滑 液 膜 発育 超徴構造

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マ ウ ス 滑^液膜^の発 育^と超 徴 構 造

金 沢 大 学 医 学 部病理学 第 ^一講 座 ( 主 任 ^: 梶 帖 欽^一 郎 教 授)

岡 田 保 典

( 昭 和53 年1月10 日受 付)

関 節^の様^々な病 的 変化を 理解 する た め^には, 関節 滑 液 膜^の発 生^. 構造 及び機能を知る^こと が 必要で あ る^･ 滑 潮 其^の構 造や発生に関し^て, 従来^いく^つか^の光 顕 的及

び電顕 的 研 究が報 告さ れ^{て い}る が, 多 く^の未 解 決な問 題 点が残さ れ て^いる. 例え ば, 関 節腔^の形 成機 序に関 し^て ほ^. 酸性^{ム コ}多 糖^の過 剰 分泌を電 視 する誠^一冊と.

細胞^の変 性や細胞 間^マ ト リックス の 融 解容量 祝 する 説^{4 卜7}躯 対 立し て^いる^. 又, 滑 液 膜 細 胞^の構 造と機 能に

っい ては.Ba rla nd ら は^{8 1}滑 液 膜 細 胞を A 型,B 型細 胞

に分 類し た が,A 軋B 型 細 胞^の中 間 型^の細 胞^の存 在を 指 摘 する研 究者 もあ り^{9 ト 川,} そ れ らの細 胞^の機 能^に つ いて は十 分 解 明さ れ て^いない. さ ら に, 滑 液 膜^の細 胞 間 物 質^の研 究はきわ め て少なく, そ^の構 成 成 分^の化 学 的 性 状に関してはヒ ア ル ロ ン酸を除^いて ほ と ん ど不 明

であ る^{1 2 卜14 I}

著者はこれ ら^の諸 問題を解 明す る目 的で^マウ^{ス の}胎 生 期から成 熟 期ま で^の滑 液 膜 を電 顕 的に観 察し, 滑 液 膜^の発 生, 分 化に伴う構造の変 化, とく^に関節 腔^の形 成 過 程, 滑 液膿 細 胞^の形 態 学 的 特 徴と機 能^, 及 び細胞 間 物質^の性 状について知 見を得たの で報 告 する^･

実 験材料と 方 法

材 料と して, 胎 生1 4 ^〜18 日^. 生 後 ₁ , 3, 5.

8^. 12 , 15, 20 , 27 日^, 3 及び6 ヶ月^の d d 系

マ ウ ス膝 関節 滑 液 膿 を 用^いた^. 胎 生 期 及び生 後 27 日 ま で^{のマ ウ ス}で は, 断 頭後 下肢を大 腿部で切 断し^, 膝 関 節を固定 液 中で正 中 矢 状 断し材 料と し た. 生 後3 及 び6 ヶ月^{のマ ウ ス}は, 頚 椎 脱 臼に よ^って殺し^, 膝 関 節 を露 出後^, 翼 状^ヒダ を含む膝蓋 下 脂 肪 体^を採 取し た^･ 材 料は.2.5 % ダ^ルク ^{ー ル ア ル} デ^ヒド( 0^.05M カ^コ ジ

ル酸^ソー ダ緩 衝 液pH 7 .4) ^で 4⁰c,60 分 間 固定 後^,2 % オ^ス ミウ ム 酸 ( 0^.05 M カ^コ ジル酸^{ソ ー} ダ緩 衝 液

pH 7.4)で 4⁰c ,90 分 間後 固 定^を行な^っ た^･次^いでエタ ノ ^ー ル系列^で脱 水, エボン8 12 で包 埋し た. 試 料は ガ

De v elop^{m e n}t a nd ultr a str u ctu r e of the

Dep^{a r}tm e nt of Patholog y (^Ⅰ), (^{D ir e cto r :} Ka n a z a w a Univ e r sit y^.

ラ スナ イ^フを用^{い .}L K B ウ ル ト ラ ト^{ー ム}で超 薄切 片を 作 成し^, 酢 酸^{ウ ラニ ー ル.} 硝 酸 鉛^の二重 染 色を行なっ

た^.

酸性^ムコ多 糖及 び糖 蛋 白^の検 出 ^: 上 記^の各 組 織^に

っい てt ル テ^ニ ウ ム レ ッド( 以下R R と略 す) 染 色^を 行な^っ た. R R 染 色に対し て は ダ^ル ク ^{ー ル} ア ルデ ^ヒ ド^O R R 混 合 液で組 織を60 分 間 固 定し, V i br ato m e で100 ^〜 3 0他 ^の切 片を作 成し. こ の切 片を オ^{ス ミ ウ} ム酸^｡ R R 混 合 液^で固 定し た. 以後は上 記と同様^の方 法で処理 し, 超 薄 切 片は無 染 色で観察七 た^.

酵 素 消 化 試 験 : 胎 生16 .1 8 日及び生 後3 日の滑^液 膜^に各種^の酵 素を作 用さ せ^. 細 胞 間 物 質^の性 状 を 検 討 し た. 組 織を2 .5 % グ^ルタ ^{ー ル ア ル}デ^ヒド(0^.0 5 M カ

コ ジル酸ソ ^ー ダ緩 衝 液pH 7 .4)で 4⁰c ,60 分 間固 定 後^, V i b^{r ato m e} で 100 ^〜 300FL の切 片を作 成し,3 ^〜 5 時 間 同緩 衝 液^で十 分 洗 浄し た後,37⁰c で種^{々 の}酵 素 処 理 を行な^った( 表1) ^. 酵 素処 理 をし た試 料^は同緩 衝 液で 洗 浄 後^,R R 染 色を施し た^{. 一} 部^の試料に は2 種 類^の酵 素を順 次 作 用さ せ た( 表1)^. た だ し, コラ ゲ ナ ^ー ゼ消 化 試 験^のみ は, 生 後3 日 と生 後 3 ^ヶ月^の材 料^に ついて 行な^い, 通常^の電 照 切 片 を 作 成し観 察^{し た.} 対 照と し て酵 素を含ま な^い緩 衝 液で in c ubate し た試 料^を用^い た^.

酵 素組 織 化 学 ^: 酸 性^{フォ ス フ ァ}タ ^ー ゼ反 応は電 顕 的及 び光顕 的^に検 討し た.電 鋳 的 検 索^のた め に は^･2 ^･5

% グ^ルタ ^{ー ル} ア ル デヒ ド( 0 ^.0 5 M カコ ジ^ル酸ソ ^ー ダ緩 衝 液pH 7.4)で4⁰c .30 ^〜60 分 間前 固定を行なっ た組 織を^. 3 ^〜 5時 間 同 緩 衝 液^で洗 浄 後^{V ib r ato me で}50

〜 1 00〟 に薄 切し.37⁰c で 10 ^〜 30 分 間Go n‑ O riの反 応 液^に浸 潰^{し た.}次い で2 % オス ミ ウ ム酸^で90 分 間 再 固 定し^. 上 記の方 法で電 顕 切片を作 成し た. 光 顕 的^に はアゾ色 素 法^によ^{っ て}顧 性^{フォ ス フ ァ} ク ^ー ゼ反 応を行 な^っ た^.

電 顕試 料は 日立H ^‑ 500 型, 日本 電 子JE M lOO ‑ ^B

m o u s e sy ^{n o v}ial m e mbr a n e^･ Y a s u n o ri O k^ada･

Pr ｡f. K. K aj^{ikaw a), Scho ol of M ed icin e･}

マ ウス滑 液膜^の発 育と超 微 構 造

表 1 酵 素消 化試 験の条 件

7 l

酵 素 緩 衝 液 (pE) 酵 素濃 度 作 用 時 間

Str ep t

琶 陰影^{alu r o ni da s e 0.1 M}( p H 5^{A c e.}0)^{tate buffe r} 2 0u/ml 1 ^‑ 3 bs .

C ho ndr oitin a s e A B C 0.1 M Tris^‑H C l buffer

1u/ml 1 ^‑ 3 hs.

( 生 化学工菓) ( p 日 8^.0)

Ne u r a mida s e 0.1 M P ho sphate b uffe r

1u/ml 3 ^‑ 5 hs.

( 半 井 化学) ( p H 6.8 ) α^‑C hym otrypsin 0.0 8 M Tris^‑H C l buf^.f

e r 1 mg / ^ml 1 0^‑4 5 min.

( 未 聞 昏〕

( Wo rthing^{to n} C hemi cal Co.) (pH 7.8 ) ^十0.1 M Caし12

職㌫^{;, Ty ｡eI ) (0p.0 8 MH 7.8 )Tri+s0‑H C I.1 M L) uCffa}C l^{e r}2 ^{1 mg / ml 1 0}( 未 聞 定)^{‑2 0 min.} P apain リ^ンゲ^ル液 (pH 6.2)

1mg / ^ml 1 0 ^‑2 0 min.

( Wo rthl ng^{tO n} C he m l C al C o.) +1m M E D T A ( 未 固 定)

雪空〜言監^a琶^{｡e Ⅲ) 00..1 M2 M NTariCls+月 C l b4mMuffCe raC 1(2pH 7.4 ) 十 1mg / ml 1 0}( 未 固 定)^{‑2 0 min.}

二 重 酵 素 消化 試 験

酵 素 作 用 時 間

C h^{o n}dr oitir 払 S e A B C ⁺ Ne u r a mi da s e 1 h^. 十3 hs.

a^‑C h y^{m otr}yp^sin + C h^{o n}dr oitin a s e A B C 2 0 min. + 2 hs.

型電 顕で直 接 倍 率400 ^‑ 3 0.00 0 倍で撮 影し た^. 光 顕 的 観 察^: 材 料を 0^.5 % ^の 割 ^に Cet yト P yri d iniu m ch lo ri de を加え た 1 0 % 中 性ホルマ リ ン

で重 患1 ^〜 2 日間 固 定 後^{, ′ヾラ フ} ィン切 片を作 成し.

H ^｡E,P A S . ァ ル シ アン青, ト^ルイ ジ^ン青,鍍 銀 染 色を 施^こし た^, 酵 素 組 織 化 学 的検 査と して, 上 記^の酸性^フ

ォ ス フ ァ ク ^ー ゼ反 応^のほ か, α^‑Naphth_yl a c etate e ste r a s e.C h lo r o a c etate e ste r a s e 反 応を行な^った^.

結 果

Ⅰ^. 滑 液膜の分 化 1. 胎 生1 4 ^〜 16 日

こ の時 期^で注 目さ れ る所 見は原 始 関 節 腔^の形 成^であ る. 胎 生1 4 ^〜 1 5 日 で は. すで に形 成さ れ た軟 骨 原 基 問^に未 分 化 問 真 綿 胞が増 殖し^, 半月 板 原 基及 び滑 液 膜 原 基^に分 化 する. 原始 関 節 腔は, これ らの原基 境 界 部

に生ず る 不連 続 性^の/ト裂 隙と して観 察さ れ る ( 写 真 1)^.

滑 液 膿 原 基は未 分 化 問糞 細 胞^の集 団と してみ ら れ^, 辺 綾 部には多 数^の毛 細 血 管が存 在す る. 原 始 関 節 腔^に 面し た表層^では,未 分 化 問糞 細 胞は腔^に平 行^に配 列し^, 深 部にゆ くに従^っ て不 規 則な配列を示 す^{. こ}れ らの紬

胞は核^′ト体^の明 瞭な大 型^の核を有し, 原 形 質は狭く.

リ ボ ゾ^{ー ム}に富み少 数^の粗面 小 胞 体と^{ゴ ル}ジ装 置^{が み} ら れ る^. し ば し ば宥 糸 核 分 裂 像が観察さ れ る^.

原 始 関 節 腔^に面し た細 胞に は時々, 原 形 質^の萎 縮と 電 子 密 度^の増 加を伴^った変 性^の像が認め ら れ る( 写 真 1 )^.同様な変 性 細胞は軟 骨 原 基や滑 液 勝原 基 辺 綾 部^に も散 在 性に観 察さ れ る.

滑 液 膜 原 基^の細 胞 間は^, 光 頗 的に ア ル シ アン青 染色

で陽性を示 すが, P A S 染色では陰性であ る. 電 顔 的^に ほ, 細 胞 間 は R R 陽性^の粒子(直径1 3 0 ^‑8 0 0 Å) とフ ィラメ ン ト( 直径5 0 ^〜 1 5 0 Å) か ら成る髄 質^で占め ら れ, そ の間に少数^{の コラ}ゲン線 維が散 在して いる^. 髄 質^の粒 子とフ_ィ ラ メ ン トは互い に結 合し, 全 体と し^て網 状構 造を^っく る. 細 胞 表 面^{は R R} 陽性^の糖 皮^で包ま れ る^.

原 始 関 節 腔の内容はウ ラ^{ニ ー} ル ･ 鉛染 色 標 本^では ほ と ん ど空 虚であ る が, R R 染 色榎 本で昼^{細 胞 間の礎 質}

と同様な網 状 構 造^で満た さ れ る( 写 真2)^.

滑 液 膜 原 基^の細 胞^の酸性^フォ ス ファタ ^ー ゼ反 応は光 顕 的には認め難いが, 電顕 的^に原始 関 節 腔^に面 する ご く少数^の細 胞に反 応 陽 性^{の ラ}イ ゾ ゾ^{ー ム}を証 明する^こ と が^できる^. 滑 液 膜 原 基 細 胞^の α^･Naphthyl a c etate e ste r a s e と C h lo r o a c etate e st_{e r a s e} 反 応は とも^に陰

性であ る^.

2 ^. 胎 生1 7 ^〜 1 8 日

原 始関 節 腔は関 節 軟骨^, 半 月 板^t 靭 帯 及び溶 液 勝 原 基^に沿っ て連 続し た関 節 腔を形 或し. 多数^の毛 細 血管 が滑 液 膜 原基^の辺 緩か ら関 節 腔^の直 下ま^で侵 入 する^･

こ の時期^にな る と^∴滑 液 膜 原 基^の未 分 化 間 糞 細 胞は関 節 腔に面し た 卜 2 層^の細 胞と^, そ^の下に存 在 す^る細 胞 群に分 化する( 写 真 3 )^.

関節 腔^に面 する細 胞は 延長し た原 形 質をも^{っ て}関 節 腔を覆^い. 関 節 腔に向^って少 数^の突 起を出す^･ 細 胞 小 器 官^の発育は ^一般に乏しく^, 遊 離リ ボ ゾ^{ー ム に}富む原 形 質に は, 小 胤 空 臥 ^{c o ate}d v e si^cle が比較 的 目 立 ち, 時々酸 性^フォス ファ タ ^【 ゼ陽 性^{の ラ}イ ゾ ゾ ^{ー ム}が 散 在して いる^. その胤 少 数^の拡 大し た粗 面 小 胞 凧 糸 粒 附 ^{ゴ ル} ジ装 置^が同定さ れ る^. 基 底膜は全く存在 せ ず細 胞 間物 質が直 接 関 節 腔に露 出して い る所 もあ

下部^の細 胞 群は^, 表層 近くでは関 節 腔に平 行^に配列 す る が, 深 部^にゆく^に従^って不 規 則な配 列を示 す^{･ こ} れ らの細 胞は ^一般^に明 瞭な核^′ト体をも^つ大 型^の核を有 し, 原 形 質には リ ボ ゾ^{ー ム}∴阻 面 小 胞 体 及び^{ゴ ル}ジ装 置^の発育が目 立ち,少 数^の小 胞と糸 粒体が認め ら れ る^･ 時々脂 肪痛が認め ら れ ること がある. 酸 性^{フォ ス ファ} タ ^ー ゼ反 応で は, 陽性 物質は は と ん ど認め ら れず^{･ ゴ}

ル ジ装 置^に少 量 証 明さ れ る^に過ぎ ない.

靭 帯^. 関 節 軟 骨 及^び半月 板^の表層 も, 上 記と同様^な 小 器 官^の乏し^い細 長^い未 分 化滑 液 膜 細 胞^で 覆わ れ る ( 写 真 3 ) ^. 靭帯に おいて は, こ の細 胞は生 後 も 存 続^す る が. 関 節 軟 骨や半月 板で は変 性 脱 落し, 軟 骨 基 質が 直 接 関 節腔に露 出 する^.

毛 細 血 管^の内皮 細 胞は慶 大し, そ^の形は不 揃^{い で}細 胞 表面^の凹凸が多^い.

以上^の未 分 化 滑 液膜 細 胞^の細 胞 間物 質は光 顕 的に,

ァ ル シ ア ン青 陽 性を示し,P A S 染 色は弱 陽性で, 鍍 銀 染 色によ^っ て少 数^の好 銀 緑 綬^が証 明さ れ る･ 電 鈴 的^に は細胞 間は粒 子とフィラメ ン トか ら成る礎質の網 状 構 造で満た さ れ る が^, 表層^の細 胞 周 囲は後 述^の関節 腔 内 容と類 似し た枝 状 構 造が認め ら れ る^{. コ}ラ ゲ^ン線 維^の 数は や や増 加し, 表 層 部では毛 細 血 管 周 囲や細 胞 表面

に散在 性^に認め ら れ, 深 部^では所^{々 で}線^{維 束を形 成 す}

る^.

関 節 腔は R R 陽 性^の特 有な枝 状構造^で占め ら れ る^･ こ の構 造物は胎 生1 5 ^〜 16 日^の原 始 関 節 腔を満たす礎 質^の網 状 構 造と異な^って , 剛 直 性^{の フ}ィラメン 仲^ゝら 成り^, 粒 子は は と ん ど存 在し ない. フ ィラ^{メ ン ト の}直 径は 530 ^〜660 Å( 平 均5 70 Å) ^{で, その}周匪=^こ様々

な量^の架状 物質^が付 着して いる. 繁 状 物 質^{はフ ィラ メ}

ン ト に比^べて R R 染 色性は劣る が, 強拡 大で観 察 する と^{, フ}ィラ メ ン トと架 状 物 質^の境 界は不 明 瞭で あ る^･ そ^の胤 時^々R R 弱 陽 性^の鯖 粒 状 物 質( 直 径 約180 Å)

の集 積が み ら れ る^こと が あ る.

3 ^. 生 後3 ^〜 1 5 日

生 後にな る と, 滑 液 膜^の分 化が急 速に進 行 する^･ 滑 液 膿は, 光 顕 的^に 丘br o u s t y p^{e. a r e o}la r t y pe と

ad ipo s e t y pe に分け ら れ^{て い}る が^{1 5)}, 本研 究^で は滑 液 膜^の構 築が最 も 明 瞭な adipo s e t y pe を観 察^の対 象 と し た.

A d ipo s et y p^e の滑 液 膜は, 構 成 細 胞と細 胞 間 物 質

の差によ^っ て.3 層^に分け ること が できる.各 層^の境界

は生 後 3 ^〜 5 日 で は不 明 瞭で あ る が, 動 物^の発 育と と も^に次 第に明 瞭と な る^. 本 論 文^では各 層 を 関 節 腔^の側 か ら Ⅰ.1 ^, Ⅲ 層^{と し,} 以 下そ れ ぞ れの層に^{つい て}述^べ る^.

1) 第Ⅰ層 : 第Ⅰ層^の細胞は, 関節^{腔に面 する 1 ‑}

2層^の細 胞か ら な る が. そ れ らの細胞^の形 態は多 様^で あ る. こと に生 後 3 ^〜 5 日 で挿^{その傾 向が強く･ 構 成} 細 胞^の原 形質^には^. 小 胞^, 空 臥 及び小 空 胞や高 電 子 密 度^の無 定 形物 質を入れ たライ ゾ ゾ^{ー ム}様 小 体が比 較 的 多^い細 胞と^, 後 述^の第 Ⅱ 層^の線 維 芽 細胞 様細 胞に甑 似し た構 造を もつ細 胞及 び そ^の中 間 型^の形 態を示 す 細 胞が混在 する. 又, ま れ^に第 Ⅲ 層^の組織球 様 細 胞に煩 似し た細 胞も出現 する( 写真4)^. し か し, 動 物^の発 育 が進むに従^って .構 成 細 胞の多様 性は減少し^, 生 後1 5

日で は細 胞 小 器 官は ^一般^に乏し く, 小 胞. 空 胞 及びラ ィ ゾ ゾ^{ー ム}様 小 体が比 較 的目 立っ細 胞が主 要な構 成 細 胞と な る.

こ の時 期^では^. 関 節 腔は広 く^, その内容は模 本 作 成 中^に脱 出する た め ほ と ん ど空 虚と な り, 腔 内面に R R 陽 性 物 質が付 着し て^いる程 度^であ る. 時^々, 胎 生1 7 ^〜 1 8 日^の関 節 腔^にみ ら れ た と同様な鯖 粒 状 物 質^の集 積 が観 察さ れ る^.注 目 す^べき所 見は.こ の時期^の第Ⅰ層^の 細 胞 間は, 胎 生 期^にみ ら れ たフィラ^{メ ン ト}と粒 子か ら な る礎 質^の網 状 構 造に代^{って .} 枝 状 構 造^で占め ら れ る こと^であ る( 写真5)^. 枝 状 構 造は所^々細 胞^の聞か ら関 節 腔^に延 び^{て い}る.

2) 第 Ⅱ 層 ^: 第 Ⅲ 層には線維 芽 細胞 様 細 胞と ご く少 数^の組 織 球 様 細 胞 及び豊 富な血 管が含ま れ る^. 線 維 芽 細 胞 様細 胞は, 豊 富な粗面 小 胞 体と^{ゴ ル} ジ装 置^の発 育 が特 徴 的^であ る^. その千臥 ^mic r otub^ule s や原 形 質 周 辺

の小 胞^の増 加が目 立^{っ .}

毛 細 血 管は第Ⅰ層^の直 下ま で侵 入し, 大 部 分は扁 平 な内皮 細胞^で覆わ れ. 内陸は広く しばし ば有 窓 構 造を