Title
Studies on Influence of Hydrostatic Pressure on Yeast Cells and
Application to Industrial Yeast for Developing New Methods( 内
容と審査の要旨(Summary) )
Author(s)
濱田, 和広
Report No.(Doctoral
Degree)
博士(農学) 乙第154号
Issue Date
2019-09-20
Type
博士論文
Version
ETD
URL
http://hdl.handle.net/20.500.12099/79037
※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。［１］
氏 名（本（国）籍） 濱田 和広（埼玉県） 学 位 の 種 類 博士（農学）
学 位 記 番 号 農博乙第１５４号 学 位 授 与 年 月 日 令和元年９月２０日
学 位 論 文 題 目 Studies on Influence of Hydrostatic Pressure on Yeast Cells and Application to Industrial Yeast for Developing New Methods
（高圧が酵母細胞に与える影響と産業用酵母の新し い育種方法についての研究） 審 査 委 員 会 主査 岐阜大学 教 授 岩 橋 均 副査 岐阜大学 教 授 鈴 木 徹 副査 産業技術総合研究所 教 授 堀 江 祐 範
論 文 の 内 容 の 要 旨
高圧の微生物に対する影響はその種類により異なる。例えば大腸菌は 550MPa 以上 でないと死滅しないが、酵母は40～150MPa といった低い圧力でも大きな影響を受け て死滅する。酵母の代表であるSaccharomyces cerevisiae は全遺伝子配列や細胞内の 機能が解明されているため、酵母を材料として高圧による影響が研究されるようになっ てきた。 酵母細胞は圧力の上昇に伴い影響を受け、細胞内から金属イオン、アミノ酸およびペ プチドなどの内部物質が漏洩した。電子顕微鏡による高圧により影響を受けた細胞の器 官を観察すると、細胞膜や核膜が影響を受けていることが分かり、特に 100MPa の比 較的低い圧力下においても、核膜の構造の一部が破壊された細胞が 14％観察された。また、Candida tropicalis を 4, 6-diamidino -2- phenylindole (DAPI)で染色した細胞 でも同様の結果が得られた。詳細に細胞内部の構造に与える高圧の影響を観察するため に、S. cerevisiae BY4741 のゴルジ体や核膜等の細胞内器官を GFP で染色した細胞 を作成し、種々の圧力下で菌体の生存率と各組織の構造変化を顕微鏡にて観察を行った。 その結果、50MPa の低い圧力下で、核膜がダメージを受け、断片化して細胞が死滅す ることが判明した。以上の結果は、高圧により細胞の膜系、特に核膜が影響受けやすく、 その結果として細胞が死滅することが分かった。 出芽酵母及び分裂酵母を材料として、高圧による細胞内器官への影響を研究する過程 で生存した細胞の中に、染色体の一部が欠落したものや、染色体数が2 セットになった ものが高い頻度で出現することを発見した。 色素を添加した栄養培地に圧力処理を行った細胞懸濁液を塗布して培養すると、親株
とは明らかに色調の異なったコロニーや小さなコロニー（呼吸欠損株と推定）が多数出 現した。圧力と変異株との関係を検討するため、２倍体株である S. cerevisiae P544 （MAT a/α）に高圧をかけると、圧力が高くなるに従い色調の異なったコロニーの出 現率が増加し、200MPa では約 20％まで増加した。取得された変異株の一つである P544 V1 の細胞径は、5.51μm であり、4 倍体株であることが分かっている P599 株の 5.69μm と近似しており、2 倍体である親株 P544 の 4.18μm と比較すると明らかに 細胞が大きくなっていた。またP544 V1 の DNA 含量は、細胞 109あたり63.3μg で あり、親株であるP544 株の DNA 含量 27.5μg の約 2 倍となっていた。P544 V1 を含 む変異株を培養して得た菌体から染色体を抽出し、電気泳動法により染色体泳動パター ンを確認したところ、染色体の一部が欠落したものや、P544 V1 のように親株と全く同 じパターンの変異株も確認できた。P544 V1 のランダム胞子分析による MAT の分離比 は、a:α:non＝1:1:4 となり 4 倍体の分離比と同じであった。以上の結果から取得され た変異株は、MAT（a/a/α/α）の自己 4 倍体株であることが判明した。 同様の現象は、1 倍体株である HF399s1（MATα）を高圧で処理を行った場合にも 観察され、出現した全ての変異株はMAT（α/α）であり、元の接合型を継承していた。 変異株の出現率は、対数増殖期の細胞を用いた場合に高くなることから、変異株の出現 率は、細胞周期と関係していることが示唆された。これらの結果は、細胞分裂している 細胞が圧力を受けると、チューブリンやspindle pole body 等の核分裂に関連する組織 が影響を受け、染色体の分裂が正常に行われず、染色体が二対の状態で増殖を開始する ために倍数化するものと考察した。圧力処理を行った細胞を電子顕微鏡により詳細に観 察すると、細胞分裂時に出現するチューブリンやspindle pole body が影響を受け、消 失した細胞が多数観察された。
高等生物により近い分裂酵母であるS. pombeは、100MPa を超えると、細胞生存率
が劇的に低下したことから、S. pombeは高圧に対して感受性が高いことが判明した。
実験室株であるS. pombe JY333 (ade6-M216 leu1 h-)を用いた実験で、高圧によりS.
cerevisiaeと同様に倍数化した細胞が取得され、遺伝子マーカーであるade6要求性の 分離比から自己2 倍体株であることが判明した。 以上の結果より、高圧はパン酵母等の醸造用酵母だけではなく、高等生物等の育種技 術として有効であることが示唆され、従来から魚類の卵に圧力をかけることで、染色体 が増加した魚が育種できるという現象面での知見が、本研究でそのメカニズムが明らか となった。 酵母の古典的育種法は、有用な性質を持った親株から胞子分離にて得た1 倍体株を性 的接合法により別の形質を持った 1 倍体と交雑させ、安定な 2 倍体株を作成するとい う方法が用いられている。胞子形成を行った細胞から栄養細胞を除去し、胞子のみを分 離する方法は、熟練と手間が伴う作業である。胞子と栄養細胞は、圧力による耐性が異 なることから、この差を利用して胞子分離を簡便に行う方法を開発した。 従来からUV 処理等の物理的方法や NTG、EMS 等の化学物質を用いて、突然変異株 の作成が行われてきているが、これらの方法は、実用的に有用な遺伝子が欠落した変異
株が取得される場合が多い。パン酵母において冷凍耐性や高糖生地性能等の有用な性質 を保持したままで、他の性質が良好な菌株を開発できる可能性がある。筆者は、この手 法を用いて実用パン酵母を開発し、現在でもこの酵母菌株がパン業界で使用されている。 以上、本研究では、高圧の微生物に対する影響に関する基礎的な知見を蓄積すると共に当 該知見を利用した実用酵母株の育種への利用に成功し、育種株は実用酵母として利用され ている。
審 査 結 果 の 要 旨
申請者、濱田和宏は酵母Saccharomyces cerevisiaeに対する高圧の影響を研究し、 当該結果を用いた新しい酵母の育種法を開発、実用酵母の取得に成功した。大腸菌は 550MPa 以上でないと死滅しないのに対して、酵母は 40～150MPa といった低い圧力 でも大きな影響を受けて死滅することを明らかにした。また、細胞内から金属イオ ン、アミノ酸およびペプチドなどの内部物質が漏洩させることも確認した。電子顕微 鏡による高圧により影響を受けた細胞器官の観察では、核膜構造への影響を明らかに した。さらに、高圧下において、染色体の一部が欠落したものや、染色体数が2 セッ トになったものが高い頻度で出現することを発見した。 酵母の育種において、従来ではUV 処理等の物理的方法や NTG 等の化学物質を用 いた。これらの方法は、実用的に有用な遺伝子が欠落した変異株が取得される場合が 多いという欠点もあった。そこで、高圧を用いたパン酵母の育種を検討し、冷凍耐性 や高糖生地性能等の有用な性質を保持したままで、他の性質が良好な菌株の取得に成 功した。現在でもこの酵母菌株がパン業界で使用されている。 審査委員会は、上記の内容が学術的に充分であることを確認した。 基礎となる学術論文1）Kazuhiro Hamada, Yasuo Nakatomi, Shoji Shimada, Direct induction of tetraploids or homozygous diploids in the industrial yeast Saccharomyces
cerevisiae by hydrostatic pressure, Current Genetics, 22,371-376,1992 2) Kazuhiro Hamada, Yasuo Nakatomi, Masako Osumi, Shoji Shimada, Direct induction of homozygous diploidization in the fission yeast Schizosaccharomyces pombe by pressure stress,FEMS Microbiology Letters, 136, 257-262
3) Kazuhiro Hamada, Akihisa Miwa, Ukyo Takahashi, Hitoshi Iwahashi, Critical events leading to cellular mortality of yeast cells following hydrostatic pressure treatment, High Pressure Research, 39, 267-272 , 2019
既発表論文
1) Ultrastructual effects of pressure stress to the nucleus in Saccharomyces
cerevisiae a study by immunoelectron microscopy using frozen thin section, Hiromi Kobori, Mamiko Sato, Akane Tameike, Kazuhiro Hamada, Shoji Shimada, Masako Osumi,FEMS Microbiology Letters, 132, 253-258, 1995
2) Mamiko Sato, Hiromi Kobori, Sanae A. Ishijima, Zha Hai Feng,
Kazuhiro Hamada, Shoji Shimada, Masako Osumi Schizosaccharomyces pombe is More Sensitive to Pressure Stress than Saccharomyces cerevisiae, CELL
STRUCTURE AND FUNCTION, 21, 167-174, 1996
3) Ukyo Takahashi, Kazuhiro Hamada, Hitoshi Iwahashi, Critical damage to the Cellular of Saccharomyces cerevisiae under sublethal conditions upon high pressure carbon dioxide treatment, High Pressure Research 39, 273-279, 2019
