および Neisseria gonorrhoeae の検出

(1)

子宮頸管および咽頭擦過検体，尿検体に対する SDA 法を原理とする新しい核酸増幅法を用いた Chlamydia trachomatis

および Neisseria gonorrhoeae の検出

1）愛知医科大学産婦人科学教室，^2）長野赤十字病院産婦人科，^3）松下記念病院産婦人科，

4）川崎医科大学附属川崎病院産婦人科，^5）蒲郡市民病院産婦人科，^6）保科医院

野口靖之

^１）

完山秋子

^１）

藤田将

^１）

本藤徹

^２）

菅生元康

^２）

保田仁介

^３）

藤原道久

^４）

保條説彦

^５）

保科眞二

^６）

野口昌良

^１）

（平成 18 年 2 月 9 日受付）

（平成 18 年 3 月 8 日受理）

Key words : Chlamydia trachomatis , Neisseria gonorrhoeae, nucleic acid amplification system, strand displacement amplification

要旨

新しく開発された核酸増幅法である Strand Displacement Amplification（SDA 法）

^１）

を原理とし Chlamy- dia trachomatis および Neisseria gonorrhoeae を検出する BD プローブテック ET CT! GC（プローブテック；

日本ベクトン・ディッキンソン）の有用性について産婦人科外来または入院患者を対象とし検討した．

子宮頸管擦過検体 364 検体について，アンプリコア STD−1（アンプリコア；ロシュ・ダイアグノスティックス）と比較した結果，クラミジアの陽性一致率は 98.2％（55 ! 56），陰性一致率は 99.4％（306 ! 308），淋菌の陽性一致率は 100％（10! 10），陰性一致率は 99.4％（352! 354）であった．また，同時に採取した尿 363 検体における陽性数はクラミジアで 50 検体，淋菌で 11 検体であった．咽頭擦過検体 247 検体において，クラミジア陽性例がプローブテックで 21 検体，DNA プローブ「RG」クラミジア（DNA プローブ法；レビオ・ジェン）で 2 検体に認められた．不一致の 19 検体の内 16 検体でアンプリコアが陽性であった．一方，

淋菌は，プローブテックで 21 検体，DNA プローブ「RG」ゴノレア（DNA プローブ法；レビオ・ジェン）

で 6 検体が陽性であった．しかし，結果が一致しなかった 15 検体は，全て淋菌の cppB 領域の nested PCR 法が陽性であった．プローブテックは子宮頸管擦過検体において現在最も汎用されているアンプリコアと非常に良い相関を示し，診断法として有用であると考えられた．また，Neisseria 属の口腔内常在菌との交叉の問題から適切な核酸増幅法による検出手段がなかった咽頭検体においてもプローブテックの高い特異性が確認され適用の可能性が証明された．

〔感染症誌 80：251〜256，2006〕

序文

性感染症（STD）は，若年層を中心とする無防備な性行動や初交年齢の低下により 10〜20 歳代で罹患者が全世界で急速に増加しつつある．また，先進国の中で日本だけが未だに新規 HIV 感染者数の発生が増加傾向にあり

^２）^３）

，厚生労働省は，平成 12 年より「性感染症に関する特定感染症予防指針」を出し対策を

行っている．現在，流行している STD は，感染しても無症候のことが多く治療せず放置されることが多い．特に，性器 Chlamydia trachomatis （クラミジア），

Neisseria gonorrhoeae（淋菌）感染症は男女共に不顕性感染者が多数存在し新たな感染源になっている．このためクラミジアおよび淋菌は，日本だけでなく世界的に STD の原因菌として最も頻度が高い．さらに，口腔性交（オーラルセックス）をコンドームなしで提供する性風俗店の大衆化や若年者においてオーラルセックスが一般化したことから生殖器から咽頭が新たな

原著

別刷請求先：（〒107―0052）東京都港区赤坂8―5―26 日本ベクトン・ディッキンソン株式会社ダイア

グノスティックシステムズ手塚隆善

(2)

STD の感染経路として問題視されている．クラミジアや淋菌は，病原体の特徴から培養法による菌体の検出が困難である．このため，臨床的には，核酸増幅法や DNA プローブ法，抗原・抗体法が診断に用いられている．しかし，DNA ブローブ法，抗原・抗体法は，

感受性が低く骨盤内に感染した微量なクラミジアや淋菌を子宮頸管分泌物より検出することは困難である．

また，核酸増幅法を用いたアンプリコアは，クラミジアの検出では感度，特異性ともに優れているが，淋菌においては口腔内常在菌である Neisseria subflava ，

Neisseria cinerea の一部と交差反応を起こし咽頭検体

の測定はできない

^４）

．さらに，オーラルセックスにより口腔内常在菌が女性性器に存在している可能性も示唆されており，淋菌に対しより特異性の高い診断薬の開発が求められていた．

核酸増幅検査法として新たに開発されたプローブテックは，米国および EU 諸国において広く使用されており，クラミジア，淋菌の検出において感受性と特異性が極めて高いとされている

^{５）〜７）}

．今回，我々は子宮頸管擦過検体を用いて現在最も汎用されているアンプリコアとの比較によりその性能を確認すると共に，

初尿における検出率，プローブテックの咽頭擦過検体に対する適用拡大の可能性について検討した．

対象および方法

1．対象および検体

2004 年 3 月から 10 月にかけて参加医療機関産婦人科を受診した妊婦 19 症例，一般外来患者 116 症例および性感染の検査を目的として来院した性風俗店に従事する女性 172 症例，合計 307 症例（平均年齢 26.9±

5.8 歳）から，子宮頸管擦過検体（364 検体），尿検体

（363 検体）および咽頭擦過検体（247 検体）を採取した．なお，検体の採取に先立ち試験の趣旨を説明し，

文書による同意を取得した．

2．方法および解析

子宮頸管擦過検体については，子宮頸管入口を洗浄用スワブにて拭った後，プローブテック用スワブ，アンプリコア用スワブおよび予備用スワブの合計 3 本を用いて，擦過検体を採取した．なお，検体採取に際し，

プローブテック，アンプリコアについては検体採取の順番による影響を避けるため，検体毎に交互に採取を行ない，予備スワブは常に 3 番目の採取とした．プローブテック用スワブは採取後，専用の希釈液入り輸送チューブに差し込み，スワブの軸を所定の位置で折り，栓をして冷蔵保存した．アンプリコア用および予備用にはドライスワブを使用し，採取後冷蔵保存した．測定後，両検査結果の比較し一致率を求めた．また，結果が一致しなかった検体については，残検体または予備検体を用いた再検，淋菌の不一致については

既報に基づいた nested PCR を構築し確認試験を実施した．

尿検体については，子宮頸管擦過検体採取を行った同一患者から初尿の採取を行った．採取した尿にプローブテック専用の Urine Processing Pouch（UPP）

を添加し冷蔵保存した．プローブテックにて測定を実施し，子宮頸管擦過物検体の結果と比較を行った．

咽頭擦過検体については，咽頭後壁および!桃をプローブテック用スワブおよび DNA プローブ法用の 2 本のスワブにて同時に擦過検体を採取した．採取後，

各々専用の希釈液入り輸送チューブに差し込み，スワブの軸を所定の位置で折り，栓をして冷蔵保存した．

測定後，両検査結果の比較を行い，一致率を求めた．

また，結果が一致しなかった検体については，クラミジアについてはアンプリコアを，淋菌については既報に基づいた nested PCR を構築し確認試験を実施した．

検体は冷蔵輸送し，プローブテック，アンプリコアおよび DNA プローブ法はエスアールエル（東京）にて，淋菌の cppB 領域の nested PCR についてはゲノムサイエンス研究所（福島）にて測定を実施した．

3．プローブテック

プローブテックは等温で核酸増幅を行う SDA 法と二つの蛍光物質を用いた検出系により，リアルタイムに増幅と検出を行う試薬と機器を組み合わせた測定システムである

^８）^９）

．測定までのワークフローは以下のとおりである．

子宮頸管擦過または咽頭擦過検体を採取したスワブの入ったチューブを 114℃ で 30 分，専用ライシングヒーターにて加熱する．15 分室温にて冷却し，チューブ内のスワブを廃棄後，各検体の抽出液をプライミングウエルに 150µLずつ専用の 8 連電動式ピペッターにて分注し，室温で 20 分間インキュベートする．更に 72.5℃ に設定された専用プライミングヒーターで 10 分間インキュベート後，予め専用ウォーミングヒーターで 54℃ に加温した増幅ウエルに 100µLずつ専用の 8 連電動式ピペッターにて分注する．専用シールにてウエルをカバーした後，測定器本体へ装填する．ここからは測定機器による自動測定となり，52.5℃ の一定温度下で増幅と検出が同時に行われ，60 分後に測定結果が自動的に印刷される．尿検体の場合は，採取尿4mLを 2,000g×30 分で遠心後，上清尿を捨て専用の検体抽出用の希釈液 2mLを加えた後は，ライシングヒーターにて加熱するところからスワブ検体と同じ処理となる．試薬としては，プライミングウエル，増幅ウエルおよび検体抽出用の希釈液だけであり，全て室温保存可能である．

プローブテックにおいてクラミジアでは cryptic

(3)

Table 1 Comparison between the results of the BDProbeTec ET and the Amplicor assays for C.trachomatisin endocervicalswabs

Total Amplicor PCR

Negative Positive

57 2

55 Positive

BDProbeTec ET

307 306

1 Negative

364 308

56 Total

Positive agreement rate：98.2% (55/56) Negative agreement rate：99.4% (306/308)

Table 2 Comparison between the results of the BDProbeTec ET and the Amplicor assays for N.gonorrhoeaein endocervicalswabs

Total Amplicor PCR

Negative Positive

12 2^a

10 Positive

BDProbeTec ET

352 352

0 Negative

364 354

10 Total

aTwo samples were positive by nested PCR.

Positive agreement rate：100% (10/10) Negative agreement rate：99.4% (352/354)

Table 3 Correlation between the results ofendocervical and urine specimens from the same individuals on the BDProbeTec ET

N.gonorrhoeae C.trachomatis

Urine Endocervical

Swab

11 50

Positive Positive

1 7

Negative Positive

0 3

Positive Negative

351 303

Negative Negative

Positive agreement rate (Urine/Swab)：C.trachomatis,87.7%；

N.gonorrhoeae,91.7%

plasmid 上の特異配列

^１０）

を，淋菌では淋菌 DNA 上の piv

^Ng^１１）

を増幅および検出のターゲットとしている．

4．淋菌の nested PCR

Farrel の報告

^１２）

に基づき，淋菌の cppB gene 領域をターゲットとし，1

^st

プライマーに HO1：5 -GCT ACG CAT ACC CGC GTT GC-3 および HO3：5 -CGA AGA CCT TCG AGC AGA CA-3 （antisense se- quence）を，2

^nd

プライマーに cppBN1：5 -GCT GTT TCA AGT CGT CCA GC-3 および cppBN2：5 -CGA AGC CGC CAG CAT AGA GC−3（antisense se- quence）を用い nested PCR にて特異的配列を増幅し，電気泳動にて増幅産物を確認した．

なお，臨床由来の Neisseria subflava ， N. sicca ， N.

mucosa ， N. lactamica を用いて特異性の確認を行い使用した．

成績

子宮頸管擦過検体のクラミジアにおける陽性一致率は 98.2％（55 ! 56），陰性一致率は 99.4％（306 ! 308），

不一致を 3 検体認めた（Table 1）．淋菌において陽性一致率は 100％（10! 10），陰性一致率は 99.4％（352!

354），不一致が 2 検体存在した（Table 2）．この 2 検体につきプローブテック用の抽出検体の残液を用いて nested PCR を実施したところ，2 検体ともに淋菌 DNA が陽性であった．

尿検体は，採尿が出来なかった 1 例を除き 363 例で採取し得た．子宮頸管擦過検体陽性，尿検体陰性がクラミジアで 7 検体，淋菌で 1 検体認められ，子宮頸管擦過検体と尿検体との陽性一致率はクラミジアで 87.7％，淋菌で 91.7％であった．逆に尿検体が陽性で，

子宮頸管擦過検体陰性をクラミジアで 3 検体認めた

（Table 3）．

咽頭擦過検体のクラミジアにおいてプローブテック

で 21 検体が陽性となり，その内 2 検体がプローブ法

で陽性であった（Table 4）．不一致 19 検体につきプ

ローブテック用検体またはプローブ法用検体を用いて

希釈法により増幅阻害を抑制しアンプリコアを実施し

たところ，16 検体が陽性であった．淋菌においてプ

ローブテックで 21 検体陽性となり，その内 6 検体が

DNA プローブ法で陽性であった（Table 5）．アンプ

リコアによる咽頭擦過検体を対象とした淋菌の検索

は，口腔内常在菌に交差反応を示すため不可であるこ

とから，不一致 15 検体につきプローブテック用検体

(4)

Table 4 Comparison between the results of the BDProbeTec ET and the DNA probe for Chlamydia trachomatis in the pharyngealswabs

Total DNA probe

Negative Positive

21 19^a

2 Positive

BDProbeTec ET

226 226

0 Negative

247 245

2 Total

a Sixteen out of19 samples were positive by the Amplicor PCR.

Positive agreement rate：100% (2/2) 　 Negative agreement rate：92.2% (226/245)

Table 5 Comparison between the results of the BDProbeTec ET and the DNA probe for N.gonorrhoeaein the pharyngealswabs

Total DNA probe

Negative Positive

21 15^a

6 Positive

BDProbeTec ET

226 226

0 Negative

247 241

6 Total

a Allsamples were positive by nested PCR.

Positive agreement rate:100% (6/6) Negative agreement rate:93.8% (226/241)

を用いて cppB 領域の nested PCR を実施した結果，

全て陽性であった．

考察

女性性器クラミジア感染症の多くは，無治療のまま放置されると上行性感染し卵管通過障害や卵管閉塞の原因になる．これらは，難治性卵管性不妊症の原因となり産婦人科領域では大きな問題になっている．さらに，骨盤内に波及したクラミジアは，上行性に波及し肝周囲炎，Fitz-Hugh-Curtis 症候群を引き起こす．一方，男性における性器クラミジア感染症の多くは無症候であるが，時に尿道炎や精巣上体炎を引き起こす．

また，男性の性器淋菌感染症は，尿道炎など明らかな自覚症状を伴うこともあるが，女性では，それほど激しい症状を呈さず無症候性感染が多いと言われている．クラミジア，淋菌は，他の一般細菌と異なり外来診療において培養法により菌体を検出することが困難である．このため，本邦では PCR 法を用いた核酸増幅法であるアンプリコアが診断に広く用いられている．

今回，子宮頸管擦過検体に対するアンプリコアとプローブテックの比較では，クラミジア，淋菌共に非常に高い陽性一致率を認めた．クラミジアに関する検討において 3 検体の不一致を認めたが，プローブテック陽性，アンプリコア陰性の 2 検体では，尿検体がアンプリコアで陽性を示した．プローブテック陰性，アンプリコア陽性となった 1 検体については，プローブ

テックの増幅コントロールが充分増幅しなかったことから増幅阻害による偽陰性と考えられた．淋菌に関する検討では，プローブテック陽性，アンプリコア陰性の不一致を 2 検体で認めたが，2 検体ともに淋菌 DNA が確認され，アンプリコアの偽陰性と考えられた．

プローブテックにより子宮頸管擦過検体と尿検体の陽性一致率をクラミジアと淋菌に対し検討したところ，他のクラミジア，淋菌の検出キットを用いた報告

^１３）

と同様に子宮頸管擦過検体の陽性率が高値となった．

以上より女性クラミジア・淋菌性器感染症の診断において尿検体は，スクリーニングとして有用であるが，

正確な診断を行うためには子宮頸管擦過検体を用いる必要があると考えられた．

咽頭擦過検体に対する検討では，プローブテックでクラミジア陽性を示した検体が DNA プローブ法で陰性を示したが，アンプリコアによる検査結果から DNA プローブ法と核酸増幅法における検出感度の差によるものと考えられた．淋菌の検討においてもプローブテックで陽性を示し DNA プローブ法で陰性を示した検体があった，nested PCR 法によりプローブテックの偽陽性ではなく，DNA プローブ法と核酸増幅法における検出感度の差によるものと確認された．

現在，性産業従事者だけでなく若年者や一般女性においてもオーラルセックスが行われるようになり，クラミジアや淋菌の咽頭感染の増加が懸念されている．

このためクラミジアや淋菌による咽頭感染に対する鋭

(5)

敏で正確な診断試薬の必要性が高まっている．プローブテックは，アンプリコアと共に交差反応がなく口腔内クラミジアの有用な検出方法と考えられた．一方で，淋菌の検出は，口腔内にナイセリア属の常在菌が存在するため，これまで市販された核酸増幅法による診断試薬が使用できなかった．今回検討したプローブテックは米国および EU 諸国で使用実績があり，

Schater らの咽頭検体を用いた検討においても，プローブテックの特異性は 99.5％（1! 190）と，アンプリコアの特異性 79.5％（39! 190）に比べ優れていると報告されている

^１４）

．

プローブテックは子宮頸管擦過検体において本邦で最も汎用されているアンプリコアと非常に良い相関を示し，その感度および特異性は高いと考えられた．また，ナイセリア属の口腔内常在菌との交叉反応がほとんどなく淋菌検出の特異性は極めて高いと考えられた．以上よりプローブテックは，女性性器だけでなく咽頭におけるクラミジアおよび淋菌検出試薬として有用であることが確認された．

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(6)

Evaluation of the New Nucleic Acid Amplification System for Direct Detection of Chlamydia trachomatis and Neisseria gonorrhoeae in Women

Yasuyuki NOGUCHI

^１）

, Akiko KANYAMA

^１）

, Masaru FUJITA

^１）

, Toru HONDO

^２）

, Motoyasu SUGASE

^２）

, Jinsuke YASUDA

^３）

, Michihisa FUJIWARA

^４）

, Tatsuhiko HOJO

^５）

, Shinji HOSHINA

^６）

& Masayoshi NOGUCHI

^１）

1)Department of obstetrics and gynecology, Aichi Medical University, School of Medicine,²⁾Department of obstetrics and gynecology, Nagano Red Cross Hospital,³⁾Department of obstetrics and gynecology, Matsushita Memorial Hospi- tal,⁴⁾Department of obstetrics and gynecology, Kawasaki Hospital,⁵⁾Department of obstetrics and gynecology, Gama-

gori City Hospital,⁶⁾Hoshina Clinic

および Neisseria gonorrhoeae の検出

子宮頸管および咽頭擦過検体，尿検体に対する SDA 法を原理と する新しい核酸増幅法を用いた Chlamydia trachomatis