF003

0 0

1.7 × 10² 1.8 × 10²

1.6 × 10² Aspergillus sp. RF010

0 0

0 7.1 × 10 

1.3 × 10² Aspergillus sp. RF020

0 0

3.5 × 10  1.7 × 10²

2.8 × 10² Aspergillus sp. RF029

0 0

7.9 × 10  2.1 × 10²

2.1 × 10² Aspergillus sp. RF033

0 0

4.6 × 10  1.8 × 10²

2.1 × 10² Trichoderma sp. RF017

0 0

0 2.0 × 10²

1.4 × 10² Scolecobasidium sp. RF030

0 0

8.9 × 10  over growth

  5 × 10² Mucor sp. RF036

Incubation : 37℃ for 5 days

a : The strains were isolated from cooling tower water samples together with Legionella sp.

数による生菌数変化として検討し，その結果を Table 2 に示した．選択剤を含有しない BCYE

寒天培地では供試した

属菌 3 株とも最 も出現集落数が多かったのは pH 6.5 であり，次い で pH 7.0 であった．いずれの菌株でも 6 日間の培 養でほぼ最高集落数に達したが，pH 6.5 と 7.0 で は 3 日間の培養で 80％ 以上の集落数に達した．

pH 6.0 で は

2 株 は 11 日 間 の 培 養 でも集落は認められなかったが，L. micdadei 3685 では，6 日後に最高集落数（pH 6.5）の約半数の集 落が出現した．培地の pH が 8.0 で は

phila

3677 がわずかに発育したのみで，他の 2 株

は全く発育しなかった．選択培地の WYO

寒天 培地では，BCYE

寒天培地と同様に pH6.5 が最 も出現集落数が多かった．最高集落数に達するの に要する培養時間は，

2 株は 6 日間 を要し，

3685 は 3 日目で最高集落数に 近い発育 を 認 め た．L. pnemophila 3681 と

3685 は pH 7.0 で，pH 6.5 とほぼ同数の集落 が発育したが，L. pneumophila 3677 はわずかに発 育したのみであった．一方，pH 6.0 と pH 7.5， 8.0 では試験した 3 株とも 11 日間の培養でも発育を 認めなかった．MWY 寒天培地では供試した

gionella

属菌 3 株とも 3 日間培養において発育菌

数が少なく，WYOα 寒天培地と同様に選択剤不含

の BCYE

寒天培地に比べて発育速度が遅い傾向 を示した．L. pnemophila 3681 は pH 6.5 で最高の 発育菌数を示したが，他の 2 株は pH 6.5 と pH 7.0 でほぼ同数に発育した．また，pH 7.5 において，

供試 3 株は各最高菌数の 10〜50％ が発育し， これ ら の 発 育 pH 域 は BCYE

寒 天 培 地 よ り も 狭 い が，WYOα 寒天培地よりも広いことが明らかに なった．

2．Legionella 属菌の検出におよぼす選択培地中 の VCM 濃度の効果と影響

Legionella

属菌の発育に対する VCM 濃度の影

響 を BCYE 寒 天 培 地，WYO

寒 天 培 地 お よ び MWY 寒天培地の基礎培地に添加して検討し，そ の結果を Table 3 に示した．BCYE 寒天培地では VCM 添加（1.25〜5.0

g

ml）により，L. bogemanii 3684 の 発 育 は 5〜20％ に 減 少 し た．L. pneumo-

3677 ，L. pneumophila 3681 および

beachae

3689 は VCM の添加濃度によって抑制さ

れる傾向を示し，5

g

ml 添加で 50〜60％ に減少 した．WYO

寒天培地の場合，

3689

を除く

属菌 6 株は VCM の無添加にお

いても，BCYE 寒天培地の無添加に比べてその発

育集落数は 10〜70％ に減少した．L. pneumophila

3677，L. bozemanii 3684 および

3686 は

VCM の添加濃度に従い，発育が抑制される傾向

Table 7 Effect amphotericin B in MWY agar on the growth of Legionella sp. and fungi in the mixed culture Growth（CFU/plate）

Strain

（Legionella sp. ＋ fungus） Concentration of amphotericin B（µg/ml）

Inoculum size ^＊

80 40

0

2.1 × 10² 0

0 5.2 × 10²

L. pneumophila 3677（serogroup 1）

2.0 × 10  1.8 × 10²

2.5 × 10² 5.5 × 10²

  ＋ Aspergillus sp. RF001

3.8 × 10² 7.5 × 10²

0 5.2 × 10²

L. pneumophila 3677（serogroup 1）

0 4

1.5 × 10² 8.2 × 10²

  ＋ Aspergillus sp. RF020

3.8 × 10² 7.5 × 10²

0 5.2 × 10²

L. pneumophila 3677（serogroup 1）

0 1

3.2 × 10² 4.9 × 10²

  ＋ Trichoderma sp. RF017

5.1 × 10² 4.2 × 10²

0 5.2 × 10²

L. pneumophila 3677（serogroup 1）

0 2

Over growth   5.0 × 10^2＊ ＊

  ＋ Mucor sp. RF036

7.1 × 10² 1.1 × 10²

0 1.5 × 10³

L. pneumophila 3681（serogroup 4）

15 9.3 × 10 

3.5 × 10² 5.5 × 10²

  ＋ Aspergillus sp. RF001

1.0 × 10³ 9.7 × 10²

0 1.5 × 10³

L. pneumophila 3681（serogroup 4）

0 1

1.8 × 10² 8.2 × 10²

  ＋ Aspergillus sp. RF020

1.1 × 10³ 1.1 × 10³

0 1.5 × 10³

L. pneumophila 3681（serogroup 4）

0 0

3.0 × 10² 4.9 × 10²

  ＋ Trichoderma sp. RF017

1.0 × 10³ 1.1 × 10³

0 1.5 × 10³

L. pneumophila 3681（serogroup 4）

0 6

Over growth   5.0 × 10^2＊ ＊

  ＋ Mucor sp. RF036

7.6 × 10² 5.5 × 10 

0 1.1 × 10³

L. micdadei 3685

8 2.1 × 10²

2.9 × 10² 5.5 × 10²

  ＋ Aspergillus sp. RF001

7.3 × 10² 9.1 × 10²

0 1.1 × 10³

L. micdadei 3685

0 1

1.9 × 10² 8.2 × 10²

  ＋ Aspergillus sp. RF020

8.6 × 10² 7.6 × 10²

0 1.1 × 10³

L. micdadei 3685

0 0

2.9 × 10² 4.9 × 10²

  ＋ Trichoderma sp. RF017

6.9 × 10² 7.4 × 10²

0 1.1 × 10³

L. micdadei 3685

0 3

Over growth   5.0 × 10^2＊ ＊

  ＋ Mucor sp. RF036 Incubation : 37℃ for 5 days

  ＊  : Legionella sp. : BCYE agar ; fungus : potato-dextrose agar

＊ ＊  : Numbers of spore by microscopy

を示し，

3681，L. micdadei 3685 およ び

3689 はその影響がほとんど見ら れ な か っ た．L. gormanii 3687 は 試 験 し た VCM の最少の 1.25

g

ml の添加量でも発育が認められ な か っ た．MWY 寒 天 培 地 を 用 い て 検 討 し た VCM 濃度の影響は，L. gormanii 3687 がわずかで はあるが 5.0

g

ml の VCM 濃度で発育が確認で きた以外，全試験菌株とも WYO

寒天培地の成 績とほぼ同様の傾向を示した．

冷却塔水中から分離されたグラム陽性菌 7 株お

よびグラム陰性菌 6 株，参考菌株として

5084 お よ び

5079 を

用い，WYO

寒天培地（VCM：5

g

ml），MWY

寒天培地（VCM：1

g

ml）および対照培地として

標準寒天培地における各菌の発育菌数を Table 4

に示した．グラム陽性菌は，WYO

寒天培地で供

試した全菌株が発育を抑制されたが，MWY 寒天

培地では参考菌株として用いた

5084 以

外の冷却塔水由来の分離株 7 株すべてが発育を認 めた．標準寒天培地における菌数との比較では

の RB 002 および RB 005 は 30％ 以下であり，その他の株はほぼ同数で あ っ た．グ ラ ム 陰 性 菌 は，WYOα 寒 天 培 地 で

RB006 の 菌 数 が 46

％に 減 少 し，Acinetobacter sp. RB106 お よ び

sp. RB125 は 10％ 以下に減少した．また，

Pseudomonas pseudoalcaligenes

RB025，

RB003，

RB242 および

5079 の発 育は完全に抑制された．MWY 寒天培地では，参考 菌株を含むすべての菌株で発育を認め，そのうち

5079 および

RB003 は 1％ 以 下 に，Moraxella sp. RB125 お よ び

genes

RB025 は 20％ 以下に減少した．その他の分

離株はほとんど抑制をうけなかった

3．Legionella 属 菌 の 検 出 に お よ ぼ す MWY 寒 天培地中の AMPH-B 濃度の効果と影響

MWY 寒天培地への AMPH-B の添加は，試験 し た

属 菌 7 株 と も 最 高 濃 度 の 160

g

ml でもほとんど発育に影響を与えなかった（Ta- ble 5） ．

Table 6 に，分離糸状菌 10 株に対する AMPH- B の発育抑制効果を示した．MWY 寒天培地 に AMPH-B の 40

g

ml を添加することにより，10 株中 6 株は 20％ 以下の菌数に減少し，80

g

ml 添加ではほとんどの菌株が完全に抑制された．ま た，AMPH-B が 80

g

ml 添加されている WYO

寒天培地では

sp. RF001 がわずかに発 育したのみで全菌株の発育が抑制された．

Legionella

属菌 3 株および糸状菌 4 株を用いた

12 種の混合培養におけるそれぞれの菌の生菌数 測定結果を Table 7 に示した．AMPH-B の無添加 培地では，いずれの組み合わせ培養においても糸 状菌は平板培地表面全体に発育し，

属菌 の発育は認められなかった．AMPH-B 濃度が 40

g

ml では，Aspergillus sp. RF001 の発育が十分 抑制されずこの株を組み合わせた 3 つの系では，

混合した

の検出が困難で，1 例で

はまったく検出されなかった．AMPH-B を 80

g

!

ml 添加した培地では，

sp. RF001 と組

み合わせた系で，いずれも少数の糸状菌が発育し

たが，各

属菌は容易に検出でき，他の 2

種類の糸状菌と組み合わせた系では，すべて糸状 菌の発育が完全に抑制され，各

属菌は 良好に発育した．

考 察

近年の免疫抑制宿主の増加傾向やライフスタイ ルの変遷などにより，今後は

属菌が呼 吸器感染症の主要な原因菌になるであろうと Ad- ams

は予測している．Legionella 属菌は培養によ る検出困難な細菌であることから，臨床的には，

より迅速で，直接的な診断法が求められ，免疫化 学的あるいは遺伝子による迅速検出法が進展して きている．しかし，Doern

は，

属菌を含 む培養困難な細菌の感染症診断であっても，これ らの迅速検出法は初期の診断に利用し，培養法を 用いた原因菌の確認は感染症の診断には欠くこと ができないと強調している．我々も，感染症診断 には感染部位に生存する原因菌の確認が重要であ ると考え，

属菌の培養法による検出につ いて検討してきた．前報

では，環境水中から分離

された

属菌を用いて各種選択培地にお

ける発育状態を比較し，WYOα 寒天培地で発育し た菌数が MWY 寒天培地での菌数に比べて 1

4〜

1

20 に抑制されることを報告した．その理由には 両者の培地組成や分離された菌株の性状の違いな どが考えられる．Legionella 属菌の発育は培地 pH により厳しい制限を受けるとされている． 奥田ら

は BCYE 培地および WYO 培地における発育至 適 pH を各種の

属菌を用いて詳細に検 討し，pH 6.6〜7.0 の範囲では菌の発育支持力に明 らかな差が認められなかったとしている．今回，

より広域な pH 範囲における菌の発育を BCYE

寒天培地，WYO

寒天培地および MWY 寒天培 地を用いて比較した結果，

属菌は選択剤 を含有する WYO

寒天培地において，その発育 が著しく影響をうけ，きわめて狭い pH 範囲でし か発育できないことが明らかになった．したがっ て，選択剤を含有する培地の自家調製にあたって は，pH 調整の厳密な管理の重要性が示唆された．

さらに，

属菌の中には，選択剤を含有す

る培地で，培養 6 日以降に生菌数が安定して計測 される菌株が認められたことから，選択培地を用

いる

属菌の検出には，37℃，6 日以上の

培養が適当と考えられた．

WYOα 寒天培地には選択剤として，VCM が 5.0

g

ml 添加されている．この濃度は MWY 寒天培 地の 1.0

g

ml に比べると 5 倍の濃度である．Le-

gionella

属菌の発育に対する VCM の添加量の影

響を検討した結果，Table 3 に示したように，発育 抑制の程度は

属菌の菌種および菌株に よって異なるが，VCM の添加濃度により影響を うける菌株のあることが確認された．一方，環境

水中から

属菌の検出時に MWY 寒天培

地で発育してきた

属菌以外の細菌の中 には，WYO

寒天培地によって効率よく抑制され ることをすでに認めている

．とくに， グラム陽性 菌は WYO

寒天培地では効果的に抑制され，さ らに今回の結果では，グラム陰性菌の中にも発育 が抑制される菌株が見出された（Table 4） ．Leoni ら

は給湯水からの

属菌の分離培地を 比較し，VCM を 5.0

g

ml 含有する GVPC 培地に おいて，最も高い検出率が得られたと報告してい る．選択培地中に含まれる抗菌剤の種類と濃度は 試験材料中に混在している

属菌以外の 菌の抑制と

属菌の発育の間にシーソー

（seesaw） の関係を示すと考えられ，用いる抗菌剤 の効果は予想される

属菌以外の菌の種 類によって使い分ける重要性が示唆された．

冷却塔水からの

属菌の検出に，抗真 菌剤として anisomycin を使用している MWY 寒 天培地を用 い た 場 合，糸 状 菌 の 発 育 に よ り

gionella

属菌が分離できない例を経験した．そのた

め，WYO

寒天培地に抗真菌剤として添加されて いる AMPH-B の MWY 寒天培地への添加効果と 影響を試験した．その結果，MWY 寒天培 地 に AMPH-B を 80〜160

g

ml を 添 加 す る こ と に よ

り，

属菌の発育に影響することなく冷却

塔水由来の糸状菌は顕著に抑制された．さらに，

これら糸状菌と

属菌と混合培養した場 合，混在する糸状菌の旺盛な発育のために抑制さ れていた

属菌が，AMPH-B の 80µg! ml

添加によって， 検出可能になることが確認できた．

これらの成績から，AMPH-B の 80

g

ml を含有 している WYO

寒天培地を用いた場合には，試 験材料中に混在する糸状菌の発育を効果的に抑制 していることが推測された．奥田ら

は

属の株を用いて，AMPH-B の有効性を報告し，Lin ら

は臨床材料から

属菌を検出する場 合に，混在する酵母を抑制する目的で，選択培地 に anisomycin と fluconazole を組み合わせて添加 する改良法を提案しているが，実際の

属菌の検出では，こうした酵母様真菌よりも培地 表面全体に発育する糸状菌の抑制が重要であるた め，今 回 冷 却 塔 水 か ら 分 離 し，Aspergillus sp.

Trichoderma

sp.，Scolecobasidium sp.お よ び

sp.と同定された糸状菌を用いて AMPH-B の抗真 菌効果を試験し，その有用性が確認できた．今回 供試した糸状菌は anisomycin（80

g

ml）を含有 する MWY 寒天培地で分離した菌株であり，すべ ての糸状菌について anisomycin の抑制作用がな いとは断定できないが，冷却塔水を対象とする場 合，真菌に対する選択剤としては AMPH-B が有 用で， 使用濃度は 80

g

ml が効果的と思われた．

したがって，糸状菌などの真菌が多く混在してい ると予測される環境水の

属菌検出にあ た っ て は，AMPH-B 80

g

ml を 添 加 し た MWY 寒天培地を用いることにより，より高い検出率が 得られるものと考えられる．一方，AMPH-B は難 水溶性で毒性を有していることから，より取り扱 いが容易で抗真菌力が強く，安全性の高い選択剤 の利用が望まれる．

文 献

1）厚生省生活衛生局企画課監修：レジオネラ症防 止指針．財団法人ビル管理教育センター，1994.

2）厚生省生活衛生局企画課監修：新版レジオネラ 症防止指針．財団法人ビル管理教育センター，

1999.

3）春日 修，高木紀美子，谷 佳都，絹巻明生：環

境水由来レジオネラ属菌の分離方法に関する検 討．感染症誌 1999；73：25―34.

4）奥田敬一，池戸正成，薮内英子：冷却塔水からLe- gionella属 菌 を 検 出 す る た め の 新 選 択 培 地：

Wadowsky-Yee-Okuda（WYO）培地．感染症誌 1984；58：1073―82.

5）Ikedo M, Yabuuchi E：Ecological studies ofLe- gionellaspecies I. Viable counts ofLegionella pneu- mophilain cooling tower water. Microbiol Immu- nol 1986；30：413―23.

6）Adams SL：Legionella：A new millennium bug.

Clin Lab Sci 1999；12：309―15.

7）Doern GV：Detection of selected fastidious bac- teria. Clin Infect Dis 2000；30：166―73.

8）奥田敬一，池戸正成，阿部 晃：WYO 培地の至適 pH とα-ケトグルタル酸の添加効果．臨床と微生

物 1991；18：823―9.

9）Leoni E , Legnani PP ： Comparison of selective procedures for isolation and enumeration ofLe- gionellaspecies from hot water systems. J Appl Microbiol 2001；90：27―33.

10）Lin A, Stout JE, Rihs JD, Vickers RM, Yu VL：

ImprovedLegionellaselective media by the addi- tion of fluconazole：Results of in vitro testing and clinical evaluation . Diagn Microbiol Infect Dis 1999；34：173―5.

Studies on Efficient Methods for Detection of

species from Environmental Water by use of its Selective Media

Osamu KASUGA

, Hitoshi MISAWA

, Kimiko TAKAGI

Kato TANI

＆ Masanari IKEDO

1）Tanabe R & D Service Co., Ltd.

2）Biochem. Res. Lab., Eiken Chemical Co., Ltd.

To examine the optimal pH range for growth on media, growth of

spp. on its selective media, BCYEα,WYOα and MWY agar media, in a pH range of 6.0〜8.0（at 0.5 intervals）was com- pared. The growth of two strains of

and one strain of

on a WYO

agar sup- plemented with some selecting antimicrobial agents was markedly inhibited at all pH range except 6.0 and 7.0, suggesting a narrow optimal pH range for growth of these species compared to the BCYE

without selecting antimicrobioal agents. Vancomycin（VCM）added to the selective agar sup- pressed the growth of some

spp. depending on the concentration. However, the extent of suppression was different among species and

or strains of

spp. The selectivity for species other than

spp. was also affected similary by VCM concentration added to their media, sug- gesting that it is important to use proper amounts of the selecting antimicrobial agent depending on the species and

or strains of

spp. or the other species in water samples. Amphothericin B

（AMPH-B）added to a selective medium, MWY agar, in the concentration of 80

g

ml hardly affected

the growth of

spp. examined, but effectively inhibited the growth of fungal strains identi-

fied as

sp.,

sp.,

sp. and

sp. which were isolated from

cooling-tower water samples together with

spp. Furthermore, the growth of a combination

culture of one each of the 4 strains of isolated fungi and one each of the 3 strains of

spp. was

examined at various concentration of AMPH-B. Addition of AMPH-B to the selective medium at the

concentration of 80

ml suppressed the growth of spreading fungi, permitting the growth of

spp. to allow efficient detection of the species.