神経変性疾患の病態制御：リバーストランスレーシ ョナルニューロサイエンスリサーチの実践
著者 葛巻 直子
雑誌名 星薬科大学紀要
号 61
ページ 1‑6
発行年 2019‑12‑10
URL http://id.nii.ac.jp/1240/00000817/
脳内ドパミン神経系は､ 情動の制御や運動機能調節の みならず､ 認知機能､ 免疫あるいは内分泌系の制御にも 関与し､ 多彩な役割を果たす｡ ドパミン神経系の起始核 は､ 中脳あるいは視床下部に分布しており､ 大脳基底核 や大脳皮質に投射することが知られている)｡ その中で も､ 大脳辺縁系に存在する黒質緻密部より､ 線条体に投 射する黒質−線条体ドパミン神経系は､ 運動機能調節に 重要な役割を担うことが明らかとなっている)｡ 神経変 性疾患の一つであるパーキンソン病は､ 黒質−線条体ド パミン神経の変性・脱落により､ ドパミン神経伝達障害 が生じ､ 振戦､ 筋固縮､ 無動､ 姿勢反射障害を主徴とす る運動機能障害を生じる疾患である｡ パーキンソン病患 者の約
〜％は特定遺伝子の変異が原因となり発症す る遺伝性であることが知られているが､ パーキンソン病 は孤発性に発症する場合が多く､ 環境要因などの外的要 因により､ 後天的に細胞内環境が変化して､ 発症するこ とが明らかになっている)｡ こうした背景から､ パーキ ンソン病研究を通して､ 脳神経系細胞の特異的な変性・脱落メカニズムを理解することは重要な課題であり､ 認 知症などの他の神経変性疾患メカニズムの解明にも繋が ると考えられる｡ パーキンソン病を始めとする難治性脳 疾患研究においてゲノム解析は著しく進んでおり､ 疾患 の原因となる候補遺伝子が数多く提唱されている｡ これ ら遺伝子を強制発現あるいはノックダウンした培養細胞 系やモデル動物の解析から､ パーキンソン病発症の原因 として､
-
の凝集､ ミトコンドリアの機能障 害や酸化ストレスによる細胞脆弱性など､ 様々な仮説が 報告されている)｡ しかしながら､ 遺伝子改変マウスで は錐体外路症状の再現が困難であり､ 黒質−線条体ドパ ミン神経細胞の特異的な変性・脱落機構については未だ解明に至っていない｡
一方､ 近年の技術革新により､ 多能性幹細胞である
() 細胞が発見され､ 実際の 患者ゲノム情報を保持した細胞内環境において､ 疾患表 現系の解析を行うことが可能となった｡ 小分子化合物や
を組み合わせることによって､
細胞由来神 経幹細胞に領域特異性を持たせ､
細胞を疾患感受性 細胞へと分化誘導させることにより､ 細胞種特異的な変 化の抽出が進んだ｡ また､ 組織や細胞特異的なプロモー ターの下流で
酵素を発現させ､
システムを はじめとした組み換えシステムを利用して､ げっ 歯類の脳内場所特異的に標的遺伝子の発現を制御するこ とが可能となり､ 脳内局所における標的遺伝子の発現制 御と行動表現系を結びつけることが可能となった｡ これ まで､ 我々の研究室では､ 上述したヒト疾患特異的
細胞研究と
in vivo
脳神経科学研究の2
つのアプローチ を組み合わせることにより､ ヒト疾患特異的iPS
細胞 研究より明らかとした細胞種特異的な変化を､ げっ歯類 の脳神経細胞種特異的に再現し､ 臨床的な情報を基礎的 な研究へと応用する､ 新たなリバーストランスレーショ ナルニューロサイエンスリサーチを展開している｡ 本稿 では､ 最新の知見を踏まえて､ リバーストランスレーショ ナルニューロサイエンスリサーチの構築と実践について 概説する｡!
細胞は､ 多分化能と自己複製能を有する多能性幹 細胞である｡
細胞は特定の個人由来の体細胞より樹 立され､ 目的の細胞へと分化誘導が可能であり､ 生体内 で起きている事象を生体外において再現可能であるため､
病態モデルとしての有用性が高い｡ 例えば､ パーキンソ
. "#$ %& & '()
!"#!$ %&'()* +,-.#!
, /01
巻 直 子
星薬科大学 薬理学研究室
*+ ,-. -/ 0*.0-1+ 2-.-31452-64/4142*+ 746 84*8489 2*0+ 04-3 2474284+ 2*18. *+ -1*.1452-80 41042484*20,
:;<$=$><?
@ABCDE FAGEHIJKCDFCLHM HNOPQHRKSTGS UADRS E O
ン病などの神経変性疾患においては､ 生存している患者 の脳から疾患責任細胞の一つであるドパミン神経細胞を 採取することは不可能である｡ また､ 剖検脳を用いても､
病態の進行により既に変性・脱落した脆弱な神経系細胞 を採取することも困難であるため､ ヒト疾患特異的
細胞技術を応用した疾患解析は非常に有用なアプローチ であると位置付けられる｡
細胞を疾患解析に必要な 目的の細胞へと分化誘導させるためには､ 発生過程にお ける細胞の領域特異性を考慮する必要があり､ 胚性幹細 胞からの器官や組織への成り立ちを理解し､ 生体内にお ける神経発生システムを応用することで､
細胞から の特定神経系への誘導が可能となる｡ 従って､ 特定の神 経細胞を誘導する場合においては､ その神経細胞の発生 段階における領域特異性を考慮し､ 初期胚において前後 軸や腹側・背側を制御することにより､ 目的の細胞へと 誘導が行われている｡ そこで､ 本研究では､ こうした分 化誘導技術を応用することにより､ パーキンソン病の疾 患責任細胞の一つである中脳ドパミン神経細胞へと分化 誘導を行い､ 病態下におけるドパミン神経の脆弱性に関 わる因子を抽出することを目的として､ 検討を行った｡
多くの場合､ パーキンソン病は孤発性に発症するが､
一部の患者において､ 遺伝性パーキンソン病の存在が認 められ､ 疾患への遺伝子変異の関与が認められている｡
年に優性遺伝性パーキンソン病の原因遺伝子であ る-synuclein
が単離同定され6)､ その翌年には､ 本邦 において､ 若年性パーキンソン病の中で､ 最も発症率の 高いparkin
が単離同定された7)｡ 現在まで､ 遺伝性パー キンソン病の原因遺伝子として､18種類同定されてい
る｡ また､ これらの原因遺伝子を元に翻訳されたタンパ クの機能は､ 膜輸送､ オートファジーやユビキチン-プ ロテアソームなどの蛋白分解系､ 酸化ストレス､ ミトコ ンドリア機能などに関わることが明らかにされている｡これまでに､ 常染色体優性型パーキンソン病の原因タン パクである
-
および また､ 常染色体 劣性型パーキンソン病の原因タンパクである､
および
に関する機能解析が精力的に進めら れてきた｡ しかしながら､ パーキンソン病における､ 黒 質線条体ドパミン神経細胞の特異的な変性・脱落のメ カニズムは未だ明確になっておらず､ 数多くの研究者が この課題に取り組んでいる｡ 我々は､ 若年性パーキンソ ン病の一つで､ ユビキチンリガーゼであり､ オート ファジーやマイトファジーに関わる分子として知られて いる
に欠失の認められる患者
細胞よ り､ 中脳ドパミン神経細胞を誘導し､ 疾患解析を試みた｡
細 胞 か ら 神 経 系 細 胞 へ の 誘 導 は
! " #
により､!# $# #% " #"
(&
) シグナルと' ( # $ %% #)" ( " #
('*+
) シグ ナルを､ 小分子化合物を用いて､ 同時に阻害することに より行った｡細胞内のこれら経路を阻害することに より､ 効率的に
細胞より神経系細胞への誘導が可能 となった｡ 次に､ 中脳腹側領域へ領域特異性を誘導する ために､ 中脳
,#$
神経の発生において､ 腹側側へ の分化誘導に関わる# ,% #%
() および中脳 への領域特異性を誘引する
+ ! #! "% #)" ( " #-!
(+*+-!) の存在下で培養することにより､
,#$
神 経細胞への分化誘導を行った｡ その結果､ 誘導した神経 細胞は､,#$
合成の律速段階の酵素である" # , #.
('/
) 陽性の,#$
神経細胞群であるこ とが確認された-)(図)｡こうした手法を用いて､ 健常者ならびにパーキンソン 病患者
細胞よりドパミン神経細胞へ誘導を行った結 果､ 健常者とパーキンソン病患者間において､
'/陽性
ドパミン神経細胞への分化誘導効率に大きな変化は認め られなかった｡ また､ 乳酸脱水素酵素 (/
) や活性 酸素種 (0
) を指標として､ 細胞の脆弱性について検 討を行ったところ､ パーキンソン病患者細胞由来ド パミン神経細胞において､ 細胞の脆弱性が認められた)｡ これまでの先行研究では､ 同一患者の
細胞から誘導 した神経細胞において､ 異常ミトコンドリアの蓄積や酸 化ストレスが亢進することが明らかにされている)｡ す なわち､
1 231 34
における､ 本疾患モデルは､ ドパミン 神経細胞を変性・脱落へと導く､ 脆弱化の過程の初期症 状をトレースする有用なパーキンソン病態モデルである 可能性が示唆された｡5 67 !"#$%
健常者あるいはパーキンソン病患者由来の
細胞を 用いて､ ドパミン神経細胞を誘導し､ 疾患関連遺伝子発 現の変化をマイクロアレイ法に従い､ 網羅的な検討を行っ
# . /# 8 9: #: ;<
5 67
た｡ その結果､ 健常者と
患者細胞由来ドパ ミン神経において､ 各種遺伝子の発現パターンに違いが 認められた｡ 特に､ ドパミン神経の器質的あるいは機能 的調節に関わる因子を抽出して検討を行った結果､ 患者
細胞由来ドパミン神経細胞では､ ドパ ミ ン の 代 謝 酵 素 で あ る
-
() の著明な発現増加が認められた)｡ また､ 患者由来細胞由来ドパミン神経における 発現の有意な増加は､
細胞からドパミン神経 細胞への分化系譜に伴って増加することが明らかとなっ た｡ さらに､ 並行して､ ドパミン神経の器質的あるいは 機能的調節に関わる因子に関して､ 網羅的なエピジェネ ティクス修飾解析を行った｡ これまでの報告により､ 孤 発性のみならず単一遺伝子により引き起こされる家族性 のパーキンソン病においても､ 病態に関わる分子の発現 に関わるエピジェネティック修飾が重要である可能性が 示唆されている)｡ また､ エピジェネティック修飾は感 染や炎症､ ストレスなどの刺激､ 食物あるいは老化など によっても惹起されることが明らかとなっている｡ さら には､
のメチル化修飾機構において､ の転写
開始点直上の アイランドのシトシンがメチル化さ れることにより､ 転写が抑制されることはよく知られて いる｡ そこで､ 本研究では､細胞由来ドパミン神経 細 胞 内 に お け る メ チ ル 化 に 着 目 し ､
! "
を用いて､
#$%#
個の サイトに ついて検討を行った｡ その結果､ 患者細胞 由来ドパミン神経細胞内で､ のメチル化が 著明に低下 (脱メチル化) していることを見出した) (図)｡
さらに､
遺伝子特異的なメチル化の変動 に着目し､ 特定領域内に含まれる サイトにおける メチル化の割合ならびに頻度の変化について､&"
'
(&
) 法やバイサルファ イトシーケンス法に従って解析を行った｡ その結果､ 遺伝子転写開始点近傍の サイトは､ 健常者では高メチル化状態にあるのに対し､ パーキンソン病患 者
細胞由来ドパミン神経細胞では､ 低メチル化状態 であることが明らかとなった)｡ 以上より､ 患 者
細胞由来ドパミン神経細胞内では､ 遺伝 子の転写開始点直上において､ 著明な の脱メチル 化が引き起こされることが明らかとなった｡ ドパミン代 謝酵素であるは主にアストロサイトに発現して いることが知られており､ 正常状態のドパミン神経細胞 内には､ 僅かな発現しか認められない｡ 今回の研究にお いて､ エピジェネティクス修飾を伴ったの発現 増加が
細胞由来ドパミン神経細胞質内で認 められたことから､ パーキンソン病態下では､ 異所性に の発現が増加する可能性が示唆された｡
( )* + ,-+ -.
!"#
!$%&'(
次に､ パーキンソン病患者
細胞研究より得られた ドパミン神経細胞特異的な変化を､ げっ歯類の黒質ド パミン神経細胞特異的に再現させるために､ 新たなリバー ストランスレーショナルニューロサイエンスリサーチを 構築した｡ これまでの研究技術では､ 標的分子の遺伝子 改変マウスを用いた解析において､ 時間の経過とともに､
代償機構が働いてしまうため､ 錐体外路症状が再現でき ない場合が多かった｡ そのため､ 本研究では､ プロモー ター特異的に
酵素を発現させたマウスに､
/012 3
システムを搭載したアデノ随伴ウイルスベクター (4
) を領域特異的に微量注入することにより､ 場所 特異的に標的遺伝子を過剰発現させるシステムを構築し た｡ すなわち､5 (
) のプロモー ターの下流に酵素を発現させたマウスに､
4 67 67 1 /
を 黒 質 に 微 量注入することにより､ 黒質のドパミン神経細胞特異的 にを過剰発現させ､ 行動表現系の評価を行った｡その結果､
4
微量注入後､ 約ヵ月後において､ 顕 著な錐体外路障害が認められた)｡ 以上より､ 黒質ドパ ミン神経細胞内特異的なの発現増加は錐体外路 障害を惹起させることが明らかとなった｡ 特筆すべき点 としては､ 今回の検討において､ マウス黒質ドパミン神 経細胞にを過剰発現させてから､ 徐々に錐体外 路障害の発現が認められ､ ヵ月程度経過した後に､ 有 意な差が認められた点である｡ こうした結果は､ 増加し たはドパミン代謝酵素としての役割のみならず､ のドパミン神経細胞内における異所性発現に伴っ た酸化ストレスの亢進を引き起こすことで､ 細胞脆弱性 が惹起された可能性が高い｡ 一般に､ は染色体 上では､&
にコードされており､&
は精神疾患 の発症との関連性が深いことが報告されている#8)｡ ま. 9: '; ; <%=>
( )*
!"
た､ これまでの研究より､
には遺伝子多型が存 在することが明らかとなっており､ アミノ酸配列の 番目がバリンからメチオニンに置換されるアミノ酸変異 ( ) が精神症状や疼痛感受性に関わることが 報告されている)｡ さらに､ 最近の報告より､ パーキ ンソン病の発症リスクに､が関わる ことが明らかとなっている)｡ このように､ 多くの研究 より､ の機能変化が脳神経系機能調節へ及ぼす 影響の重要性が示唆されている｡ 本研究では､ ドパミン 神経におけるエピジェネティクス修飾を伴った の異所性発現増加がきっかけとなり､ パーキンソン病態 を引き起こす可能性を明らかとした｡
In vivo
における 検討においては､ ドパミン神経細胞内におけるCOMT
の発現増加と共に､ ドパミン神経細胞の細胞老化による 微小環境の変化によって､ ドパミン神経細胞の脆弱性が 助長され､ 錐体外路障害が認められるまでに至った可能 性が考えられる｡一方､ 最近では､ パーキンソン病態において､ 運動症 状のみならず､ 睡眠障害､ 痛覚過敏､ 便秘などの消化器 症状､ さらには認知障害を伴うパターンなど､ パーキン ソン病に付随した様々な非運動症状に注目が集まってい る) (図
)｡こうした非運動症状はパーキンソン病発症初期に認め
られるものが多く､ 早期発見・診断にも繋がると考えら れる｡ 非運動症状は､
-
などの異常タンパク の蓄積や遺伝子異常による影響が黒質−線条体のドパミ ン神経のみならず､ 大脳皮質領域のドパミン神経などに 認められることにより､ 発症に至ると考えられている｡また､ パーキンソン病態においては､ ドパミン神経細胞 のみならず､
神経系などにおいても､ 器質的障 害が生じている可能性が考えられる｡ 我々も細胞の 特性を生かして､ グルタミン酸神経､ 神経ある いは知覚神経に分化誘導させることにより､ 異なる神経 系サブタイプにおける疾患感受性遺伝子の影響について 検討を行なった｡ その結果､ 患者
細胞由来 神経において､ ソマトスタチンの発現低下が引 き起こされていることが明らかとなった)｡ ソマトスタ チンは
神経系において､ と ! " !
として働いていることが最近の研究では明らかとなって おり#)､ と協調して生理作用を発揮している可能 性が考えられる (図#
)｡また､ パーキンソン患者の脳脊髄液では､ ソマトスタ
チン量の低下が引き起こされていることが臨床研究より 明らかとなっていることから)､ パーキンソン病患者特 異的
細胞由来神経を用いて導き出した今回 の結果は､ 臨床所見とも一致している｡ さらに､ 現在､
我々は､ パーキンソン病態における知覚応答異常に着目 し､
患者細胞より知覚神経細胞を分化誘導 することにより､ 知覚神経細胞における器質的な変化の 抽出についても検討を試みている｡ このように疾患特異 的
細胞を用いた研究では､ 同一患者より､ 様々な領 域の神経細胞へと誘導することによって､ 細胞種横断的 に解析を行うことが可能である｡ こうした一連のアプロー チにより､ パーキンソン病態下における全身症状の理解 に繋がって行くことが期待される｡
これまで､ 基礎的な研究から臨床現場への橋渡し研究 であるトランスレーショナルリサーチによって､ 数々の 成果が導き出され､ 基礎研究における優れた成果から､
革新的な診断・治療へと繋がった｡ 一方､ 本研究では､
ヒト疾患特異的
細胞研究より見出した細胞種特異的 な変化を､ げっ歯類の脳神経細胞種特異的に再現するこ とを可能としたリバーストランスレーショナルニューロ サイエンスリサーチを展開した (図)｡
本研究においては､ 代表的な神経変性疾患であるパー
! . $ %& '( ) ( *
+ ,- ./0/
!"#$%&'(
キンソン病を中心として､ ドパミン神経細胞を中心とし た細胞種特異的な脆弱性に関わる分子を神経科学的ある いは遺伝子工学的な手法を駆使して明らかにした｡ 現在 は､ 神経難病である線維筋痛症のメカニズム解明につい
て同様のアプローチに従い検討を進めている｡ 今後､ こ うした取り組みが､ 新たなモデル動物の構築や､ 未だ明 らかとされていない難治性疾患の発症機序解明や治療法 の開発に貢献することを期待してやまない｡
本研究を遂行するにあたり､ 平成
年度星薬科大学 大谷記念研究奨励金を賜りましたことに対し､ 大谷卓男 理事長ならびに選考委員会の先生方に深く感謝申し上げ ます｡ また､ 本研究の遂行のために多大なるご指導を賜 りました星薬科大学薬理学研究室の成田年教授に心より 御礼申し上げます｡ さらに､ 国立がん研究センターエピ ゲノム解析分野 牛島俊和分野長､ 慶應義塾大学医学部 生理学教室 岡野栄之教授､ 順天堂大学医学部脳神経内 科 服部信孝教授に貴重なご助言ならびにご支援を賜り ましたことを心よりお礼申し上げます｡ 最後に､ 本研究 を進めるにあたり､ 共に取り組んで参りました須田雪明 博士､ 岩澤千鶴博士はじめ､ 多大なるご協力をいただき ました薬理学研究室の教室員の皆様に深謝いたします｡