舌癌組織における von Hippel-Lindau タンパク質 発現の免疫組織化学的検討
日本大学大学院医学研究科博士課程 外科系耳鼻咽喉科学専攻
長谷川 央
修了年 2016 年
指導教員 大島猛史
舌癌組織における von Hippel-Lindau タンパク質 発現の免疫組織化学的検討
日本大学大学院医学研究科博士課程 外科系耳鼻咽喉科学専攻
氏 名 長谷川 央
修了年 2016 年
指導教員 大島猛史
目次
I. 概要 ... 1
II. 緒言 ... 3
III. 目的 ... 7
IV. 研究対象と方法 ... 7
V. 結果 ... 9
VI. 考察 ... 11
謝辞 ... 15
表 ... 16
図と図説 ... 22
引用文献 ... 31
研究業績 ... 40
I. 概要
舌扁平上皮癌(以下舌癌)が属する頭頸部癌の罹患数は年々増加の一途をたど っている。種々の治療法が開発され、診断技術が著しく進歩してきているにも 関わらず、いまだ克服し得ない疾患であり、5 年生存率は 50%程度である。進行 例には手術療法、放射線療法、化学療法の集学的治療が一般的となっているが、
ここ数十年頭頸部癌の予後の改善は乏しいのが現状である。生存率の向上を実 現させるために新たな診断法や治療法の開発が期待されている。2008 年、
Asakawa らは初めて舌癌で高頻度にがん抑制遺伝子 von Hippel-Lindau(VHL)遺 伝子の対立遺伝子欠失(loss of heterozygosity:LOH)があることを証明した。
そもそも VHL 遺伝子の LOH は淡明細胞型腎細胞癌に特徴的であり、その 60-80%
に認める。しかし舌癌においては、VHL 遺伝子の LOH はみられないとされてきた。
そこで本研究では、舌癌における VHL 遺伝子の産物である VHL タンパク質 (product VHL:以下 pVHL)の発現を解析し、LOH との関連、またその臨床的意義 および有用性を検討した。VHL 遺伝子の LOH が判明した淡明細胞型腎細胞癌 22 例と舌癌 19 例について、pVHL の免疫組織化学染色を行った。さらに、舌癌の補 助的な診断マーカーとして注目されているサイトケラチン(cytokeratin:以下 CK)13 および CK17 の染色像と比較した。その結果、pVHL は腎正常組織の近位尿 細管細胞質によく染色された。また、淡明細胞型腎細胞癌では、遺伝子変異お よび LOH に関係なく、その細胞質の周辺部でよく染色された。舌正常上皮の pVHL は、主に重層扁平上皮の基底層と、有棘層のうち基底層の周辺部の細胞質に局 在した。舌異形成では基底層から有棘層の中層程度まで pVHL 陽性細胞が拡大し ていた。また、pVHL 陽性細胞の拡大部は CK13 陰性であった。さらに、CK17 と pVHL 染色は、概ね陽性部は一致していた。また、舌癌 19 例全例で pVHL は細胞 質に陽性で、LOH の差は観察されなかった。浸潤癌の中分化型が最も強く染色さ れ、低分化型が最も弱い染色を示した。
本研究の結果は、VHL 遺伝子の産物 pVHL が、舌異形成を含む癌性病変に LOH とは無関係に発現することを示した。この発現の新知見は、pVHL の未知の機能 解明につながる意義深いものと考える。舌異形成の組織診断は、しばしば診断 評価が困難であることが知られている。本研究は、pVHL 染色が舌異形成の新た な補助的診断マーカーとして有用である可能性を初めて示した。今後、pVHL 発 現のメカニズムや意義が確立されれば、さらに早い段階での癌の発見や予防に 役立つ診断法の開発が可能となり、進行癌の減少にもつながる可能性がある。
本論文は、舌癌の新規治療の発展に寄与すべく、舌癌および異形成病変におけ
る pVHL の免疫組織化学染色から、pVHL 発現の特徴を明確にし、VHL 遺伝子の LOH との関連を含めて検討した初めての報告である。
II. 緒言
1. 舌癌における pVHL 発現に着目した背景
舌癌が属する頭頸部癌の罹患数は年々増加の一途をたどっている。種々の治 療法が開発され、診断技術が著しく進歩してきているにも関わらず、いまだ克 服し得ない疾患群であり、5 年生存率は 50%程度(1)である。進行例では手術療 法、放射線療法、化学療法の集学的治療が一般的となっているが、ここ数十年 頭頸部癌の予後の改善は乏しいのが現状である。生存率の向上を実現させるた めに、より早期の発見を可能にする診断法の開発や新たな治療法につながる標 的遺伝子の発見が待たれている。
頭頸部癌は、約 90%が扁平上皮癌であり、発癌は扁平上皮における多数の遺伝 子の後天的な変異の蓄積の帰結であるが、その進行はがん抑制遺伝子とがん遺 伝子の多段階な変化によるものと考えられている(2)。頭頸部癌は、扁平上皮癌 のほぼ単一の組織型であるにも関わらず、症例により腫瘍の特徴が異なる性質 は、遺伝子の欠失や変異の多様性による可能性がある。頭頸部癌に対する遺伝 子治療や分子標的治療は、いまだ実現していない可能性を追求できる数少ない 選択肢の 1 つである。
がん抑制遺伝子の喪失は、細胞増殖や細胞周期の制御が不十分になる結果、
細胞不死化や無秩序な細胞増殖につながる。頭頸部癌における遺伝子異常の解 析では、染色体3p、9p、17p領域にLOHが多いとされている(3)。これらの部位に は、がん抑制遺伝子が存在している。まず9p、17pにはそれぞれp16遺伝子、p53 遺伝子が存在しており、双方ともに頭頸部癌において約50%の頻度で変異やメチ ル化などの遺伝子変化が報告されている(4, 5)。一方、染色体3p上でLOH頻度が 高い部位がある。それらの近傍に位置する代表的ながん抑制遺伝子にVHL遺伝子 (3p25)がある(6)。一般に、LOH頻度が高い部位の近傍には癌と関係の深いがん 抑制遺伝子の存在が疑われる。しかし、頭頸部癌におけるVHL遺伝子のLOHは定 かではない。
VHL 遺伝子については、これまで同遺伝子と特に関連の深い腎細胞癌で研究が 進められてきた。腎細胞癌全体の約 80%を占めるのは淡明細胞型腎細胞癌(7)で あり、その 60-80%には VHL 遺伝子の異常を認める(7-9)。VHL 遺伝子の産物であ る pVHL の 機 能 は 、 低 酸 素 化 で 誘 導 さ れ る hypoxia-inducible factor(HIF)1-alpha の分解を導くことにある(10)。HIF は、血管内皮増殖因子 (vascular endothelial growth factor:VEGF)などを誘導し、血管新生や増殖を うながし、癌化や転移を促進させる(11-15)。腎細胞癌の進行例においては、イ ンターフェロン療法が施行されているが、奏効率は 15-20%と決して高くない
(16)。しかし、VEGF 受容体などにコードされたチロシンキナーゼ受容体阻害薬 などの登場によって奏効率は約 40%と向上している(17-19)。さらに VHL 遺伝子 異常のある淡明細胞型腎細胞癌は、治療薬の感受性が高い(20)。したがって、
もし頭頸部癌でも VHL 遺伝子異常の頻度が高ければ、頭頸部癌に対する治療の 向上が期待できるかもしれない。
1990年代に報告された頭頸部癌のVHL遺伝子のLOHについては、VHL遺伝子の LOHはみられないとする報告(6)と、VHL遺伝子近傍のマイクロサテライトマーカ ーでは高頻度にLOHがみられるとする報告(21)があり、いまだ一定の見解は得ら れていない。頭頸部領域は舌を含む口腔咽頭、喉頭、唾液腺など複数の臓器で 構成されており、それぞれの臓器の遺伝子変化には異なる特徴がみられる(22)。
従って頭頸部をひとくくりとして遺伝子異常を調査すると、各臓器の特徴をと らえるのが困難になる。特に、舌を含む口腔咽頭癌は、他の頭頸部癌に比べて 若年層での発症も多く散見され、遺伝的背景の影響が考えられている(23)。す なわち舌癌の発症にはその他の頭頸部癌と異なる遺伝子背景や発症機転がある と推測されるため、対象を舌癌に絞って遺伝子変化やその影響を調査する意味 がある。また、2000年代にヒトゲノムの全貌が報告されると一塩基多型:Single Nucleotide Polymorphism(SNP)を指標とした全ゲノム関連解析が行われるよう になった。Mochidaらは、日本人ではVHL遺伝子上で最もヘテロ型頻度の高いSNP はエクソン3上にあることに注目し、腎細胞癌においてVHL遺伝子エクソン3上の SNPを用いて、定量的にLOHを判定する方法を確立している(24)。同様の方法を 用いて2008年、AsakawaらはVHL遺伝子のLOH解析を舌癌について検討し、初めて 舌癌でも高頻度にVHL遺伝子のLOHがあることを証明した(25)。これは、舌癌に おいても腎細胞癌と同様に、VHL遺伝子のLOHによりHIF1-alphaが増加し、VEGF が誘導され、癌化や転移が促進されている可能性を示唆している。舌癌のチロ シンキナーゼ受容体阻害薬の臨床応用が期待される第1歩である。しかし、この 阻害薬が舌癌に対する実際の治療法として応用されるためには、さらに多くの 知見の積み重ねが求められる。特に、このVHL遺伝子の産物pVHLの舌癌における 発現については、これまでほとんど検討がなされておらず、不明の点が多い。
これが本研究で舌癌におけるpVHL発現に着目した背景である。
2. 舌癌
舌癌は頭頸部の口腔咽頭癌に属する。頭頸部癌は全癌の約 5%を占めており、
約 90%が扁平上皮癌である。国立がん研究センターがん対策情報センターが公開
し て い る が ん 情 報 サ ー ビ ス
(http://ganjoho.jp/public/statistics/pub/statistics/)によると、日本にお ける 2011 年の口腔咽頭癌の罹患者数は 15,716 人で全癌の 1.84%を占めた。口腔
咽頭癌の 5 年生存率は約 50%で、全癌の 5 年生存率とほぼ同等である。舌癌は口 腔咽頭癌の約 60%を占め、頻度からも口腔咽頭癌の中で代表的な疾患といえる (26)。一般的に舌癌は高齢者に多いが、他の頭頸部癌に比べて若年層での発症 も多く散見される(http://seer.cancer.gov/)。飲酒、喫煙が癌発症の危険因子 である(27)が、特に若年層では慢性の歯牙刺激や環境要因に加え、遺伝的背景 の影響が考えられている(23)。さらに、40 歳未満の若年女性の舌癌は著明に再 発が多く、より短期間で再発したとの報告がある(23)。
舌癌に対する治療は手術療法、放射線療法、化学療法を単独もしくは組み合 わせて行う。しかし、いずれも機能面(嚥下、構音、味覚、唾液分泌)で後遺症 を生じる。仮に癌細胞だけアポトーシスに導くことができれば、治療の後遺症 を限りなく少なくすることが可能と予想される。
3. VHL がん抑制遺伝子
VHL 遺伝子は、1993 年に VHL 病の責任遺伝子で 3p25.3 に同定された淡明細胞 型腎細胞癌のがん抑制遺伝子である(28-33)。3 つのエクソンをもち、213 個の アミノ酸をコードしている(28, 34-36)。pVHL の機能は、低酸素化で誘導される HIF1-alpha の Elongin B と C、Cullin2、そして Rbx1 と細胞質内で結合し (VBC complex)、HIF のユビキチン化とさらなる分解を導くことにある(10, 13, 37-40)。
HIF は、VEGF などを誘導し、血管新生をうながす。したがって、pVHL は血管新 生の抑制に働く。また、細胞周期制御にも関わっている(41)。
VHL 遺伝子異常によって発症する VHL 病は常染色体優性遺伝性であり、発症頻 度は 100 万人に約 1 家系、約 4～10 万人に１人とされている(42, 43)。臨床診 断基準は次の通りである(44, 45)。(1)中枢神経と網膜の血管芽腫を認める。(2) 中枢神経か網膜の血管芽腫に加えて腎臓、膵臓、肝臓の多発嚢胞もしくは褐色 細胞腫もしくは腎細胞癌を認める。(3)家族歴がある場合には上記関連病変のう ち 1 病変以上を認める。VHL 病で発症する腎細胞癌は淡明細胞型であり、VHL 病 の 30-50%の患者にみられる(11, 46)。VHL 病ではない患者の腎細胞癌の発症年 齢は 50 歳代以降にピークがみられるのに対し、VHL 病の腎細胞癌の発症年齢の ピークは 30 歳代後半で、50 歳代までに発症する若年化がみられる(42)。
淡明細胞型腎細胞癌は、腎細胞癌全体の約 80%、進行転移例では 90%以上を占 め、VHL 病によるものではなくても VHL 遺伝子異常はよくみられる(7)。Brauch らは、腎細胞癌 227 例で VHL 遺伝子異常を解析すると、VHL 遺伝子異常をもたな い淡明細胞型腎細胞癌に比べると異常をもつ例では StageⅢ以上の腎細胞癌が 有意に多い(47)としている。しかし、Yao らは 187 例の腎細胞癌症例を解析し、
VHL 遺伝子異常をもつ腎細胞癌の方が異常をもたない腎細胞癌に比べて予後が 良く、これは VHL 病に合併する腎細胞癌の予後が良いことと一致する(48)とし
ている。そのため VHL 遺伝子異常の腎細胞癌の予後への結論に関してはいまだ 確定していない。さらに、血管新生阻害性の分子標的薬の治療効果が VHL 遺伝 子変異陽性群でより高く、感受性予測の遺伝子マーカーになりうる可能性が報 告されている(20)。
4. Cytokeratin(CK)13、17
口腔上皮の異形成とは、浸潤を欠く上皮内腫瘍性病変と定義される(49)。異 形成は、単独もしくは浸潤癌周囲にしばしば認められ、特に、生検ではその病 理組織学的診断はしばしば困難で、その程度の評価について、病理医間や施設 間でも差異が生じやすいことが問題となっている。上皮の種類や腫瘍によりそ の発現する種類が異なるサイトケラチンは、上皮細胞の中間径フィラメントを 成す細胞骨格の 1 つである。中でも、CK13 および CK17 は、口腔内病変において 異形成や扁平上皮癌とサイトケラチンの発現パターンが関連していることが発 見され、補助的診断マーカーの候補とされている(50)。CK13 は、正常口腔粘膜 上皮に発現し、悪性化に伴い消退する(51, 52)。CK17 は、正常粘膜上皮には発 現せず、悪性病変で発現が認められる(50)。特に、CK17 は高分化の扁平上皮癌 で発現し、肺、子宮頸部、喉頭、食道の扁平上皮癌において正常組織よりも有 意に発現し、診断マーカーとして注目されている(53-57)。
5. LOH 解析
LOHとは、がん細胞で生じる様々なタイプのDNA障害のなかで、本来1対ある対 立遺伝子のうちの片側の対立遺伝子が消失していることを示す。LOHの検出は、
対立遺伝子が互いに異なる場合でのみ可能であるため、対象DNA領域はヘテロ接 合型を示す領域となる。検出方法は、遺伝子多型部位や遺伝子変異部位を含む 領域をPolymerase Chain Reaction(PCR)で増幅し、4色の蛍光色素標識のターミ ネーターヌクレオチドを用いたプライマー伸長反応で、各対立遺伝子を区別、
定量し、比較する(24, 25)。本研究では、腎細胞癌と舌癌症例のVHL遺伝子エク ソン3内の一塩基多型の遺伝子型(一塩基多型データベース:rs1642742)を定量 解析して、ヘテロ接合型AGの症例をLOH判定可能例とし、各マーカーのピーク面 積比を求め、癌部AG比が非癌部AG比の60%未満をLOH陽性(Positive)とし、また 60%以上をLOH陰性(Negative)とした。60%のカットオフ値は、LOHのモデル定量 実験により定めた(24)。さらに、ヘテロ接合型AGがみられなかった症例をLOH判 定不能例(not informative)とした。
III. 目的
VHL がん抑制遺伝子の LOH が高頻度にみられる舌癌の組織において、pVHL の 発現の様式や特徴を免疫組織化学染色により明らかにする。さらに LOH によっ て pVHL 発現に差がみられるかどうかを解析し、その発現様式の臨床的意義や有 用性について検討する。
IV. 研究対象と方法 1. 腎細胞癌症例
1998 年から 2004 年の 7 年間に日本大学付属病院および関連病院で治療を施行 した散発性淡明細胞型腎細胞癌 Stage Ⅰa(腫瘍径 4cm 以下) 22 例である。男性 17 例、女性 5 例で平均年齢は 57.4 歳(32～77 歳)である。腎細胞癌臨床病理学 的 分 類 ( 表 1) は Cancer Staging Classification (6th edition) of the International Union Against Cancer (UICC) (58)に基づき行った。Grade 1(高 分化型)は 12 例、Grade 2(中分化型)は 10 例、Grade 3(低分化型)は 0 例である。
症例 22 例はすべて日本大学医学部泌尿器科学分野五十嵐智博博士によって VHL 遺伝子変異および LOH が解析され、供与を受けた(59)(表 2)。対象を症例ごと に示す。腎正常組織においては、腎細胞癌組織を採取した際に組織に含まれて いた正常組織部分を用いて検討した。
2. 舌癌症例
1999 年から 2003 年の 5 年間に日本大学医学部附属板橋病院で治療を施行した 原発性舌癌 19 例である。男性 8 例、女性 11 例で平均年齢は 57.1 歳(22～79 歳) で あ る 。 舌 扁 平 上 皮 癌 臨 床 病 理 学 的 分 類 ( 表 3) は Cancer Staging Classification (6th edition) of the International Union Against Cancer (UICC)(58)に基づき行った。Stage Ⅰは 4 例、Stage Ⅱは 9 例、Stage Ⅲは 3 例、Stage Ⅳは 3 例で、Grade 1(高分化型)は 14 例、Grade 2(中分化型)は 4 例、
Grade 3(低分化型)は 1 例である。症例 19 例はすべて日本大学医学部耳鼻咽喉・
頭頸部外科学分野浅川剛志博士によって VHL 遺伝子変異および LOH が解析され、
供与を受けた(25)(表 4)。対象を症例ごとに示す。浅川らの解析より VHL 遺伝 子の体細胞変異は全例になく、LOH 陽性は 4 例、陰性は 4 例、判定不能は 11 例 であった。本研究では、浸潤癌とともに組織標本に観察しえた、「浸潤を欠く上 皮内腫瘍性病変」を異形成 dysplasia として検討対象に含めた。すなわち、現 行の WHO 分類(58)で mild dysplasia、moderate dysplasia あるいは severe
dysplasia を異形成として扱った。なお、上皮内癌の存在は明らかではなかった ため、本研究の解析対象には含まれていない。それぞれの症例の中から標本と して正常上皮、異形成、浸潤癌(高分化型、中分化型、低分化型)を抽出した。
標本としてカウントすると、正常上皮は 4 標本、異形成は 9 標本、高分化型は 16 標本、中分化型は 6 標本、低分化型は 3 標本となり、本研究では症例当たり 複数の標本を用いて検討した。舌正常上皮においては、舌浸潤癌を採取した際 に組織に含まれていた正常上皮部分を用いて検討した。
本研究は、日本大学医学部の倫理委員会の承認（課題名：舌扁平上皮癌にお ける VHL 病遺伝子の欠失、遺伝子変異解析，承認番号 118-1）を得て行われた。
3. 免疫組織化学染色(Immunohistochemistry:IHC)
ホルマリン固定パラフィン包埋薄切切片 4μm を作製した。脱パラフィン処理 後、内因性ペルオキシダーゼ阻害のため、5%過酸化水素水で 15 分間インキュベ ートした。その後、エタノール系列処理により水和した。抗原賦活化処理は、
淡明細胞型腎細胞癌の非癌部組織を用いて 4 つの条件で検討した。①抗原賦活 化処理なし、②タンパク質分解酵素処理としてトリプシン(0.1%トリプシン /0.1%CaCl2/リン酸緩衝生理食塩水(Phosphate buffered saline:PBS))で 37℃、
15 分、③0.01M クエン酸緩衝液(Citrate Buffer Solution pH 6.0、武藤化学社
、東京、日本)に浸漬して 500W の電子レンジで 5 分間、3 回、④0.01M クエン酸 緩衝液に浸漬して圧力鍋で加熱処理をおよそ 121℃、5 分間、である。抗体の非 特異的吸着を防ぐため、ブロッキング液(PBS で調製した 5%スキムミルク(Skim Milk Powder、和光社、大阪、日本))で各切片を 37℃で 30 分浸した。ブロッキ ング液を除去し、PBS で調製した 1 次抗体を 37℃で 60 分間反応させた。pVHL に 対 す る マ ウ ス モ ノ ク ロ ー ナ ル 抗 体 (Purified Mouse Anti-VHL:556347 、 BD Biosciences 社、California、USA)は 100 倍希釈で、抗 CK13 抗体(NCL-CK13、Leica Biosystems 社、Nussloch、Germany)は 100 倍希釈で、抗 CK17 抗体(Anti-ck17 cloneE3 IR620、DAKO 社、Glostrup、Denmark)は希釈済で反応させた。陰性対照 として、無関係なマウスモノクローナル抗体(C 型肝炎ウイルス超可変部位に対 する抗体、18Hd)(60)あるいは PBS を使用した。発色キットとして、pVHL はヒス トファインシンプルステイン MAX-PO(ニチレイバイオサイエンス社、東京、日本 )を用いてプロトコールに従って処理を行った。CK13、CK17 については、Envision Plus kit (EnVisionTM FLEX Mini Kit、DAKO 社、Glostrup、Denmark)を用いた。
発色はジアミノベンジジン(Diaminobenzidine;DAB)溶液(シンプルステイン DAB 溶液、ニチレイバイオサイエンス社、東京、日本) にて 5 分処理をし、ヘマト キシリン液にて核染色を行った。核染色後、脱水、透徹をし、封入した。
４．統計解析
統計学的解析は、GraphPad Prism(version 6.0;Graph Pad Software 社、Los Angeles、USA)を用いた。淡明細胞型腎細胞癌の pVHL 染色の有無と遺伝子変異 および LOH との比較は、カイ二乗検定を用い、p < 0.05 を有意差ありとした。
V. 結果
1. 抗原賦活化処理の検討
淡明細胞型腎細胞癌の非癌部組織を用いて抗原賦活化条件を検討した結果、
賦活化なしでは pVHL は染まらなかった(図 1B)。トリプシン処理で染まらず(図 1C)、電子レンジ処理では染色されたが、非特異的な染色が強かった(図 1D)。圧 力鍋での加熱処理が最もよく染色された(図 1E)。なお、陰性対照のマウスモノ クローナル抗体では pVHL は染色されなかった。近位尿細管の染色パターンは、
凍結組織を用いた同一抗体(61)による染色像と一致した。以上より抗原賦活化 処理として、圧力鍋での加熱処理を行って以下の pVHL 染色を実施した。
2. 腎細胞癌症例
腎細胞癌症例においては、腎正常組織および淡明細胞型腎細胞癌に分けて検 討した。
1) 腎正常組織
pVHL は、近位尿細管で細胞質全体が染色された(図 1E)。遠位尿細管でも細胞 質が淡く染色された。糸球体、血管、間質は染色されなかったが、糸球体では 間質の炎症性細胞が淡く染色された。
2) 淡明細胞型腎細胞癌
すべての症例で淡明細胞型腎細胞癌であったが、顆粒細胞型部分も存在して いたため、それぞれについて免疫組織化学染色を検討した。
淡明細胞型腎細胞癌は、全 22 例中 16 例(73%)で pVHL は染色された。淡明細 胞型では、細胞質内の周辺部がよく染色された(図 2B)。また、顆粒細胞型では、
細胞質がびまん性に染色された(図 2D)。
3) VHL 遺伝子の異常と pVHL 染色との関連性
VHL 遺伝子異常(変異と LOH)と pVHL 発現の関連性を検討した。VHL 遺伝子の異 常を伴わない症例(0 ヒット)、VHL 遺伝子変異または LOH 陽性症例(1 ヒット)、
両者とも異常を示す症例(2 ヒット)の 3 種類に分類した(表 5)。結果として VHL
遺伝子異常と免疫組織化学染色による pVHL 発現の有無に有意差を認めなかった (p = 0.41;カイ二乗検定)。
3. 舌癌症例
舌癌症例においては、染色態度の特徴を舌正常上皮、舌異形成と舌浸潤癌に 分けて検討した。浸潤癌については、高分化型、中分化型、低分化型の組織像 との関係も検討に加えた。
1) 舌正常上皮
舌正常上皮において検討すると、pVHL は基底層と、有棘層のうち基底層の周 辺部の細胞質に局在して染色された(4 標本中 4 標本)(図 3B)。角化層と顆粒層 では pVHL は染色されなかった。
2) 舌異形成
舌異形成において検討すると、pVHL は基底層から有棘層の中層程度まで陽性 細胞の出現が拡大した(9 標本中 9 標本) (図 4B)。pVHL 陽性細胞の拡大の程度 はそれぞれの標本で異なっていた。
3) 舌浸潤癌
舌浸潤癌において検討すると、高分化型では細胞質がよく染色された(14 標本 中 14 標本)(図 5B)。また、癌巣周辺部では細胞質が染色され、癌巣中心付近で は癌細胞の細胞質細胞膜近傍部が染色された。中分化型では、細胞質が高分化 型よりもさらに強く染色された(6 標本中 6 標本)(図 5D)。低分化型では、細胞 質は高分化型よりも淡く染色された(3 標本中 3 標本)(図 5F)。結果として検討 対象 19 例中 19 例で pVHL 染色は陽性であった。
4) pVHL 染色と CK13 および CK17 染色との比較
舌正常上皮では、CK13 は pVHL 陰性領域に染色された(図 6C)が、CK17 は全層 で陰性を示した(図 6D)。
舌異形成では、pVHL、CK13、そして CK17 の染色パターンが様々に認められ、
その組み合わせが 3 つに分類された(図 7)。パターン A は、CK13 陰性に伴い、
CK17 が陽性になるタイプのもの(図 7cd)で、pVHL 染色は概ね CK17 と一致してい た(図 7b)。このパターン A は代表的なタイプで舌異形成の 9 標本中 7 標本に観 察された。パターン B(9 標本中 1 標本)は、CK13 が陰性で CK17 が全層で陽性で あるタイプ(図 7gh)で、pVHL は有棘層の中層程度までの染色にとどまっており、
全層で陽性ではなかった(図 7f)。パターン C(9 標本中 1 標本)は、CK13 が強く 減弱しており、CK17 も弱陽性と異型度の判定の困難な染色パターン(図 7kl)だ が、pVHL は異型細胞で陽性であった(図 7j)。
舌浸潤癌では、CK13 は全標本で陰性であった。CK17 との関係では、概ね両者 の陽性・陰性部は一致していた(図 8)。しかし、詳細にみると、浸潤癌の高分化 型で角化が進んだ部位では pVHL が染色されなかったのに対し、CK17 では強く染 色された(図 8BC)。
5) VHL 遺伝子の LOH と pVHL 染色像との関連性
VHL 遺伝子の LOH 陽性 4 例と陰性 4 例で pVHL 染色像を比較した。LOH 陽性例 と LOH 陰性例で染色態度に明確な差はなかった(図 9)。
VI. 考察
本研究において確立した pVHL 染色方法は、マウスモノクローナル抗体（Ig32）
が始めて抗原賦活化処理で、ホルマリン固定パラフィン包埋切片に対し染色可 能であることを示した。腎正常組織と淡明細胞型腎細胞癌の pVHL 染色パターン は、Corless ら(61)の凍結組織標本で染色した結果とよく一致した。淡明細胞型 腎細胞癌では、癌細胞の細胞質内の周辺部に局在する特徴があった。これは細 胞質内に脂質とグリコーゲンが大量に貯留しているため、蛋白成分が細胞質周 囲に押しやられているからと考えられる。また、Lin ら(62)も、ホルマリン固定 パラフィン包埋切片に対し、本研究とは異なる抗体、ラビットポリクローナル 抗体で染色している。抗原賦活化処理はタンパク質分解酵素を用いているが、
類似した染色パターンを報告している。これに対して舌癌の pVHL 染色は、これ までに 1 つの報告をみるのみである(63)。しかし、そこに示された染色像は非 特異的で、本研究とは異なる結果であった。異形成や LOH の検討もなく、舌癌 での pVHL 陽性例は、27 例中 10 例(37%)で、本研究と大きく異なっていた。この ような結果の差異は、使用した抗体や染色条件が異なることに起因すると考え られる。しかし、本研究の結果は、淡明細胞型腎細胞癌の染色パターンが陽性 コントロールとして示されており、信頼度の高い結果と言える。
本研究によって明らかにされた舌組織および舌癌の pVHL 染色の特徴的な点は、
(1)正常重層扁平上皮では、基底層と、有棘層のうち基底層周辺部に限局して染 色がみられたこと、(2)前癌状態とされている異形成で、その異型細胞を中心に 染色範囲の拡大が認められたこと、(3)浸潤癌では、分化の程度によらず全標本 で pVHL 染色がみられたこと、である。
舌正常上皮において pVHL が基底層と、有棘層のうち基底層の周辺部の細胞質 に局在して染色されたのは、同部に存在する胚細胞あるいは未分化細胞とされ る細胞が染色され易い特徴があるためと考えられる。扁平上皮ではないが、尿 細管、大腸、回腸、膀胱、前立腺、甲状腺、胆管の正常上皮細胞で pVHL は細胞 質で染色がみられる(61)。中でも近位尿細管の細胞はよく染色される。近位尿 細管は淡明細胞型腎細胞癌の発生母地と考えられている(64)。舌癌においても その発生は、正常上皮の基底層もしくは傍基底細胞層の胚細胞が異常に増殖し、
異形成となり、上皮を超えて浸潤し、浸潤癌と進展すると考えられる。つまり、
基底層と、有棘層のうち基底層の周辺部の細胞質で pVHL が染色されたことは、
腎細胞癌における近位尿細管との関係と同様のことを表していると考えられる。
本研究は、正常扁平上皮での pVHL 染色を初めて報告した。
本研究の結果は、pVHL が異形成の評価および診断の新たなツールとなる可能 性を示した。その理由について、CK13 と CK17 の免疫組織化学染色の結果と比較 し、述べる。臨床的に白板症として知られる病変には、非腫瘍性・反応性のも のから前癌状態やそれ以上のものまでが広く含まれる。しかし、特に反応性や 異型性の病理組織学的な分類における核異型度の判定は、しばしば主観的にな りがちであり、特に観察対象が小組織片に限定される生検診断においては、反 応性と腫瘍性の鑑別が困難なことも多い。そのため、病理学的に通常染色で異 型細胞が認識されても、良性・悪性について、その断定的な診断・評価が困難 なまま、臨床的に経時的な経過を追跡するより他に手立てがないことも数多く 経験される。近年、白板症の異型度をみる病理診断の補助として、CK13 や CK17 の発現パターンが有用であると認識されるようになってきた。CK17 は、アダプ ター蛋白の 1 つである 14-3-3σを細胞質内に配置させ、Akt/mTOR（mammalian target of rapamycin）シグナル経路を活性化させることでタンパク質合成と細 胞発育に関与している(65)。さらに同シグナル経路は細胞の分裂や成長、生存 における調節因子として種々のタンパク質合成を促進して、腫瘍細胞の増殖亢 進に重要な役割を果たしている(66, 67)。さらに CK17 は、異形成に陽性化する 補助マーカーとして中等度以上の異形成で陽性化する(68)。本研究では、舌異 形成において、CK13 が陰性化した異型部で pVHL が陽性化した。さらに、CK13 が異形成、浸潤癌と進行するにつれて陰性化するのに比較して、pVHL の染色は むしろ陽性化することが判明した。そして癌の進行とともに陽性化する点は CK17 に類似していた。CK13 および CK17 は、異形成の補助的な診断マーカーで あり、パターン A のような標本には異型度の評価に有用である。しかし、パタ ーン B は浸潤癌などの悪性病変を示す CK13 および CK17 の染色パターンである にもかかわらず、HE 染色では異形成を示しており、pVHL も HE 染色でみられた 異型部で染色され、不一致がみられる。また、パターン C は CK13 が強く減弱し
ているが、CK17 はごく弱陽性に留まっており、異型度の判定は困難である。し かし、pVHL は HE 染色でみられた異型部で染色されている。このように、舌異形 成での CK13 および CK17 の発現は不安定であり、より感度の高い診断補助ツー ルが必要とされている。異形成の異型部を検出する補助マーカーとして pVHL の 方が感度の点で優れている可能性が示唆される。もし、pVHL が潜在的に増殖能 を秘めた細胞に発現するのであれば、CK13 および CK17 では確定し得ない症例の マーカーとして、さらには異形成の癌化への予後を予測できる新しいツールと なる可能性がある。これまで舌異形成における pVHL の染色検討は行われていな い。本研究が初めての報告となる。
本研究では舌浸潤癌では、分化の程度によらず全標本で pVHL 染色がみられた。
また、中分化型で高分化型より強く染色され、さらに低分化型で弱く染色され た。その分化度による染色の特徴は、既知の報告と同様で癌細胞の密度が高い ところに強く pVHL は発現するため(69)と考えられた。また、分化度の低い癌は pVHL 発現が低下しているという報告もある(70)。これらの点から、癌で pVHL 発 現がみられたのは、より分化度の低い癌への進展、あるいは細胞のさらなる増 殖亢進を抑制するために発現する可能性が考えられた。一方で、pVHL は、淡明 細胞型腎細胞癌において 80%以上で染色陽性であり、転移巣においても 90%近く 染色が陽性であるから、腫瘍マーカーになり得る可能性も指摘されている(61, 62)。
本研究で行った予備実験では、淡明細胞型腎細胞癌において、pVHL の染色は VHL 遺伝子の異常とは相関しなかった。Schraml らも、淡明細胞型腎細胞癌にお いて pVHL の染色と VHL 遺伝子の LOH には関連がなかったと報告している(71)。
また、本研究では舌癌において、VHL 遺伝子の LOH と pVHL の染色とは関連がみ られず、舌癌全例で pVHL は染色された。このことは、がん種を問わず VHL 遺伝 子の変異や LOH は、pVHL の発現には影響を与えないと考えられた。しかし、他 の遺伝子においては、LOH がその遺伝子の発現の抑制に寄与する(72)。さらにま た、変異型タンパク質が組織に過剰蓄積しやすいことから、免疫組織化学染色 により遺伝子異常の存在を推定することができるがん抑制遺伝子もある(73, 74)。免疫組織化学染色は定性的であるため、pVHL の発現量の差は評価できない。
しかし、本研究の結果から、舌癌において pVHL のがん抑制機能が必ずしも効果 的に発揮されていない可能性も示され、治療への応用を考えると、癌細胞での pVHL 発現の意義についてさらなる検討を加える必要がある。
VII. 結語
舌癌組織において pVHL の免疫組織化学染色を行い、VHL 遺伝子の LOH とは無 関係に、全例で、そして非癌部よりもむしろ癌部で pVHL が発現していた。
pVHL 発現が腫瘍化過程に関連し、その免疫組織化学的染色が異形成の有無を 判断する補助的マーカーとして病理組織診断に有用である可能性を示唆した。
謝辞
本研究を遂行するにあたり、終始御懇篤なるご指導を賜りました日本大学医 学部耳鼻咽喉・頭頸部外科学分野助教 浅川剛志博士、研究を支えて下さった 日本大学医学部耳鼻咽喉・頭頸部外科学分野主任教授 大島猛史博士、日本大 学医学部病態病理学系腫瘍病理学分野准教授 楠美嘉晃博士、日本大学医学部 病態病理学系病理学分野 生沼利倫博士、日本大学医学部病態病理学系形態機 能病理学分野准教授 江角眞理子博士、日本大学医学部耳鼻咽喉・頭頸部外科 学分野研究助手 前田美代子氏に心から感謝いたします。
表
表1. 腎細胞癌臨床病理学的分類(58) Grade-Histological grading
G1 Small hyperchromatic nuclei (resembling mature lymphocytes) with no visible nucleoli and little detail in the chromatin.
G2 Finely granular "open" chromatin but inconspicuous nucleoli at this magnification.
G3 The nucleoli must be easily unequivocally recognizable with the 10x objective.
G4 Characterized by nuclear pleomorphism, hyperchromasia and single to multiple macronucleoli.
表2. 淡明細胞型腎細胞癌 22 例
No. Age Sex Genetic alternation
Grade Mutation LOH
1 68 M N N 1
2 51 M N N 2
3 50 M N N 2
4 32 M N N 2
5 58 M N N 1
6 58 M N P 1
7 64 F N P 1
8 46 M N P 1
9 60 F N P 1
10 74 M N P 2
11 59 M N P 1
12 62 F P N 1
13 44 M P N 2
14 68 F P N 1
15 35 M P P 2
16 72 M P P 2
17 60 M P P 1
18 57 M P P 2
19 42 M P P 1
20 77 M P P 2
21 70 M P P 1
22 56 F ni ni 2
LOH, loss of heterozygosity; P, positive; N, negative; ni, not informative.
Grade 1 は高分化型、Grade 2 は中分化型。遺伝子異常は五十嵐らより引用した (59)。
表3. 舌癌の TNM 分類と舌癌臨床病理学的分類(58) T-Primary tumor
TX Primary tumor cannot be assessed T0 No evidence of primary tumor Tis Carcinoma in situ
T1 Tumor 2 cm or less in greatest dimension
T2 Tumor more than 2 cm but not more than 4 cm in greatest dimension T3 Tumor more than 4 cm in greatest dimension
T4a
Tumor invades through cortical bone, into deep/extrinsic muscle of tongue(genioglossus, hyoglossus, and styloglossus), maxillary sinus, or skin of face
T4b Tumor invades masticator space, pterygoid plates, or skull base; or encases internal carotid artery
N-Regional Lymph Nodes
NX Regional lymph nodes cannot be assessed N0 No regional lymph node metastasis
N1 Metastasis in a single ipsilateral lymph node, 3 cm or less in greatest dimension
N2 Metastasis as specified in N2a, 2b, 2c below
N2a Metastasis in a single ipsilateral lymph nodes, none more than 6 cm in greatest dimension
N2b Metastasis in multiple ipsilateral lymph nodes, none more than 6 cm in greatest dimension
N2c Metastasis in bilateral or contralateral lymph nodes, none more than 6 cm in greatest dimension
N3 Metastasis in a lymph node more than 6 cm in greatest dimension
M-Distant metastasis
MX Distant metastasis cannot be assessed M0 No distant metastasis
M1 Distant metastasis
Stage grouping
Stage 0 Tis N0 M0
Stage Ⅰ T1 N0 M0
Stage Ⅱ T2 N0 M0
Stage Ⅲ T1, T2 N1 M0
T3 N0, N1 M0
Stage ⅣA T1, T2, T3 N2 M0
T4a N0, N1, N2 M0
Stage ⅣB Any T N3 M0
T4b Any N M0
Stage ⅣC Any T Any N M1
Grade-Histological grading
G1 Well differentiated
The normal squamous epithelium with extensive keratinisation and pearl formation
G2 Moderately differentiated Less keratinisation and more nuclear pleomorphism and mitotic activity
G3 Poorly differentiated
Markedly pleomorphic cells with minimal keratinisation and prominent mitotic activity with plenty of atypical mitotic figures
表4. 舌癌 19 例 Case
No. Age Sex Stage LOH Grade
Histological examination
Normal Dysplasia Tumor (differentiation) Well Moderate Poor
1 55 M II P 1 + + +
2 56 F II P 1 +
3 64 F II P 1 +
4 73 M II P 2 + +
5 22 M II N 1 + +
6 30 F IV N 1 +
7 32 M IV N 1 + +
8 62 F I N 1 + + +
9 25 M II ni 1 +
10 30 F III ni 1 + + + +
11 66 M I ni 1 + +
12 72 F I ni 1 + +
13 73 F II ni 1 + + +
14 76 M I ni 1 +
15 79 F II ni 1 + +
16 61 F II ni 2 + + +
17 63 F IV ni 2 + +
18 69 M III ni 2 + +
19 76 F III ni 3 +
Total 4 9 16 6 3
LOH, loss of heterozygosity; P, positive; N, negative; ni, not informative.
Grade 1 は高分化型、Grade 2 は中分化型、Grade 3 は低分化型。LOH 陽性・陰 性は Asakawa らより引用した(25)。なお、全例でVHL 遺伝子変異はみられなか った(25)。
表5. VHL 遺伝子の異常と pVHL 染色の関連性
0hit 1hit
２hits Total Mutation LOH
pVHL P 4 2 5 5 16
N 0 1 3 1 5
Total 4 3 8 6 21
P, Positive; N, Negative.遺伝子異常は五十嵐らより引用した(59)。
図と図説
図1. 腎正常組織の抗原賦活化処理による pVHL 染色
(A)HE 染色、(B-E)pVHL 染色。(B)抗原賦活化処理なし、(C)トリプシン処理、(D) 電子レンジ処理、(E)圧力鍋による加熱処理、矢印は近位尿細管を示す、(F)圧 力鍋による加熱処理、陰性対照のマウスモノクローナル抗体。スケールバーは 50μm。本文参照(P9、9 行目から 16 行目と 21 行目から 24 行目)。
図2. 淡明細胞型腎細胞癌の HE 染色と pVHL の免疫組織化学染色
(A)淡明細胞型腎細胞癌の HE 染色、(B)淡明細胞型腎細胞癌の pVHL 染色、矢印 は癌細胞陽性部位を示す。(C)顆粒細胞型部分の HE 染色、(D)顆粒細胞型部分の pVHL 染色。スケールバーは 50μm。本文参照(P9、26 行目から 31 行目)。
図3. 舌正常上皮の HE 染色と pVHL の免疫組織化学染色
(A)舌正常上皮の HE 染色、(B) 舌正常上皮の pVHL 染色。スケールバーは 25μm。
本文参照(P10、10 行目から 13 行目)。
図4. 舌異形成の HE 染色と pVHL の免疫組織化学染色
(A) 舌異形成の HE 染色、(B) 舌異形成の pVHL 染色。スケールバーは 25μm。本 文参照(P10、15 行目から 18 行目)。
図5. 舌浸潤癌の HE 染色と pVHL の免疫組織化学染色：高分化型、中分化型、
低分化型病変の比較
HE 染色(左)、pVHL 染色(右)。(A-B)高分化型、(C-D)中分化型、(E-F)低分化型、
(G)B の強拡大。(A-F)スケールバーは 50μm。本文参照(P10、20 行目から 26 行 目)。
図6. 舌正常上皮の HE 染色と pVHL、CK13、CK17 の免疫組織化学染色の比較 (A)HE 染色、(B)pVHL 染色、(C)CK13 染色、(D)CK17 染色。スケールバーは 25μm。
本文参照(P10、29 行目から 30 行目)。
図7. 舌異形成の HE 染色と pVHL、CK13、CK17 の免疫組織化学染色の比較 HE 染色(1 列目)、pVHL 染色(2 列目)、CK13 染色(3 列目)、CK17 染色(4 列目)、
染色パターンの模式図。(a-d)パターン A、(e-h)パターン B、(i-l)パターン C。
スケールバーは 25μm。本文参照(P10、31 行目から P11、3 行目)。
図8. 舌癌の pVHL と CK17 の免疫組織化学染色の比較
HE 染色(1 列目)、CK17 染色(2 列目)、pVHL 染色(3 列目)。(A-C)高分化型、矢印 は舌癌の角化が進んだ部位を示す、(D-F)中分化型、(G-I)低分化型。スケール バーは 25μm。本文参照(P11、4 行目から 7 行目)。
図9. 舌浸潤癌(高分化型)の LOH 陽性例と陰性例の pVHL 免疫組織化学染色の 比較
(A) LOH 陽性例の pVHL 染色、(B) LOH 陰性例の pVHL 染色。スケールバーは 25 μm。本文参照(P11、9 行目から 11 行目)。
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研究業績
長谷川 央
目次
I. 発表
①一般発表 16 (単 0/共 16)
②特別発表 なし
II. 論文
①原著論文 3 (単 0/共 3)
②症例報告 3 (単 0/共 3)
③総説 なし
III. 著書 なし
I. 発表
① 一般発表
1. 戸井 輝夫, 樋口 雄將, 池田 篤生, 長谷川 央, 小野田 恵子, 生 井 明浩, 野村 泰之, 池田 稔：当科における味覚障害患者の予後因 子の検討，第 23 回日本口腔・咽頭科学会総会ならびに学術講演会，
東京，2010.9.16-17.
2. 鴫原 俊太郎, 長谷川 央, 増田 毅, 松崎 洋海, 浅川 剛志, 野口 雄五, 野村 泰之, 池田 稔：当科における聴神経腫瘍経過観察症例，
第 20 回日本耳科学会総会・学術講演会，松山，2010.10.7-9.
3. 長谷川 央, 高根 智之, 岸 博行, 矢田 修一郎, 平井 良治, 工藤 逸大, 牧山 清, 芦野 直子：狭義の機能性発声障害と心身症，第 501 回日大医学会例会，東京，2010.12.2.
4. 牧山 清, 平井 良治, 岸 博行, 児玉 ひとみ, 吉橋 秀貴, 鈴木 知 恵, 長谷川 央, 矢田 修一郎, 池田 稔：Ho:YAG レーザーによる内視 鏡下喉頭下咽頭手術，第 112 回日本耳鼻咽喉科学会総会・学術講演 会，京都，2011.5.19-21.
5. 長谷川 央，浅川剛志，古阪 徹，樋口雄将，戸井輝夫，中里秀史，
池田 稔：反復性顔面神経麻痺を呈した上咽頭腫瘍の１例，第 34 回 日本顔面神経研究会，東京，2011.6.2-3
6. 平井良治，池田篤生，岸 博行，長谷川 央，工藤逸大，久木元延 生，池田 稔：反復する顔面神経麻痺を伴う脳幹部血管腫，第 34 回 日本顔面神経研究会，東京，2011.6.2-3
7. 西川智子、長谷川 央、芝田敏克、黒田和道、増谷友江、川村 孝、
花田信弘、濱田良樹、池田 稔、山本樹生、清水一史：インフルエ ンザ A(H3N2)感染患者における機能的新型ウイルスの出現，第 34 回 日本分子生物学会年会，横浜，2011.12.13-16
8. 清水一史、西川智子、長谷川 央、豊澤恵子、山崎元美、芝田敏克、
黒田和道、増谷友江、川村 孝、花田信弘、濱田良樹、池田 稔、
山本樹生：インフルエンザ感染患者における機能的新型ウイルスの 出現とその意味，第 26 回インフルエンザ研究者交流会シンポジウム，
福島，2012.5.24-26
9. 長谷川 央，古阪 徹，浅川剛志，関根大喜，鈴木啓誉，池田 稔：
耳下腺悪性腫瘍と顔面神経障害，第 35 回日本顔面神経研究会，福島，
2012. 5.31-6.1
10.西川智子、長谷川央、山本樹生、池田 稔、濱田良樹、清水一史：
細菌ノイラミニダーゼのインフルエンザウイルス増殖に対する影響，
第 60 回日本ウイルス学会，大阪，2012.11.13-15.
11.長谷川 央, 古阪 徹, 浅川 剛志, 関根 大喜, 鈴木 啓誉, 池田 稔：耳下腺悪性腫瘍と顔面神経障害：第 517 回日大医学会例会，東 京，2013.3.9.
12.長谷川 央, 西川 智子, 山崎 元美, 豊澤 恵子, 山本 樹生, 池田 稔, 古阪 徹, 清水 一史：鼻粘液が有する抗インフルエンザウイル ス活性，第 114 回日本耳鼻咽喉科学会総会・学術講演会，札幌，
2013.5.15-18.
13.長谷川 央, 飯國 芙沙子, 浅川 剛志, 古阪 徹：耳下腺良性腫瘍に おける術後顔面神経麻痺の検討，第 521 回日大医学会例会、東京、
2013.11.30.
14.山中 弘明, 長谷川 央, 戸井 輝夫, 岸 博行, 田中 真琴, 増田 毅, 浅川 剛志, 野村 泰之, 鴫原 俊太郎, 古阪 徹：当科における耳下 腺良性腫瘍の検討，第 115 回日本耳鼻咽喉科学会総会・学術講演会，
福岡，2014.5.14-17.
15.長谷川 央, 岸 博行, 木村 優介, 山中 弘明, 大内 俊孝, 戸井 輝 夫, 高根 智之, 田中 真琴, 増田 毅, 浅川 剛志, 野村 泰之, 鴫 原 俊太郎, 古阪 徹：術前に血管塞栓療法を施行した鼻副鼻腔血管 腫および血瘤腫の 3 例，第 115 回日本耳鼻咽喉科学会総会・学術講 演会，福岡，2014.5.14-17.
16.Hisashi Hasegawa, Tohru Furusaka, Hiroumi Matuzaki, Takeshi Asakawa, Takeshi Oshima : Maxillary Sinus Hemangioma: Usefulness of
Embolization According to Classification, 13th Asia Oceania ORL-HNS Congress, Taipei, Taiwan, 2015.3.19-22(ポスター発表)
② 特別発表
なし
II. 論文
① 原著論文
1. 長谷川 央, 古阪 徹, 浅川 剛志, 関根 大喜, 鈴木 啓誉, 池田 稔：耳下腺悪性腫瘍と顔面神経障害，Facial Nerve
Research(0914-790X)，32 巻 Page107-109，2012
2. Hirai R, Makiyama K, Higuti Y, Ikeda A, Miura M, Hasegawa H, Kinukawa N, Ikeda M.: Pharyngeal squamous cell papilloma in adult Japanese: comparison with laryngeal papilloma in clinical manifestations and HPV infection.:Eur Arch Otorhinolaryngol，
Oct;269(10):2271-6，2012
3. 長谷川 央, 古阪 徹, 大内 俊孝, 鈴木 啓誉, 浅川 剛志, 鴫原 俊 太郎, 池田 稔：当科における小児顔面神経麻痺 28 例の検討，Facial Nerve Research(0914-790X)，33 巻 Page59-61，2013
② 症例報告
1. 平井 良治, 野村 泰之, 池田 稔, 岸 博行, 池田 篤生, 長谷川 央, 工藤 逸大, 牧山 清：一側再発性顔面神経麻痺を伴う脳幹部血管腫，
Facial Nerve Research(0914-790X) ，31 巻 Page100-102，2011
2. 長谷川 央, 浅川 剛志, 古阪 徹, 樋口 雄將, 戸井 輝夫, 中里 秀 史, 野村 泰之, 池田 稔：反復性顔面神経麻痺を呈した上咽頭腫瘍の 1 例， Facial Nerve Research(0914-790X) ，31 巻 Page115-116，2011 3. Hisashi Hasegawa, Hiroumi Matuzaki, Tohru Furusaka, Takeshi
Oshima, Shinobu Masuda, Toshiyuki Unno, Osamu Abe: Maxillary sinus hemangioma: Usefulness of embolization according to classification, Brazilian Journal of Otorhinolaryngology, (in press)
③ 総説
なし
III. 著書
なし
