センナ培養細胞が生成するアントラキノンとビアンスロン-香川大学学術情報リポジトリ

センナ培養細胞が生成するアントラキノンとビアンスロン 佐藤拓哉・山内裕之・福井宏至

ANTHRAQUrNONESANDBIANTHRONisFORMED

IN C4SSL4ANGtLSmL4CULTURED CELLS

TakuyaSATO，HiroyukiYAMAUCHIandHiroshiFuKUr ABSTRACT

The cellsuspension cultuIeS Of Cbssia angustyblia（Leguminosae），Called senna，Were fbundtoproducechrysophan01，physcionandIheinasanth1aquinones，andchysophan01−10，10’ −bianthIOne，Chrysophanol−physcionrlO，10’−bianthoneandchysophan01−isophyscion−10，10し bianthroneasbianthrones，althoughnosennoside（glucosidesofrhein−10，10しbianthIOne）， StrOngpurgativeagentsinsenna，WaSdetectedinthece11cultures．ThechemicalstruCtuIeSOf thecompoundsisolated丘・Omtheculturedcellsindicatethattheyhavethecapabilityofforming thecaIbonskeletonofbianthIDne，anaglyconeofsennosides，andrhein，animportantStruCtue

block ofthe aglycone，While the cultuIed ce11slackthe ability to produce easily detectable

amountsofthebianthoneglucosides．

Key Words：Cbssia angustifblia，Cellculture，anthaquinone，bianthrone，SennOSide，

puI’gative 緒 植物の有用二次代謝産物は，色素，医薬品，香辛料などの原材料として繁用されている．しかし， その資源の多くは発展途上国の野生植物に依存しており，その地域開発や経済発展に伴い安価に需 要を賄うのが困難になることが危倶されている．これを解決する方法として，野生有用植物の効率 的栽培化，あるいはバイオテクノロジ・一による目的物質の工業的生産が考えられる． センナ（α威か劇画叫鋸αL．，マメ科）は，ナイル川流域からインドにわたって産する熱帯性 小低木で，その葉（小葉）が緩下剤あるいは唆下剤として使用されている．その成分として，オキ シアントラキノン類（chIySOPhanolやaloe−emOdin，血einなど）やセンノサイド類、（ビアンスロン配 糖体であるsennosideAやsennosideBなどが主成分）が知られており，これらが下剤の活性本体と考 えられている（1）．これらの化合物は，ダイオウ（タデ科Rムeum属植物，中国が主な産地）の根茎 （生薬名：大貴）にも多量に含まれており（2），センナ菓とともに緩下剤として現在も市販の便秘薬 に配合される重要生薬の成分である． 本研究では，センナの若葉から誘導した培養細胞が生成するキノン類を探索し，それらの構造を 調べて培養細胞の代謝機能について考察することを目的とした．

香川大学農学部学術報告 第51巻 第1号（1999） 26 材料と実験方法 1．カルス誘導と培養方法 温室内で鉢植えのセンナ（伽ねα聯ゆJぬL，マメ科）の若葉を70％エタノール（20秒間）と

1％アンチフォルミン（15分間）に浸漬し，滅菌水で洗浄後クリ鵬ンベンチ内でおよそ5mm四方

に切断し，1fLM 2，4−dichlorophenoxyacetic acid（2，4−D）と1FLM benzyladenine（BA）を含む Linsma血−Sk00g（u）寒天培地（3）（3％ショ糖含有）に置床し，暗黒下25℃で培養してカルスを誘 導した．約4週間後に黄色の細胞塊が切断面に生じたので，前述の培地に移植し増殖を試みた．数 代にわたって同培地上で継代を繰り返したが，多くの細胞塊が褐変を示した．褐変を特異的に抑制 する方法は知られていないので，LS培地とGamborg−B5（B5）培地（4）について，窒素源の形態を 変えて培養し褐変の様子を調べた．その結果，アンモニア態窒素（硫酸アンモニウム）を除いたB 5培地（以下B5−N培地）では，褐変が抑制される傾向が観察きれたので，黄色細胞を繰り返し選 抜しながらB5−N培地上で増殖・収穫と継代を行った． さらに褐変が抑えられた黄色カルスを選んでB5−N液体培地に移植した．液内振漁培養において も褐変が見られたので，出来るだけ淡黄色の細胞を選びながら同液体培地で継代を繰り返し，成分 分析用のセンナ細胞を集め，凍結乾燥センナ培養細胞（165g）を得た． 2．抽出と分画 上記乾燥センナ細胞を乳鉢で粉末にし，メタノール：水（7：3）およびメタノールで順次抽出 し，両抽出液を合わせて減圧浪縮後，90％メタノール（約300ml）に溶かし，ヘキサン（約150 mりで3回抽出した．残るメタノール相の濃縮水溶液をジクロロメタンと酢酸エチルで順次抽出 し，ヘキサン可溶部（1．32g），ジクロロメタン可溶部（1．08g），酢酸エチル可溶部（1．餓g） および水溶性残査に分画した． 3．精製 ヘキサン可溶成分の検索 ヘキサン抽出画分（1．30g）をシリカゲルカラム（22×400m，シリカゲル60：100g，ヘキサ ン・ベンゼン・酢酸エチルの混合溶媒による段階的溶出，1フラクション：300血，計13フラク ション）により分画した．各分画を濃縮後，シリカゲルnC（展開溶媒：ヘキサン：酢エチ＝3： 1）を展開した結果，Fr．No8∼10（ベンゼン中の酢酸エチル濃度：0−10％溶出画分）がRfO．7 と0．8にアントラキノン類と推測できる草色スポットを示したので，これら溶出画分を合わせ濃縮 （160mg）し，分取高速液体クロマトグラフイ（ODS：Wakopak WS−II5C18HG−Prep，20×250 m，溶離液：メタノ血ル：水：酢酸＝85：15：1）による精製を行った．保持時間：74分付近か ら化合物1（72mg）を，保持時間：104分村近から化合物2（31mg）を得た． ジクロロメタン可溶成分の検索 ジクロロメタン抽出物（1．08g）については，まず，ヘキサン抽出画分と同様にシリカゲルカラ ム（32×180mm，ベンゼン：酢酸エチル：メタノールの混合溶媒による段階的溶出，1フラク ション：120mL計15フラクション）により分画した．各フラクションを濃縮後，シリカゲルnC （展開溶媒：ヘキサン：酢酸エチル＝3：1）を展開した結果，Fr．No．1∼5がRrO．9付近に， Fr．No．11∼14がRrO．6付近に黄色スポットが観察された． 前者の溶出画分を合わせ（110mg），再度シリカゲルカラム（12×160mm，ヘキサン：酢酸エチ ルの混合溶媒による段階的溶出，1フラクション：20血）で分画した．前述の方法によるシリカ

ゲルTLCから，FI・．No．12∼18から化合物1（46mg），26∼29から化合物2（14mg），36∼42から 化合物3（17mg）が単離できた．Fr．No．43∼45については分取シリカゲ）t／TLC（展開溶媒：ヘ キサン：酢酸エチル＝4：1，Rf0．3）により化合物4と5（計10mg）を得た． 後者の溶出画分を合わせ（230mg），シリカゲルカラム（18×190mm，クロロフォルム：メタ ノ1−ル混合溶媒による段階的溶出，1フラクション：50ml）で分画し，FI．No．6∼10をさらに分 取シリカゲルTLC（クロロフォルム：メタノ・−ル＝2：1）により精製し，化合物6（6mg）を 得た． 以上培養細胞（乾燥重量：165g）から，化合物1（118mg）および2（45mg），3（17mg），4 と5（計10mg），6（6mg）を得た． 酢酸エチル可潜画分と水溶性残査に含ま岬アンスロン系化合物め検索 酢酸エチル可溶画分に含まれるアントラキノン類やビアンスロン類は薄層クロマトグラフィや高 速液体クロマトグラフィでは相当するスポットやピ−クを検出することができなかった．そこで， 水溶性残査に含まれるアントラキノンやビアンスロンの配糖体が存在するかどうかを検討した． 水溶性残査をアンバ・−ライトⅩAD−2カラム（水：メタノール混合液による溶出）ついでシリカ ゲルカラム（n−プロパノール：酢酸エチル：水混合液による溶出）で精製したが，アントラキノ ン配糖体やビアンスロン配糖体（センノサイド類）の存在を確認することはできなかった． OH 0 0H OH O

RI

R2

OH O OH 1：Rl＝CH3 R2＝H （chrysophanOl） 3：Rl＝R2＝H（chysophanOl−10，10しbianthrone） 2：Rl＝CH3 R2＝OCH3（physcion） 4：Rl＝OCH3，R2＝H（cbIySOPhanOl−Physcion− 6：Rl＝COOH，R2＝H （Thein） 10，10，−bianthrone）

5：Rl＝H，R2＝OCH3（chrysophanOl−isophyscion−

28 香川大学農学部学術報告 第51巻 第1号（1999）

農scoA

。 POlyketide OH O OH Acetate−malonatepathway antIlrOne

／

OH O OH OGIc O O anthraqulnOne OH O OH biantbIOne OHOOH bianthroneglucoside Fig．1．BiosyntheticpathwayofanthraoqulnOneSandsennosidesinSennaplants （Rl＝CH3，CH20H，OrCOOH，R2＝H，OH，OrOCH3） 実 験 結 果 化合物1の同定 UVlmax（CHC13）：433nm，IRリmaX（CHCl3）：1570，1610，1630cm‖）を示し，アントラキノン類 であることを示唆した．EI−MS（direct）はm／e254に親イオンを示し，HR−EIMSでは，m／e254．0593 が認められ，化合物1の分子式はC15HlOO。（計算値：254．0579）と同定された．1H−NMRスペクトル （CDCb，400M珪z）は，∂2．47（3日，h．∫．），7．10（1H，br．∫），7．謂（1王丁，‘ガ，ノ＝8．3，1叩O Hz），7．65（1H，br．∫），7．錯（1H，〟，ノ＝7．3，1．OHz），12．01（1H，5），12．12（1H，5）を 示し，芳香環置換メチル基1個とABC系の分裂シグナルが認められたことから，化合物1はchけ− 5叩b皿01と判断された（L6）．1℃−NMRは∂22．㌘，111．3，115．9，119け9，121．4，124．4，124．6，133．3， 133．7，136．9，149．3，162．4，162．7，181．6，191．7にシグナルが認められ，これを支持した． 化合物2の同定 UVlmax（CHCl3）438nmを示し，1と同様にアントラキノン類であることを示唆した．また EIMS（70eV）では，m／e284に親イオンを示し，高分解能EIMSでは，m／e284．0657を与え，分子式 はC16H1205（計算値：284．0685）であることが明らかになった．1H−NMR（CDC13，400MHz）は， ∂2．45（3H，br．ざ．），3．鋸（3H，∫），6．68（1H，br．5），7．㈹（1H，bL5），7．37（1H，br． 5），7．63（1H，加．∫），12．13（1H，5）と12．33（1H，5）を示した．これらのシグナルはメチ ル基1個が3位に，メトキシル基1個が6位に置換していることを示しており，芳香族プロトン4 個の分裂様式とともに化合物2はphysdonであると推定された．最終的に，これらのデータを既報 のスペクトルデ鵬夕（67）と詳細に比較し，これを確認した． 化合物3の同定 UV人max（CHC13）365nmを示し，ビアンスロン類と考えられた。EIMS（70eV）では，m／e240

に最大ピークを与えたが，イオン化電圧を45eVに下げるとm／e478が観察された．また，HR−EIMS （45eV）でm／e478．1412を示し，分子式は駄H22仇（計算値478．1416）であることが認められた． これらのことから，3はchrys叩hanol型のビアンスロンと推測された． 1H−NMR（CDCh，400MHz）では，82．22（3H，br．s．），2．35（3H，br．s），4．45（2H，br． ∫），5．73（1H，br．ぶ），6．15（1H，br．∫），6．33（1H，d，ノ＝8Hz），6．65（1H，br．∫）， 6．71（1H，br．ぶ），6．73（1H，d，ノ＝8Hz），6．86（1H，h．∫），6．93（1H，k．5），7．35 （1H，′，ノ＝8Hz），7．48（1H，J，ノ＝8Hz），11．63（1H，∫），11．71（1H，ぶ），11．79（1H， ∫），11．錮（1H，ざ）にそれぞれのピークが認められた．∂4．45のシグナルは，アンスロンの10位 を介してこ量体を形成していることを示している．さらに∂2．22と2．おに2個のメチル基の存在が 認められ，∂5．73∼7．48に見られる10H分のシグナルのケミカルシフトと分裂形式から，化合物3 がchrysophan01−10，10，−bianthroneVCあると同定され，これらのデ山タは既報のもの（8）と一致した・ 13c一服（DMSO一血，100MHz）が示したシグナル（∂21．93，22．08，56．32，114．00，114．52， 116．鋸，117．02，119．28，121．㍊，135．罰，139．65，142．10，147．㌶，161．鋸，162．29，191．64） はこれを支持した． 化合物4と5の同定 UVÅm弧（CHCb）363nmを示し，ビアンスロン類と考えられた．そこでイオン化電圧を45eVに 設定したEIMSではm／e240と270に大きなピークを与え，ほかに分裂ピークと考えられるものは認 められなかった．岬方，高分解能EIMS（45eV）ではm／e270．09㈹と240．㈹17が認められ，前者はC16 Hl。0。（計算値270．0892）で後者はC15H12仇（計算値240．0762）であることを示した．これらのピー クは，化合物4がchγS叩hmol型とphyscion型のアンスロンの重合体であると考えることで理解でき る． 1H−NMR（CDCh，400MHz）では，82．20（3H，S．），2．23（3H，S），2．30（3H，S），2．45 （3H，∫），3．79（3H，∫），3．87（3H，∫．），4．37（2H，br．∫），4．47（2H，br．∫），5．77 （1H，br．∫），5．鋸（1H，br．∫），5．99（1H，h．∫），6．03（1H，br．∫），6．17（1H，h． ∫），6．27（1H，bI．∫），6．錮（1H，d，ノ＝2Hz），6．41（1H，d，ノ＝2Hz），6．57（1H，d，J ＝8Hz），6．62（1H，d，ノ＝8Hz），6．67（1H，d，ノ＝8Hz），6．72（1H，d，ノ＝8Hz），6．89 （1H，d，ノ＝8Hz），6．92（1H，d，ノ＝8Hz），7．41（1H，f，ノ＝8Hz），7．朗（1H，J，ノ＝ 8Hz），11．67（1H，5），11．73（1H，∫），11．79（1H，∫），11．鋸（1H，∫），11．∬（1H，ぶ）， 11．90（1H，∫），12．㈹（1H，∫），12．19（1H，∫）にシグナルが認められた．これらのシグナル は，Chrys叩hanOl−Physcion−10，10しbianthrone（8）の存在を示しているが，この構造だけでは，すべて のシグナルを説明することはできず，分子式が同じであるcbTy犯pba001−isophy㍍ion−10，10し bianthroneが混在していることで，すべてのピbクを矛盾なく説明できる．同じ混合物がSbnna わ〝如拙げαからも単離され，それらの皿データ（8）と山致した． 化合物6の固定 UV人max（EtOH）：260と430nmは化合物6がアントラキノンであることを示した．EIMS（70 ev）はm／e284を，高分解能EIMS（70eV）はm／e284．0306を示し，分子式はC15Hの4（計算値284．0321） であることが判明した．1H−NMR（DMSO壷，400MHz）では，∂7．45（1H，〟，ノ＝1．0，8．3Hz）， 7．77（1H，〟，ノ＝7．8，1．OHz），7．釦（1H，br．ぶ）7．那（1H，J，ノ＝8Hz），8．16（1H，bL ∫），11．95（2H，ぶ）が認められ，1，8−ジハイドロキシー3置換アントラキノンであることを 示唆している．また，13c−NMR（DMSOJ6，100MHz）では8116．21，118．65，118．78，119．45， 124．14，124．60，133．2も133．85，137．62，137．98，161．08，161．43，165．42，181．01，191．罰に

香川大学農学部学術報告 第51巻 第1号（1999） 30 シグナルが認められ，165．42がカルポキシル基に帰属できることや他のシグナルの分裂様式が既報 のデータ（69）と−・致することから，化合物6は血einであることが判明した． 考 察 センナ（C鮎扇αα喝〟5吋♭Jれマメ科）の菓（小葉）はアントラキノン類やビアンスロン類配糖体 （センノサイド類）を含むため，下剤として繁用されている．しかし，その供給源の大半を野生植 物に依存している．そこで，植物有用成分の生産手段を広げる可能性の一つとして，センナの培養 栽培が生成するキノン系成分を調査・検討した．その結果，ChIySOPhanol（l），physcion（2）， rhein（6），ChrysophanoITlO，10しbianthrone（3），ChIySOphanOl−physcion−10，10，−bianthrone（4）， chIySOphanol−isophyscion−10，10▼−bianthrone（5）が生成されていることを明らかにした． センナにおけるアントラキノン類やビアンスロン類はFig．1に示すように，酢酸・マロン酸経路 を経て生合成されることが明らかにされている（10）．すなわち，酢酸・マロン酸経路に由来するポリ ケチドが閉現してアンスロンを形成し，その10位が懐化されるとアントラキノンになる．−・方，ア ンスロンがメチレン基同士で重合するとビアンスロンになり，さらに8位水酸基が配糖化されると， 主要活性成分であるセンノサイドに生成する．主要下剤活性成分であるセンノサイドは血ein型の アンスロン（3位にカルポキシル基が置換したもの）が互いの10位のメチレン基同志で重合し配糖 化されたものである． 今回の研究では，センナ培養細胞にセンノサイド類やアントラキノン配糖体の存在を確認するこ とはできなかったが，培着細胞に存在することが判明した5種の成分の構造は，センナ培養細胞が アントラキノン（1，2，6）やビアンスロン炭素骨格（3，4，5）を形成する能力を有してい ることを示している．すなわち，センナの培養細胞が下剤活性本体の構成成分である血einを始め とするアントラキノン類やビアンスロン類を生成する機能を発現していた．′しかし，Ⅰhein型アン スロンが重合したビアンスロンやその配糖体が検出できなかったことから，培養細胞では，下剤活 性成分を形成する最終段階の生合成能力が十分に機能していないと判断された． 引 用 文 献 pp．388−391．Academic Press，London（1971） （6）DANIELSEN，K．，AKSNES，D．W．：NMR study of

SOme anthraquinones 魚．om rhubarb． Magnetic

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