Microsoft Word - mp10338h__pdf_J_rev13_Oct_ doc

(1)

Click-iT

®

EdU Imaging Kits

表1.製品内容および保管情報。

材料

C10337

C10338

C10339

C10340

濃度

保管*

EdU (Component A)

5 mg

NA

Alexa Fluor

®

azide

(Component B)

1 vial (Alexa

Fluor

®

488)

1 vial (Alexa

Fluor

®

555)

1 vial (Alexa

Fluor

®

594)

1 vial (Alexa

Fluor

®

647)

NA

Dimethylsulfoxide

(DMSO, Component C)

4 mL

NA

Click-iT™ EdU reaction

buffer (Component D)

4 mL

10X solution

Containing

Tris-buffered saline

CuSO

4

(Component E)

1 vial

100 mM

aqueous

solution

Click-iT™ EdU buffer

additive (Component F)

400 mg

NA

Hoechst 33342

(Component G)

35 μL

10 mg/mL in

water

•2-6℃

•乾燥させる

•遮光

•凍結させない

*受領したときにキット全体を保管する際は上記の保管条件が適切です。各構成品の最適な保管条件については、それぞれのバイアルのラベルを参照して下さい。適切な保管条件で保管すれば、このキットは1年間安定です。NA = 適用せず。

アッセイの数：以下のプロトコルに基づき

50枚のカバースリップを染色するのに十分な材料が提供されています。

最大励起波長/蛍光波長： Alexa Fluor®_{488 azide：495 nm/519 nm；Alexa Fluor}®_{555 azide：555 nm/565 nm；Alexa Fluor}®_{594 azide：590}

nm/615 nm；Alexa Fluor®_{647 azide：650 nm/670 nm；Hoechst 33342：350 nm/461 nm (DNA結合時)。}

序論

細胞が増殖する能力を測定することは、細胞の健康の評価、遺伝毒性の判定および抗

がん剤の評価のための基本的な方法です。これを行う最も正確な方法は、直接的に

DNAの合成を測定することです。当初これは、放射性ヌクレオシド、

3

_{H-チミジンの取込}

みで測定されていました。その後、この方法に代わりヌクレオシド類似体ブロモデオキシ

ウリジン(BrdU)の抗体ベースの検出が用いられてきました。インビトロジェンClick‑ iT

®

EdU Assayは、BrdU assayの新しい提案です。キットに付属するEdU

(5-エチニル-2'-デオキシウリジン)はチミジンのヌクレオシド類似体であり、活発なDNA合成の間にDNA

に取り込まれます

1

。検出は、クリック反応(アジドとアルキンの間の銅触媒共有結合の反

応)を用います

2-5

_{。このアプリケーションでは、EdUにアルキンが含まれ、Alexa Fluor}

®

_色

素にアジドが含まれています。

(2)

Click-iT

®

_{EdU標識は至ってシンプルです。サイズの小さいアジド化蛍光色素は、マイルド}

な条件下での取込み

EdUの効率的な検出を可能にします。標準的なアルデヒドベースの

固定処理および界面活性剤による浸透処理は、

Click-iT

®

_{detection reagentがDNAにア}

クセスするのに十分です。これは、抗

-BrdU抗体で検出できるようにBrdUを曝露するため

に（通常

HCl 、熱またはDNaseによる消化を用いた）DNAの変性が必要なBrdU assayと

対照的です

(図1)。

BrdUプロトコールにおける変性ステップは、核酸の対比染色に影響するような二本鎖DNAの

完全性を失わせるだけでなく、細胞の形態および抗原認識部位を破壊することがありました。

対照的に、

EdU assayキットは使用が容易なだけでなく、細胞周期分析用の色素などのDNA

の染色にも完全に適応します。また、このEdU assayキットは、抗体を使った細胞表面および

細胞内マーカーの検出と組み合わせてマルチプレックス化することも可能です（詳細は表2参

照）。最後に、

(非特異的結合を示すことのある抗体に依存する)BrdU assayとは違って、

Click-iT

®

EdU assayはバイオオルソゴナルな(生物学的にユニークである)部分を利用するた

め、低バックグラウンドおよび高検出感度をもたらします。

キットには、接着細胞をサンプルとして、細胞周期解析と取込み

EdUの標識・検出に必要なコ

ンポーネントがすべて含まれています（図

2）。細胞周期解析については、キットには青色蛍光

の

Hoechst 33342色素がついています。キットには1回のテストで500 μL反応液を使って18

×

18 mm のカバーグラスを50枚標識するのに十分な試薬が含まれています。Click-iT

®

_EdU

についての最新の情報については、

www.invitrogen.com/eduをご覧ください。

抗-BrdU抗体変性なしでアクセスできない Click-iT®_{Alexa Fluor}®_azide

アクセス可能

X

取込みEdU 取込みBrdU O Br O NH NH N N O O

図1. Alexa Fluor®_{azideによる取込みEdUの検出 vs. 抗-BrdU抗体による組込みBrdU検出。Alexa Fluor}®_azideのサ

(3)

表2. Click-iT®_{detection reagentの互換性}

分子

互換性*

Qdot®_nanocrystals _Click-iT®_{検出反応後にQdot}®

ナノクリスタルをお使い下さい。緑色蛍光蛋白質(GFP)のような蛍光蛋白質蛋白質の発現検出にTC-FlAsH™やTC-ReAsH™ reagentなどの有機色素ベースの試薬、あるいはClick-iT® 検出反応の前に抗-GFPウサギ抗体またはニワトリ抗体をお使い下さい。 Alexa Fluor®_{色素、fluorescein (FITC)}

のような有機色素 Click-iT

®_{検出反応と完全な互換性があります。}

TC-FlAsH™ or TC-ReAsH™ reagents Click-iT

®_{検出反応の前に、FlAsH™またはReAsH™reagentでテ} トラシステイン(TC)タグを検出します。 Phalloidin ファロイジン染色は、Click-iT® 検出反応に対応していない。細胞骨格の可視化には、他のタンパク質に対しては抗-α-チューブリン抗体などの抗体をお使い下さい。

Horseradish peroxidase (HRP) Click-iT®_{検出反応後にHRPを使用して下さい。}

R-phycoerythrin (R-PE)およびAlexa

Fluor ®_{680-R-PEのようなR-PEタンデム} Click-iT

®_{検出反応の後にR-PEおよびR-PEタンデムを使用して} 下さい。アロフィコシアニン(APC)およびAPC-タンデム Click-iT ® 検出反応と完全な互換性があります。 *互換性は、蛍光分子それ自体または検出方法に、Click-iT®_{検出反応に使用される銅触媒存在下で不安定である成分が関} 与するかどうかを示します。

細胞を播種

オプション：

サンプル処理

EdUおよび他の生細胞染色試薬と細胞をインキュベート

細胞の固定と膜透過処理

EdU検出

オプション：

抗体および他の固定細胞染色(細胞周期または

核染色)を用いて細胞を処理する。

イメージング・解析

(4)

開始する前に

• リン酸緩衝生理食塩水(PBS, pH 7.2-7.6)

必要であるが、添付されていな

い材料

_{• 固定剤(ex. 3.7%ホルムアルデヒド in PBS)}

• 膜透過試薬 (ex. 0.5% Triton

®

_{X-100 in PBS)}

• 3% Bovine serum albumin (BSA) in PBS (3% BSA in PBS), pH 7.4

• 脱イオン水

• 18×18 mmカバースリップ

• オプション

：6-wellマイクロプレート

注意

Hoechst 33342(Component G)は変異原性を有する事が明らかです。適切な予防措置

をとって色素を使用してください。

このキットで溶媒として提供されているDMSO(Component C)は、組織への有機分子の

侵入を容易にすることが知られています。DMSOが含まれる試薬は、そのような材料が引

き起こす危険に対して適切な器具や手順で取り扱ってください。各地域の規則を遵守して

試薬を廃棄してください。

Stock Solutionを調製する

1.1 バイアルは開封前に室温に温めます。

1.2 2 mlのDMSO(Component C)または水溶液(緩衝液や生理食塩水)をEdU(Component A)

に添加し、よく混合してEdUの10 mM 溶液を調製します。

使用後、残った

Stock Solutionは-20°C以下で保存します。この保存条件で、Stock

Solutionは最大1年間安定です。

1.3 DMSO(Component C) 70 μLをAlexa Fluor

®

azide (Component B)に添加してよく混

ぜ、Alexa Fluor

®

_{azide のworking solutionを調製します。}

使用後、残った

working solutionは-20°C以下で保存します。この保存条件でworking

solutionは最大1年間安定です。

1.4 EdU reaction buffer (Component D)のボトル中の溶液すべて(4 mL)を36 mLの脱イオン水

に加え1X Click-iT

®

_{EdU reaction bufferのworking solutionを調製します。Component D}

のボトルを少量の1X Click-iT™ EdU reaction bufferで洗浄し、10X 濃縮物が全て移されて

いるようにします。

少量の1X Click-iT

®

_{EdU reaction bufferを作るには、適当な量のComponent Dを脱イオン}

水で1：10に希釈します。使用後、残った1X溶液は2-6˚Cで保存します。この保存条件で、1X

溶液は

6カ月間安定です。

1.5 Click-iT

®

buffer additive (Component F)の10X stock solutionを作るには、バイアルに2

mLの脱イオン水を入れて完全に溶解するまで混ぜます。使用後、残った 10X Stock

Solutionは≤-20°Cで保存します。この保存条件で、10X Stock Solutionは最大1年間安定で

す。溶液が茶色になった場合は劣化してますので廃棄して下さい。

(5)

実験プロトコル

EdUによる標識細胞

以下のプロトコルは、

10µMを最適なEdU濃度として、A549、HeLa、NIH/3T3細胞で開発され

ましたが、どのような接着細胞系にも適応できます。培地、細胞密度、細胞の種類および他の

要因が、標識に影響することがあります。最初の実験では、使用する細胞タイプおよび実験

条件にとって最適な濃度を見つけるために、様々な

EdU濃度でテストすることを推奨します。

キットには標準的な用量反応に十分な材料が付いていますが、追加のEdU（カタログ番号

A10044、E10187）も提供しています。現在、細胞増殖にBrdUベースのアッセイを用いている

のであれば、

BrdUと同濃度のEdU濃度がテストの出発点となります。

2.1 目的の密度でカバーグラス上に細胞を播種し、処理する前に一晩培養します。

2.2 10 mM EdU(Component A) stock solution を完全培地に加え 2X EdU working solutionを

調製します。推奨のEdUの開始濃度は10 μMです。

2.3 あらかじめ

2X EdU working solution を温め、次に細胞が入った培地へ等量の2X EdU

working solutionを加え、1X EdU solutionをとします（例最終濃度 10 μMの場合は、培

地の半分を

20 μM EdUを含む新しい培地で置換します）。細胞増殖の速度に影響すること

があるので、培地すべてを交換することはお勧めできません。

2.4 細胞タイプに最適な条件で目的の時間、細胞をインキュベートします。細胞が

EdUに曝露され

ている間に起こっている

DNA合成を検出するので、タイミングや時間は細胞増殖速度に依存

します。EdUの短時間暴露による細胞のパルス標識は、細胞周期の動態の観察を可能にし

ます。

2.5 すぐに細胞の固定および膜透過処理

(ステップ3.1-3.3)に進んだ後、EdU検出(ステップ

4.1-4.7)を行います。

細胞の固定および膜透過処理

注記：このプロトコルは3.7%ホルムアルデヒド in PBSを使用した固定ステップとそれに続

く0.5% Triton

®

_{X-100膜透過ステップで最適化されていますが、メタノールやサポニンな}

どの固定

/膜透過試薬にも対応しています。

カバーグラスを、各ウェルに1つのカバースリップが入るように、処理に便利な6ウェル

プレートに移します。

3.1 インキュベーションの後、培地を除去し、カバーグラスの入った各ウェルに

3.7%ホルムアル

デヒド

in PBS 1 mLを加えます。室温で15分間インキュベートします。

3.2 固定剤を除去し、各ウェルの細胞を

3% BSA in PBS 1 mLで二回洗浄します。

3.3 洗浄液を除去します。各ウェルに

0.5%Triton

®

X-100 PBS 1 mLを添加し、室温で20分間イ

ンキュベートします。

(6)

EdU検出メモ：このプロトコルは、カバースリップ

1枚につき500 µLのClick-iT

®

reaction cocktail

を使います

が、後の反応容量も同じ割合で維持されるのであれば、

500 µL

より少量でも可能です。

4.1 10X buffer additive （ステップ1.5で調製）を脱イオン水で1：10に希釈して1X Click-iT

®

EdU

stock solutionを調製します（表3参照）。この溶液は使用する毎に新しく調製し、調製した日

に使います。

4.2 表

3に従ってClick-iT

®

reaction cocktailを調製します。表に記載されている順で成分を加える

のが非常に重要です。この順序でなければ、反応は最適に進行しません。

注記：

Click-iT

®

_{reaction cocktailは調製してから15分以内に使用すること。}

表3. Click-iT®_{reaction cocktail。}

カバーグラスの数

反応成分*

1

2

4

5

10

25

50

1X Click-iT®_reaction buffer (ステップ1.4で調整) 430 μL 860 μL 1.8 mL 2.S2 mL 4.3 mL 10.7 mL 21.4 mL CuSO₄ (Component H) 20 μL 40 μL 80 μL 100 μL 200 μL 500 μL 1 mL Alexa Fluor®_{azide (ステッ}

プ1.3で調整) 1.2 μL 2.5 μL 5 μL 6 μL 12.5 μL 31 μL 62 μL Reaction buffer additive

(ステップ4.1で調整) 50 μL 100 μL 200 μL 250 μL 500 μL 1.25 mL 2.5 mL 総量 500 μL 1 mL 2 mL 2.5 mL 5 mL 12.5 mL 25 mL *注：表に記載されている順番で材料を加えます。

4.3 膜透過緩衝液（ステップ

3.3）を取り除き、各ウェルの細胞を3% BSA in PBS 1 mLで二回洗

浄します。洗浄液を除去します。

4.4 カバーグラスの入った各ウェルに

Click-iT

®

reaction cocktail 0.5 mLを加えます。reaction

cocktailがカバーグラスの上に均等に広がるようにプレートを短時間揺すります。

4.5 遮光し、室温で

30分間プレートをインキュベートします。

4.6 reaction cocktailを取り除き、各ウェルを3% BSA in PBS 1 mLで一回洗浄します。洗浄液

を除去します。

核染色を行う場合は核酸の染色に進みます。追加染色を行わない場合はイメージングおよ

び分析に進んで下さい。

4.7 オプション

：この時点で、一次抗体および二次抗体の各メーカーの推奨に従ってサン

プルの抗体標識を行います。インキュベーション中はサンプルの遮光が重要です。

DNA染色

5.1 1 mLのPBSで各ウェルを洗浄します。洗浄液を除去します。

5.2 Hoechst 33342 (Component G)溶液をPBSで1：2000に希釈し、1X Hoechst 33342 溶

液を調製します

(最終濃度 5 μg/mL）。

注記：Hoechst 33342 の最適濃度は2～10 μg/mLです。

5.3 各ウェルに

1X Hoechst 33342溶液 1 mLを加えます。遮光し、室温で30分間イン

キュベートします。Hoechst 33342溶液を除去します。

(7)

イメージングと分析

_Click-iT

®

_{EdU細胞はウェットマウントや市販のマウンティング培地など、あらゆるスライド調}

製方法と互換性があります。Alexa Fluor

®

_{色素およびDNAと結合したHoechst 33342色素の}

おおよその最大励起波長

/最大蛍光波長については表4を参照。

表4. 最大励起波長/蛍光波長。

蛍光色素

励起(nm)

発光(nm)

Alexa Fluor®₄₈₈ ₄₉₅ ₅₁₉ Alexa Fluor®₅₅₅ ₅₅₅ ₅₆₅ Alexa Fluor®₅₉₄ ₅₉₀ ₆₁₅ Alexa Fluor®₆₄₇ ₆₅₀ ₆₇₀ Hoechst 33342 (DNA結合時) 350 461

References

1. Proc Natl Acad Sci USA 105, 2415 (2008); 2. ChemBioChem 4, 1147 (2003); 3. J Am Chem Soc 125, 3192 (2003); 4. Angew Chem

Int Ed Engl 41, 2596 (2002); 5. Angew Chem Int Ed Engl 40, 2004 (2001).

製品リスト

現在の価格はウェブサイトあるいはカスタマーサポートへお問い合わせ下さい。

Cat No. Product Name Unit Size

C10337 Click-iT®_{EdU Alexa Fluor}®_{488 Imaging Kit *for 50 coverslips* . . . .} _{1 kit}

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C10328 Click-iT®_{RNA Alexa Fluor}®_{594 HCS Assay *2-plate size* . . .} _{1 kit}

C10329 Click-iT®_{RNA Alexa Fluor}®_{488 Imaging Kit *for 25 coverslips* . . .} _{1 kit}

C10330 Click-iT®_{RNA Alexa Fluor}®_{594 Imaging Kit *for 25 coverslips* . . . . .} _{1 kit}

C10350 Click-iT®_{EdU Alexa Fluor}®_{488 HCS Assay *2-plate size* . . .} _{1 kit}

C10352 Click-iT®_{EdU Alexa Fluor}®_{555 HCS Assay *2-plate size* . . . .} _{1 kit}

C10356 Click-iT®_{EdU Alexa Fluor}®_{647 HCS Assay *2-plate size* . . . .} _{1 kit}

A10044 EdU (5-ethynyl-2´-deoxyuridine) . . . 50 mg E10187 EdU (5-ethynyl-2´-deoxyuridine) . . . . . 500 mg H3570 Hoechst 33342, trihydrochloride, trihydrate *10 mg/mL solution in water* . . . 10 mL

(8)

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29851 Willow Creek Road Eugene, OR 97402 Phone: (541) 465-8300 Fax: (541) 335-0504 Customer Service: 6:00 am to 4:30 pm (Pacific Time) Phone: (541) 335-0338 Fax: (541) 335-0305 probesorder@invitrogen.com

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