第 35 回本薬物動態学会年会ヒトiPS 細胞由来腸管上細胞 (F-hiSIEC TM ) の特性と吸収予測精度改善の検討 2020 年 12 1 富フイルム株式会社美伸治

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第35回⽇本薬物動態学会年会

ヒトiPS細胞由来腸管上⽪細胞（F-hiSIEC ^TM ）の特性と収測精度改善検討

吸収予測精度改善の検討

2020年12⽉1⽇

富⼠フイルム株式会社

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凍結 Day30

Day0 Day30

Day0

・名古屋市⽴⼤学松永教授との共同研究で腸管上⽪細胞分化プロトコルを検討

1 ・ヒトiPS細胞から分化途中の細胞を凍結保存し、F-hiSIEC™として開発

・細胞解凍後、9-11⽇培養で成熟した腸管上⽪細胞として使⽤可

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F-hiSIECの特徴 –CYPs活性-

pmol/2h/mg protein

CYP3A4/5 CYP2C9 CYP2C19 CYP2D6 CYP1A2 Human primary enterocytes 848 ± 148 1330 ± 780 20 ± 11 15 ± 2 N.D.

Caco-2 cells 26 ± 3 N.D. N.D. 3 ± 1 225 ± 94

Each cells were incubated with 5 µM midazolam, 5 µM diclofenac, 45.7 µM (S)-mephenytoin, 5 µM bufuralol, 40 µM phenacetin for 2 h at

37℃ *CYP3A4/5 i F hiSIEC ith F hiSIEC di Th t t ll t d d th t b lit

F-hiSIEC 840± 50* 130 ± 43 76 ± 18 3 ± 0 364 ± 76

37℃. *CYP3A4/5 in F-hiSIEC was measure with F-hiSIEC assay medium. The supernatants were collected and the metabolites were measured by UPLC–MS/MS. All data are presented as mean ± standard deviation (n = 3–6). Human Enterocytes (purchased from In Vitro ADMET Laboratories, Inc.) were used as primary small intestinal cells.

F-hiSIECはヒト⽣体⼩腸と類似のCYPs活性を⽰した

F hiSIECはヒト⽣体⼩腸と類似のCYPs活性を⽰した

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F-hiSIECの特徴 –遺伝⼦発現-

10 100 1000

CYP3A4

10 100 1000

CYP2C9

10 100 1000

CYP2C19

10 100 1000

CES1

10 100 1000

CES2

1

AI Caco-2 Diff. I

1

AI Caco-2 Diff. I

1

AI Caco-2 Diff. I

1

AI Caco-2 Diff. I

1

AI Caco-2 Diff. I

1000

UGT1A1

100 1000

SULT1B1

100 1000

SI

100 1000

UGT2B7

F-hiSIEC F-hiSIEC F-hiSIEC F-hiSIEC F-hiSIEC

1 10 100

AI Caco-2 Diff. I

1 10 100

AI Caco-2 Diff. I

1 10 100

AI Caco-2 Diff. I

1 10 100

AI Caco-2 F-hiSIECDiff. I F-hiSIEC F-hiSIEC

F-hiSIEC

ABCB1 / MDR1 ABCC1 / MRP1 ABCC2 / MRP2 ABCC3 / MRP3 ABCG2 / BCRP

1 10 100 1000

AI C 2 Diff I

1 10 100 1000

AI C 2 Diff I

1 10 100 1000

AI C 2 Diff I

1 10 100 1000

AI C 2 Diff I

1 10 100 1000

AI C 2 Diff I

F hiSIEC F hiSIEC F hiSIEC F hiSIEC F hiSIEC

AI Caco-2 Diff. I AI Caco-2 Diff. I AI Caco-2 Diff. I AI Caco-2 Diff. I AI Caco-2 Diff. I

10 100 1000

SLC15A1 / PEPT1

10 100 1000

SLC22A1 / OCT1

10 100 1000

SLCO2B1 / OATP2B1

F-hiSIEC F-hiSIEC F-hiSIEC F-hiSIEC F-hiSIEC

10 100 1000

SLC5A1 / SGLT1

10 100 1000

TRPV6 / CaT1

1 10

AI Caco-2 Diff. I

1 10

AI Caco-2 Diff. I

1 10

AI Caco-2 F-hiSIECDiff. I F-hiSIEC

F-hiSIEC

1 10

AI Caco-2 F-hiSIECDiff. I 1 10

AI Caco-2 F-hiSIECDiff. I

・F-hiSIECは薬物動態予測に必要な主要な代謝酵素・トランスポーターを⽣体⼩腸同程度に発現していた。

3

（その他、排出トランスポーターのEfflux ratio、ロット間での安定性などは弊社HPをご参照ください）

(5)

Agenda

・薬物間相互作用（酵素誘導）評価系

・動態予測精度改善検討

(6)

Agenda

・薬物間相互作用（酵素誘導）評価系

・動態予測精度改善検討

5

(7)

薬物間相互作⽤（酵素誘導）の評価 –背景–

通常時酵素誘導時

医薬品A 医薬品A

通常時酵素誘導時

分解分解↑

医薬品

酵素誘導

⼩腸での酵素誘導例：

医薬品B

代謝酵素が誘導されると、医薬品が分解され、全⾝を循環する薬物量が減少

⼩腸での酵素誘導例：

F hiSIECを⽤いた酵素誘導の評価系を検討した

Rifampicin, Vitamin D3等の暴露 CYP3A4発現量の上昇

F-hiSIECを⽤いた酵素誘導の評価系を検討した

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酵素誘導の評価 –スケジュールと結果–

実験スケジュール実験スケジュル

遺伝⼦

RIF or VD3

発現評価

12 Culture Medium Assay Medium

4 6 8 10 12

induction of 3A4 mRNA

0 2 4

Vehicle 5 uM 10 uM 20 uM 1 nM 10 nM 100 nM

Fold i CYP 3

RIF VD3

・RIFにより2~5倍、VD3により3~10倍のCYP3A4 mRNA発現量の上昇が濃度依存的に⾒られた

→ CYP3A4の誘導を評価できるプロトコルを確⽴した

7 Induction of CYP3A4 mRNA expression levels in F-hiSIEC on cell culture insert. Differentiated cells were treated with 1α,25-

dihydroxyvitamin D3 (VD3) or rifampicin (RIF) for 48 hours at

terminal differentiation.

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酵素誘導の評価 –ヒト⽣体⼩腸との⽐較–

Drug Metab Dispos 46 1562 (2018) J Clin Invest 116 1703 (2006)

Toll-like receptor(TLR)の発現と応答

Drug Metab. Dispos. 46, 1562 (2018). J. Clin. Invest. 116, 1703 (2006).

ヒトにRIFを経⼝投与

→ 3~6倍程度の上昇 ヒト浮遊⼩腸細胞にRIF, VD3を暴露

→ 2~3倍程度の上昇

F hiSIECで⾒られたCYP3A4発現量の上昇率は既報のヒト⽣体⼩腸の結果と同

F-hiSIECで⾒られたCYP3A4発現量の上昇率は、既報のヒト⽣体⼩腸の結果と同

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酵素誘導の評価 –ロット間差の⽐較–

Induction of CYP3A4 mRNA expression levels in F-hiSIEC on cell culture insert Differentiated cells were

RIF 10 uM VD3 10 nM

Induction of CYP3A4 mRNA expression levels in F-hiSIEC on cell culture insert. Differentiated cells were treated with 1α,25-dihydroxyvitamin D3 (VD3) or rifampicin (RIF) for 48 hours at terminal differentiation.

6 7 8

A 4 mRNA

6 7 8

A 4 mRNA

4 5

n o f CYP3 A

4 5

n o f CYP3 A

1 2 3

d inductio n

1 2 3

d inductio n

0 1

F-hiSIEC Lot #1

F-hiSIEC Lot #2

F-hiSIEC Lot #3

Fol d

0 1

F-hiSIEC Lot #1

F-hiSIEC Lot #2

F-hiSIEC Lot #3

Fol d

RIFとVD3によるCYP3A4の誘導はロット間で安定していた

9

(11)

酵素誘導の評価 –まとめ–

✔ RIF, VD3によるCYP3A4の誘導を評価できるプロトコルを確⽴した

✔ F-hiSIECで⾒られたCYP3A4遺伝⼦発現の上昇率は、⽣体⼩腸と同程度で、あった

✔ F-hiSIECを⽤いたCYP3A4遺伝⼦発現の上昇率は、ロット間で安定していることが⽰された

ることが⽰された

(12)

Agenda

・薬物間相互作用（酵素誘導）評価系

・動態予測精度改善検討

11

(13)

F-hiSIECを⽤いた薬物透過性試験

100 n

Caco-2 (R ² **= 0.37) F-hiSIEC (R ² = 0.76)**

4 1 2

3 1

4 3 2

80

60 tin al absor p ti o n

80

60 tin al absor p ti o n

9 5

6 8 10

7

11 9 5

6 8 10

7 11

40

20 % hum a n i n te s

40

20 % hum a n i n te s

16 11 13 12

14

15 16 11

13 12 14

15

0 0.01 0.1 1 10 100

Papp (x10

^-6

cm/s) 0

0.01 0.1 1 10 100

Papp (x10

^-6

cm/s)

1 A i i 2 C ff i 3 C h l i 4 A b l l 5 Rib i i 6 M f i 7 H d hl hi id 8 I di i

Standard Transporter CYP3A4 Others

16 16

・F-hiSIECを⽤いた吸収評価モデルでは、標準化合物やトランスポーターの基質となる薬物の透過係数は

1.Antipyrine , 2.Caffeine, 3.Cephalexin, 4.Acebutolol, 5.Ribavirin, 6.Metformin, 7.Hydrochlorothiazide, 8.Indinavir, 9.Verapamil, 10.Enalapril, 11.Erythromycin, 12.Midazolam, 13.Sulpiride, 14.Lisinopril, 15.Tacrolimus, 16.Lucifer yellow.

*R

²

scores were determined exclude CYP3A4 substrates (9, 12 and 15).

Faとの相関が⾼かった。

・細胞あたりのCYP3A4活性は⽣体⼩腸同様にもかかわらず、CYP3A4の基質の予測精度は低かった。

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⽣体⼩腸とF-hiSIECの違い

F hiSIECの病理切⽚⽣体⼩腸の模式図 F-hiSIECの病理切⽚⽣体⼩腸の模式図

細胞は扁平で⾯積あたりの蛋⽩質量 柱上⽪細胞が密集並

50nm ≠

細胞は扁平で⾯積あたりの蛋⽩質量

（代謝酵素量）が少ない

円柱上⽪細胞が密集し並んでいる

仮説：F-hiSIECでは酵素量が少ないため、代謝酵素活性の寄与分がPappに反映していない？

仮説 F hiSIECでは酵素量が少ないため、代謝酵素活性の寄与分がPappに反映していない？

→F-hiSIECの分化誘導プロトコルを改良し、細胞の分化度（質）は変えずに、細胞密度を⾼めるような検討を⾏った。

⼤半の細胞が円柱上⽪様となる培養プロトコルの開発に成功した。

50nm 50nm

13 ⼤半の細胞が円柱上⽪様となる培養プロトコルの開発に成功した。

(15)

改良品の特徴

F‐hiSIEC 改良品

蛋白質量（ μg ） ^# 74 ± 8 292 ± 16 蛋質（ μg ）

代謝物 ( 水酸化ミダ

ゾラム（ pmol ） ) 11.7 ± 0.1 90.2 ± 3.7

p )

ミダゾラム Papp 43.0 ± 2.3 30.8 ± 2.6

ミダゾラム Papp ^n.s. * ^P<0.05

ミダゾラム Papp

＋ケトコナゾール 45.3 ± 2.0 35.2 ± 1.3

#

セルカルチャーインサート上の総タンパク質量

・改良品において、蛋⽩質量は4倍、代謝物（⽔酸化ミダゾラム）量は8倍に増加した。

実験条件ミダゾラム濃度

:10M

、時間：

1h

、培地：

HBSS

、ケトコナゾール濃度：

20M

・F-hiSIECではケトコナゾール（ CYP3A4阻害剤）処理でPappに有意な差は⾒られなかった

が、改良品ではケトコナゾール処理によってのPappが有意に増加した。

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まとめと今後の検討

改良品

100 p tion

改良品

≠ 80

60 nte st ina l a bs or p 40

⽣体⼩腸

≠

F‐hiSIEC

20

0

0.01 0.1 1 10 100

% huma n i

改良品

Papp (x10 ^-6 cm/s)

今回の改善でもまだ相関曲線とは乖離 ⽣体⼩腸では腸絨⽑で更に細胞の集積

・改良品では細胞組織としての代謝活性は向上したが、Pappに与える影響は限定的であった。

率を⾼めている。

・予測精度の⾼い動態モデルを構築するためには、細胞⼀つ⼀つの特性に加えて、組織構造も再現したい組 織に近づけて⾏くことが重要。引き続き検討を継続する。

第 35 回 本薬物動態学会年会 ヒトiPS 細胞由来腸管上 細胞 (F-hiSIEC TM ) の特性と吸収予測精度改善の検討 2020 年 12 1 富 フイルム株式会社美 伸治