J. Anim. Genet., 27 (2) : 45-54 1999
〔 ミ ニ レ ビ ュ ー 〕
牛 白血 病 ウ イ ル ス誘 発性Bリ
ンパ腫 にお け る
ウ シp53遺
伝 子 の変 異
田島
茂 ・間
陽 子
理 化 学 研 究 所 ・ラ イ フ サ イ エ ン ス 筑 波 研 究 セ ン タ ー 茨 城 県つ く ば 市 高 野 台3-1-1,〒305-0074Mutations
of Bovine
p 53 Gene
in Bovine
Leukemia
Virus-Induced
B-Cell
Lymphosarcoma
Shigeru
TAJIMA,
Yoko
AIDA
Tsukuba
Life Science
Center,
The Institute
of Physical
and Chemical
Research
(RIKEN)
3-1-1 Koyadai,
Tsukuba,
Ibaraki
305-0074, Japan
1.は じ め に
癌 は細 胞 内 の 遺 伝 子(癌 遺 伝 子 や 癌 抑 制 遺 伝
子)の 突 然 変 異 に よ って 発 生 す る遺 伝 子 病 で あ
る.癌 抑 制 遺 伝 子 と は,失 活 す る と細 胞 の 癌 化 が
起 こ る よ うな遺 伝 子 の総 称 で あ り,い まや 癌 遺 伝
子 以 上 に癌 化 の “
中 心 人 物 ” と して 精 力 的 に研 究
が 進 あ られて い る.癌 抑 制 遺 伝 子 は こ れ まで に約
20種 類 が 単 離 され て い る.そ の な か で もp53遺
伝 子 は,全
ヒ ト癌 の約 半 数 と非 常 に高 率 に機 能 低
下 を 引 き起 こす 変 異 が 観 察 さ れ る な ど の理 由 か
ら,最 も解 析 が 進 ん で い る.p53はDNA腫
瘍 ウ
イ ル ス の癌 タ ンパ ク質 で あ るSV401argeT抗
原
と結 合 す る タ ンパ ク質 と して1979年
に発 見 さ れ
た(Laneら,1979,LinzerとLevine,1979).こ
の タ ンパ ク質 は癌 細 胞 で過 剰 に発 現 さ れ て い る こ
と,さ
らに初 期 に ク ロ ー ン化 され たp53遺
伝 子
が トラ ン ス フ ォー ム能 を 有 して い た こ とか ら,約
10年 もの 問p53遺
伝 子 は癌 遺 伝 子 と考 え られ て
い た.し か し1989年
に至 り,新 た に ク ロー ニ ン グ
さ れ た 正 常p53遺
伝 子 は ト ラ ン ス フ ォ ー メ ー
シ ョ ン抑 制能 を 有 す る こ と,ま た様 々 な ヒ ト癌 細
胞 に お い て高 頻 度 にp53の
変 異 お よ び欠 失 が 観
察 され る こ とか ら,初 期 の もの は変 異 型 で あ り,
本 来p53は
癌 抑 制 遺 伝 子 で あ る こ と が判 明 した
(Finlayら,1989).そ
の後p53タ
ンパ ク質 は細
胞 周 期 停 止 や ア ポ トー シ ス を 誘 導 す る こ と に よ
り,生 体 ス トレス に よ り生 じる異 常 細 胞 の無 秩 序
な増 殖 を抑 え,個 体 の安 全 性 を保つ 役 割 を果 たす
こ とが 明 らか と な った.
本 稿 で は,ヒ
ト癌 研 究 に よ り明 らか に さ れ たp
53の 構 造 お よ び機 能 につ い て概 説 した後,ウ シの
ウイ ル ス誘 発 性 腫 瘍 組 織 に観 察 さ れ るp53の
変
異,お よ び変 異 が ウ シp53の
機 能,構 造 に及 ぼす
影 響 に つ い て,筆 者 らの 結 果 を 中 心 に 紹 介 した
い.
2.ヒ
トp53タ
ン パ ク 質 の 構 造 と 機 能
お よ び ヒ ト癌 に お け る 変 異
ヒ トP53は,393ア ミ ノ酸 か ら な る 核 タ ン パ ク46 J. Anim. Genet., 27 (2) 1999
図1ヒ トp53の 構 造 及 びp53結 合 タ ンパ ク 質
各 種 機 能 ドメ イ ン,変 異 ホ ッ ト ス ポ ッ ト,種 間 高 度 保 存 領 域 等 を 示 す. 詳 細 な 説 明 に つ い て は 本 文 参 照.円 で 囲 ま れ た 数 字 は リ ン酸 化 を 受 け る ア ミ ノ 酸 の 位 置 を 示 して い る.TFIID,TFIIH及 びTBP;基 本 転 写 因 子 の 構 成 因 子,MDM;multiple double minute,RP-A;
replication protein-A, HSP ; heat shock protein, AdE 1 B ; adenovirus E 1 B, p 53BP ; p 53 binding protein.
質 で あ る.図1に 示 す よ う に,こ れ ま で に 様 々 な 機 能 ド メ イ ン や 他 の 分 子 と の 相 互 作 用 部 位 が 確 認 さ れ て い る(KoとPrives,1996).機 能 ド メ イ ン は大 き く3つ の 領 域,N末 端 ド メ イ ン,コ ア ド メ イ ン,C末 端 ドメ イ ン に 区 分 さ れ る.N末 端 ド メ イ ン に は 酸 性 ア ミ ノ 酸 や5回 のPXXPを 含 む 高 プ ロ リ ン領 域 な ど の 転 写 制 御 に 必 要 な ドメ イ ン が 存 在 す る.コ ア ド メ イ ン は 塩 基 配 列 特 異 的DNA 結 合 部 位 に 相 当 し,p53は こ の 領 域 を 介 し て2コ ピ ー の5'RRRC(A/T)(A/T)GYYY3'を 認 識 し て 結 合 す る.C末 端 ドメ イ ン は4量 体 形 成 に 必 要 な 領 域 や 核 移 行 シ グ ナ ル(NLS),非 特 異 的 DNA結 合 領 域 等 か ら 成 る.さ ら に,N末 端 お よ びC末 端 ド メ イ ン に は 数 ヶ 所 の リ ン酸 化 を 受 け る 部 位 が 同 定 さ れ て お り,こ れ ら はp53の 活 性 を 制 御 す る 上 で 重 要 で あ る こ と が 最 近 明 らか に な りつ つ あ る.p53は これ ま で に イ カ や 二 枚 貝 な ど の 無 脊 椎 動 物 や ア フ リ カ ッ メ ガ エ ル 以 上 の 脊 椎 動 物 で 存 在 が 確 認 さ れ て い る.1∼Vで 示 した5っ
図2生
体 ス トレス に よ るp53の
作 用 機 構
詳 細 な説 明 につ いて は本 文 参 照.
の領 域 は,特 に そ の構 造 が ア フ リカツ メ ガ エル か
ら ヒ トまで 種 を 越 え て 高 度 に保 存 され て い る.
上 述 の 構 造 か ら も判 る よ う にp53は
転 写 制 御
因 子 で あ る.生 体 組 織 にDNA傷
害 等 の ス ト レス
田島 ・間:牛 白血 病 ウ イ ル ス誘 発 性Bリ ンパ腫 に お け る ウ シp53遺 伝 子 の 変 異 が 発 生 す る と,p53が 蓄 積 し活 性 化 状 態 と な る. 活 性 化 さ れ たp53は 細 胞 周 期 の 停 止 や ア ポ ト ー シ ス の 誘 導 に 関 与 す る 様 々 な 遺 伝 子 を 活 性 化 す る (図2).こ れ ま で に 明 らか と な っ て い る タ ー ゲ ッ トに は,細 胞 周 期 のG1期 お よ びG2/M期 停 止 を 引 き 起 こすp21cip-1(El-Deiryら,1993),G2/M 期 停 止 に 関 与 す る14-3-3σ(Hermekingら, 1997),DNA損 傷 の 修 復 に 携 わ るGADD45 (Kastenら,1992),ア ポ トー シ ス 誘 導 に 関 与 す るBax(MiyashitaとReed,1995),Fas(Owen-Schaubら,1995)やIGF-BP3(Buckbinderら, 1995),負 の フ ィ ー ドバ ッ ク機 構 と してP53を 不 活 化 す るMDM2(Barakら,1993,Perryら, 1993)な ど が あ る.一 方 でp53は,一 部 の 遺 伝 子 に 対 す る 転 写 抑 制 能 や,転 写 制 御 以 外 の 機 能 の 存 在 も 明 ら か に さ れつつ あ る(KoとPrives, 1996).こ の よ う に 多 様 な 機 能 を 介 し て,P53は 個 体 が 癌 化 す る の を 抑 え て い る も の と考 え ら れ て い る. p53遺 伝 子 の 変 異 は ヒ ト癌 組 織 の 約 半 数 で 検 出 さ れ て お り,癌 抑 制 遺 伝 子 の 中 で も最 も高 い 変 異 頻 度 を 示 す(Hollsteinら,1991).p53変 異 の 大 半 は ミス セ ン ス 変 異 で あ り,ま た 変 異 の9割 以 上 は 部 位 特 異 的DNA結 合 領 域 で あ る コ ア ドメ イ
図3ウ
シ と ヒ トのp53ア
ミノ酸 配 列 の 比 較
配 列 中 の灰 色 領 域 は種 間 高 度 保 存 領 域(1∼V)を
示 す.配 列 上 部 の太 文 字 お よ び数 字 は,
そ れ ぞ れ 我 々 が ウ シ腫 瘍 組 織(あ
る い はBLSC-KU-1細
胞 株)で 観 察 した ミス セ ン ス変 異
後 の ア ミノ酸 お よ び そ の位 置 を,ま
た黒 丸 お よ び数 字 は,同
じ く観 察 した サ イ レ ン ト変 異 の
位 置 を示 す.配 列 下 部 の*印 お よ び数 字 は,ヒ
トで の変 異 ホ ッ トス ポ ッ トの位 置 を示 す.
48 J. Anim. Genet., 27 (2) 1999 ン 内 に 観 察 さ れ る.さ ら に こ の 領 域 内 で も特 に 集 中 し て 変 異 の 観 察 さ れ る ア ミ ノ酸 部 位 が 存 在 して お り,変 異 ホ ッ ト ス ポ ッ ト と 呼 ば れ る(図1). ホ ッ ト ス ポ ッ ト は ヒ トp53上 に6ヶ 所 存 在 し (コ ド ン175,245,248,249,273,282),す べ て 高 度 保 存 領 域 内 に 位 置 して い る.コ ド ン175と249の 変 異 はp53タ ンパ ク 質 の 立 体 構 造 に 変 化 を も た ら し,コ ド ン248と273の 変 異 はDNAと の 直 接 的 相 互 作 用 に 影 響 を 及 ぼ す こ と に よ り,そ れ ぞ れ 転 写 活 性 化 能 を 大 き く低 下 さ せ る こ と が 明 らか に さ れ て い る(Choら,1994). 3.ウ シp53遺 伝 子 ウ シp53cDNAの 全 長 は1995年 に ベ ル ギ ー の グ ル ー プ に よ り は じあ て 単 離 さ れ,そ の 全 塩 基 配 列 が 明 ら か と な っ た(Dequiedtら,1995a)(図 3).こ れ と 同 時 期 に 我 々 も ウ シBリ ンパ 腫 細 胞 株 BLSC-KU-1に 由 来 す るcDNAク ロ ー ン の 単 離 に 成 功 した が,ベ ル ギ ー の グ ル ー プ の 配 列 と 比 較 した と こ ろ,コ ド ン252に ミス セ ン ス 変 異(Asp か らTyr)が 検 出 さ れ た(Tajimaら,1998).ま た こ の こ ろ 帯 広 畜 産 大 学 の 石 黒 ら の グ ル ー プ で も 全 長 の 約97%の 領 域 の ク ロ ー ニ ン グ に 成 功 し て い る(Komoriら,1996).ウ シp53は386ア ミノ 酸 残 基 か ら 成 る.ヒ トp53と 比 較 し た 場 合, 81.6%の 相 同 性 を 示 す も の の8ヶ 所 の 欠 失 残 基 お よ び1ヶ 所 の 付 加 残 基 が 存 在 す る ため,結 果 的 に 7残 基 ほ ど ウ シp53の 方 が 短 い.相 同 性 は コ ア ド メ イ ン で 高 く,一 方N末 端 ド メ イ ン で は 低 い 傾 向 に あ る.ち な み に 先 の 欠 失 残 基 は す べ てN末 端 ドメ イ ン 内 に 存 在 す る.ま た5ヶ 所 の 高 度 保 存 領 域 で は 両 種 間 の 配 列 の 差 異 は 非 常 に 僅 か し か 認 め ら れ ず,ヒ トで の6ヶ 所 の ホ ッ トス ポ ッ ト も す べ て 保 存 さ れ て い る .ウ シp53は こ れ ま で 配 列 が 明 ら か に さ れ て い るP53の う ち で は ヒツ ジ の も の と最 も類 似 し て お り 相 同 性 は91%に 達 す る. し か し ヒツ ジp53の ア ミ ノ 酸 数 は382残 基 と ウ シp53よ り4残 基 短 い(Dequiedtら,1995b).
4.地
方 病 性 牛 白血 病 に お け るp53遺
伝 子 変 異 の検 出
牛白 血 病 ウ イル ス(BLV)は
外 来 性 レ トロ ウ イ
ル スで あ り,Bリ
ンパ 腫 で あ る地 方 病 性 牛 白血 病
(EBL)を
惹 起 す る(図6).BLVに
感 染 した ウ シ
の 約70%は
終 生 感 染 は維 持 し続 け る も の の全 く
健 康 で あ る.残
り30%は
著 しいB細
胞 の増 加 が
観 察 され る持 続 性 リ ンパ 球 増 多 症(PL)を
き た
す.実 際 にEBLに
至 る個 体 の 割 合 は全 感 染 個 体
中1%程
度 と非 常 に 低 い.さ
ら にEBL発
症 に は
長 い潜 伏 期 間 を要 し,こ の間 啓 染 個 体 の末 梢 血 リ
ンパ 球 で は ウ イ ル ス粒 子 や 構 造 蛋 白 お よ び ウ イ ル
ス転 写 産 物 は ほ とん ど検 出 され な い.以 上 の特 徴
は ウ イ ル ス感 染 の みで は 白血 病 誘 導 に は十 分 で は
な く,他 の宿 主 側 に起 因 す る要 因 が 必 要 で あ る こ
と を強 く示 唆 す る.
そ こで 我 々 は,こ
の宿 主 側 の要 因一 つ と してp
53に 着 目 し,BLV誘
発 性 の腫 瘍 でp53遺
伝 子 に
変 異 が 検 出 さ れ る か を 調 べ た(Tajimaら,
1998).BLV非
感 染 正 常 牛4個
体 お よ びBLV感
染 非 発 症 牛5個 体(健 康 牛4個 体 お よ び リ ンパ 球
増 多 症 牛1個 体)の
腎組 織 と末 梢 血 リンパ 球,お
よ びEBL発
症 牛19個
体 の 腎 組 織 と腫 瘍 組 織 よ
り全DNAを
抽 出 し,こ れ らを鋳 型 と して,P53
遺 伝 子 の な か で も高 頻 度 に変 異 の観 察 され るエ ク
ソ ン5か
ら8ま で の 領 域 をPCR法
に よ り特 異 的
に増 幅 した.増 幅 断片 を プ ラス ミ ドベ ク ター ヘ サ
ブ ク ロー ニ ン グ後,塩 基 配 列 を決 定 し野 生型 と比
較 した(表1).BLV非
感 染 正 常 お よ び感 染 非 発
症 牛 で は変 異 は観 察 され な か った.一 方,EBL発
症 牛19個
体 中4個 体(21.1%)で
各1ヵ 所 ず っ 計
4種 類 の腫 瘍 組 織 特 異 的 な ミス セ ンス変 異 が 確 認
され た:コ
ドン206(Argか
らLys),コ
ドン207
(Hisか らPro),コ
ドン241(Argか
らTrp)お
よ
び コ ドン242(Argか
らTrp).ま
た残 り15個 体
の うち5個 体 で は サ イ レ ン ト変 異 が 観 察 さ れ た
(26.3%).次
に ヒ トp53遺
伝 子 の 塩 基 配 列 と比 較
田 島 ・間:牛 白血 病 ウ イ ル ス誘 発 性Bリ ンパ 腫 に お け る ウ シp53遺 伝 子 の 変 異
表1BLV非
感 染 及 び感 染 牛 由来 末 梢 血 リ ンパ 球 あ る い は腫 瘍 組 織 に お け る
p53遺 伝 子 の変 異(Tajimaら,1998よ
り一 部 改 変)
a PBL
, peripheral blood lymphocytes.
b Kidneys of cows with lymphosarcoma were used as control. c NF, Not found.
d NT
50 J. Anim. Genet., 27 (2) 1999 遺 伝 子 上 の 変 異 ホ ッ ト ス ポ ッ ト(コ ド ン248お よ び249)に 対 応 す る こ と が 明 ら か と な っ た(図3 お よ び 表1).こ の2ヶ 所 はDequiedtら も 変 異 を 観 察 し て い る こ と か ら,EBLで も高 率 に 変 異 の 発 生 す る部 位 な の か も し れ な い.コ ド ン206は ヒ ト白 血 病 に 特 異 的 に 変 異 の 観 察 さ れ る コ ド ン213 に 相 当 す る.コ ド ン207に 対 応 す る ヒ ト コ ド ン 214は ヒ ト腫 瘍 で 変 異 の ほ と ん ど観 察 さ れ な い 部 位 で あ っ た.ま た,コ ド ン206お よ び207はEBL 牛 で は こ れ ま で に 報 告 の な い 新 た な 変 異 で あ っ た. 5.EBL牛 に 観 察 さ れ た 変 異 がp53の 機 能 に 及 ぼ す 影 響 腫 瘍 組 織 に 特 異 的 に 検 出 さ れ た 変 異 が 実 際 に EBLの 発 症 に 関 与 し て い る か 否 か を 明 ら か に す る た め,我 々 は こ れ ら の 変 異 が 野 生 型 本 来 の 機 能 お よ び 構 造 に 及 ぼ す 影 響 を 検 討 し た.我 々 はsite-directed mutagenesis法 に よ り,BLSC-KU-1細 胞 由 来p53cDNAク ロ ー ン よ り 野 生 型 お よ び4 種 類 の 変 異 型p53cDNA(R206K,H207P,R241 W,お よ びR242W)を 作 成 し た.こ れ ら を 哺 乳 動 物 細 胞 発 現 ベ ク タ ー に 組 み 込 み,以 下 の 機 能 解 析 に 用 い た(Tajimaら,1998). 1)転 写 活 性 化 能 p53の 転 写 活 性 化 因 子 と し て の 活 性 は,細 胞 増 殖 抑 制 や ア ポ トー シ ス を 誘 導 す る 上 で 非 常 に 重 要 で あ る.そ こ で 変 異 型p53の 転 写 活 性 化 能 を 調 べ る ため,我 々 はp53結 合 シ ス 配 列Fragment Aを ル シ フ ェ ラ ー ゼ 遺 伝 子 の 上 流 に 連 結 し た レ ポ ー タ ー ベ ク タ ー と 各 種p53発 現 ベ ク タ ー を 同 時 にp53遺 伝 子 欠 損 細 胞 株SAOS-2細 胞 に 導 入 し,ル シ フ ェ ラ ー ゼ 解 析 を 行 っ た(図4A).野 生 型 で 導 入 量 依 存 的 に 高 い 転 写 活 性 が 示 さ れ た 一 方,R241WとR242Wで は 顕 著 な 活 性 の 低 下 が 観 察 さ れ,転 写 活 性 化 能 は 完 全 に 消 失 して い た. ま た,R206Kお よ びH207Pで も活 性 の 低 下 が 観 察 さ れ た も の の,そ れ ぞ れ 野 生 型 の5∼7%お よ び13∼22%の 活 性 を 維 持 して い た.次 に 野 生 図4ウ シp53変 異 体 の 転 写 活 性 化 能(A) お よ び ト ラ ン ス ド ミ ナ ン ト抑 制 能 ( B) (A)SAOS-2細 胞 に 各 種 ウ シp53発 現 ベ ク タ ー と 共 に,p53結 合 シ ス 配 列FragmentAを ル シ フ ェ ラ ー ゼ 遺 伝 子 の 上 流 に 連 結 し た レ ポ ー タ ー ベ ク タ ーpGVP-FA5を 導 入 後,48時 間 後 に ル シ フ ェ ラ ー ゼ 解 析 を 行 っ た.ま たp53発 現 ベ ク タ ー は 量 を0.5μg (レ ー ン2,5,8,11,14,17),1μ9(レ ー ン 3,6,9,12,15,18),2μg(レ ー ン4,7,10, 13,16,19)と 変 え て 導 入 し た.(B) SAOS-2細 胞 にpGVP-FA5,野 性 型 p53発 現 ベ ク タ ー(0.3μg)に 加 え, 各 種p53発 現 ベ ク タ ー を 量 を 変 え て 導 入 し,同 様 に ル シ フ ェ ラ ー ゼ 解 析 を 行 っ た.
田 島 ・問:牛 白 血 病 ウ イル ス誘 発 性Bリ ンパ 腫 に お け る ウ シp53遺 伝 子 の変 異
表2各 種 ウ シp53に よ るSAOS-2細 胞 の 増 殖 抑 制(Tajimaら,1998よ り 引 用)
a Cells (8•~106) were cotransfected with 10ƒÊg of the indicated p53 plasmids with 2ƒÊ g of pSV ƒÀ-Galactosidase plasmid. At 24 hours post-transf ection, cells were cultured in the presence of 800ƒÊg of G418 per ml. The data shown present the relative number of drug-resistant colonies counted 3 weeks after transfection. Relative number was calculated as raw number of colonies/ƒÀ-Gal activity.
b Numbers in parentheses represent the calculated ratio of relative colony number relative to the relative number scored on the empty vector control plate. c The avarage of the three values determined for each plasmid is presented in the
last column.
型 の転 写 活 性 化 能 に対 す る変 異 型 の効 果 を調 べ る
た め,レ
ポ ー タ ー ベ ク タ ー と野 生 型p53発
現 ベ
ク ター に加 え,各 種 変 異 型 発 現 ベ ク ター を導 入 量
を 変 え て 同 時 にSAOS-2細
胞 に 導 入 し,ル
シ
フ ェ ラー ゼ解 析 を行 った(図4B).R206Kあ
る
い はH207Pを
野 生 型 と同時 に導 入 す る と,弱
い
な が ら も導 入 量 依 存 的 に転 写 活 性 の上 昇 が み られ
た.一 方,R241Wお
よ びR241Wで
は逆 に導 入
量 依 存 的 な活 性 の低 下(ド
ミナ ン トネ ガ テ ィブ作
用)が
み られ た.こ れ よ りR241Wお
よ びR241
Wは
野 生 型 の転 写 活 性 化 能 に 対 す る阻 害 能 を 有
す る こ とが示 さ れ た.
2)細
胞 増 殖 抑 制 能
p53遺
伝 子 欠 損 細 胞 株 内 で野 生 型p53を
強 制
発 現 させ る と細 胞 の増 殖 が阻 害 され る.我 々 は変
異 型p53の
細 胞 増 殖 に与 え る効 果 に つ いて 検 討
す る た め,コ ロ ニ ー形 成 能 検 定 を 行 った(表2).
SAOS-2細
胞 に野 生 型 お よ び各 種 変 異 型p53発
現 ベ ク タ ー(こ れ らの ベ ク タ ー は同 時 に ネ オ マ イ
シ ン耐 性 遺 伝 子 も有 す る)を 導 入 後,ネ
オ マ イ シ
ン存 在 下 で 培 養 し生 き残 っ た 細 胞 の コ ロ ニ ー の 数 を 比 較 し た.野 生 型p53発 現 ベ ク タ ー を 導 入 し た も の で は,コ ン ト ロ ー ル ベ ク タ ー 導 入 の も の に 比 べ て コ ロ ニ ー 数 が1%以 下 に 激 減 し た.R206 Kお よ びH207Pで は コ ロ ニ ー 数 は コ ン トロ ー ル の30∼50%に 減 少 す る に 止 ま っ た.一 方,R241 Wお よ びR242Wで は コ ロ ニ ー 数 の 減 少 は ほ と ん ど 観 察 さ れ な か っ た.以 上 の 結 果 か ら,転 写 活 性 化 能 が 消 失 し て い る 変 異 体 で は 増 殖 抑 制 能 も完 全 に 失 わ れ て い る こ と が 明 らか と な っ た. 3)立 体 構 造 ヒ トp53遺 伝 子 の 変 異 は,そ の タ ン パ ク 質 の 立 体 構 造 に 及 ぼ す 効 果 の 点 で 大 き く影 響 す る も の と ほ と ん ど 影 響 しな い も の の2つ に 大 別 さ れ る. 両 者 は 抗p53モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体Pab240に よ り簡 便 に 識 別 可 能 で あ る。 本 抗 体 は 免 疫 沈 降 反 応 時,立 体 構 造 が 変 化 し たp53と は 反 応 可 能 で あ る が 野 生 型 様 構 造 を と る タ ンパ ク 質 と は 反 応 で き な い(Gannonら,1990).我 々 は こ の 抗 体 を 用 い,SAOS-2細 胞 に 強 制 発 現 さ せ た 野 生 型 お よ び52 J. Anim. Genet., 27 (2) 1999 図5ウ シp53変 異 体 の コ ン フ ォ メ ー シ ョ ン変 化 SAOS-2細 胞 に 各 種 ウ シp53発 現 ベ ク タ ー を 導 入 し た.36時 間 後,一 部 の 細 胞 に つ い て は 細 胞 抽 出 液 を 得,ウ エ ス タ ン ブ ロ ッ ト解 析 に よ りp 53を 検 出 し た(A).残 り に っ い て は35Sメ チ オ ニ ン で 細 胞 内 タ ンパ ク 質 を 標 識 後 抽 出 液 を 得,抗p53抗 体Pab240を 用 い て 免 疫 沈 降 反 応 を 行 っ た(B).
表3野
生 型 お よび 変 異 型 ウ シp53の
機 能 お よ び立 体 構 造 解 析 結 果 ま とめ
(Tajimaら,1998よ
り引 用)
a Intensity of activities : -, none ; +, slight ; + +, moderate ; + + +, marked. b Reactivity with Pab 240 in immunoprecipitation : -, none ; +, weak ; + +, strong. c ND, Not determined. 各 変 異 型p53に つ い て 免 疫 沈 降 反 応 を 行 っ た (図5).野 生 型 導 入 細 胞 抽 出 物 か ら はp53の 沈 降 が 全 く み ら れ な い の に 対 し,R206Kお よ びR 242Wで は 沈 降 物 中 にp53が 強 く 検 出 さ れ た.ま た,R241Wで もp53の 沈 殿 が 確 認 さ れ た が 非 常 に 微 量 で あ っ た.こ れ よ りR206Kお よ びR242 Wはp53の 立 体 構 造 に 異 常 を も た ら す 変 異 で あ り,一 方R241Wは 構 造 よ り は む し ろDNAと の 直 接 的 な 結 合 に 影 響 を 及 ぼ す 変 異 と示 唆 さ れ た. ま た,コ ド ン207がPab240の エ ピ トー プ に 位 置 し て い た た め,H207Pは こ の 抗 体 との 反 応 性 が 失 わ れ 解 析 不 能 で あ っ た.
田島 ・間:牛 白血 病 ウ イ ル ス誘 発 性Bリ ンパ腫 に お け る ウ シp53遺 伝 子 の 変 異 機 能 解 析 の 結 果 を 表3に ま と め て み た.4種 類 の 変 異 型p53は2つ の グ ル ー プ に 分 類 可 能 で あ っ た.グ ル ー プI(R206Kお よ びH207P)は, 野 生 型 の 活 性 を 一 部 維 持 し て い る こ と か ら,EBL 誘 導 に お い て 補 助 的 な 役 割 を 担 っ て い る も の と思 わ れ る.一 方 グ ル ー プII(R241Wお よ びR242 W)は,野 生 型 が 有 す る機 能 が ほ ぼ 完 全 に 消 失 し て い る だ け で な く,野 生 型 に 対 す る 阻 害 活 性 を も 有 し て い る こ と か ら,単 独 で 腫 瘍 を 誘 導 す る 可 能 性 が 示 唆 さ れ る.で は こ こ で,2つ に 群 分 け した 変 異 型p53はEBLの 発 症 に ど の よ う に 関 わ っ て い る の で あ ろ う か(図6).EBLの 発 症 過 程 は 無 兆 候 期,PL期,そ して 発 症 期 の3つ の ス テ ー ジ に 分 類 可 能 で あ る.こ れ ま で に,BLVに コ ー ドさ れ る遺 伝 子 産 物 の 一 つ で あ るTaxは,ウ イ ル ス 遺 伝 子 発 現 の 活 性 化 の み な らず,単 独 で 初 代 培 養 細 胞 の 不 死 化 を も誘 導 可 能 で あ る こ と が 明 ら か と な っ て い る(Willemsら,1990).し た が っ て, BLV感 染 後 ま ずTaxが 健 康 な 状 態 か らPLに 至 る 過 程 を 誘 導 す る.さ ら に 白 血 病 へ と進 行 す る た め に は,グ ル ー プIIの よ う なp53の 変 異 は 単 独 で,ま た グ ル ー プIの よ う な 変 異 は 他 の 要 因 と共 同 し て 作 用 す る と考 え ら れ る.し か し,発 症 個 体 の う ち の20%で し かp53遺 伝 子 に 変 異 が 観 察 さ
図6EBL発
症 過 程 にお け るp53遺
伝 子 の
変 異 の関 与(モ
デ ル)
牛 白 血 病 ウ イ ル ス(BLV)は,ウ
シ
に抗 体 陽 性 の無 兆 候 健 康,持 続 性 リン
パ球 増 多 症(PL),さ
らに長 い潜 伏 期
を 経 た 地 方 病 性 牛 白 血 病(EBL)を
引 き起 こ す.本 研 究 で は,p53の
変
異 は発 症 牛 の み にお い て検 出 され た.
図 の詳 細 な説 明 につ い て は本 文参 照.
れ な い こ とか ら,そ の 他 の 発 症 個 体 で はp53以
外 の要 因(p53以
外 の癌 抑 制 遺 伝 子 あ る い は癌 遺
伝 子etc.)が
発 症 に 関 与 して い る も の と 考 え れ
る.
6.お
わ
り
に
我 々 はBLV誘
発 性 腫 瘍 でp53遺
伝 子 上 に変 異
が生 じて い る こ とを確 認 した.さ
らに これ らの変
異 が 重 篤 なp53の
機 能 異 常 を 引 き起 こす こ と も
明 らか に した.最 近,p53に
類 似 した 遺 伝子 が ヒ
トで 相 次 いで 同 定 され て い る.今 後,ウ
シ にお け
る これ ら一 連 の 遺 伝 子 の ホ モ ロ グの 単 離 が 待 た れ
る.
謝
辞
投 稿 の機 会 を与 え て くだ さ っ た編 集 委 員 長 の小
松 正 憲 先 生 に感 謝 い た します.
参
考
文
献
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