Studies on biosynthesis system of magnetite in magnetic bacterium Magnetospirillum magnetotacticum MS-1

Studies on biosynthesis system of magnetite in magnetic bacterium Magnetospirillum

magnetotacticum MS‑1

著者 田岡 東

著者別名 Taoka, Azuma journal or

publication title

博士学位論文要旨 論文内容の要旨および論文審査 結果の要旨／金沢大学大学院自然科学研究科

volume 平成16年12月

page range 277‑282 year 2004‑12‑01

URL http://hdl.handle.net/2297/16633

氏名 生年月曰 本籍 学位の種類 学位記番号 学位授与の日付 学位授与の要件 学位授与の題目

田岡東

香川県 博士（理学）

博甲第６２４号 平成１６年３月２５曰

課程博士（学位規則第４条第１項）

ＳｔｕｄｉｅｓｏｎＢｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓＳｙｓｔｅｍｏｆＭａｇｎｅｔｉｔｅｉｎＭａｇｎｅｔｉｃ ＢａｃｔｅｒｉｕｍＭＺｇ"etoSPjγjﾉﾉ"沈沈cZg"emZzzcrjcz`腕ＭＳ－１

(磁性細菌Mzg"emSPjγjﾉﾉ"沈加g"cmtzzcjjc"”ＭＳ－１におけるマグネタ イト生合成経路に関する研究）

論文審査委員(主査）

論文審査委員(副査）

福森義宏 和田敬四郎 東浩

(理学部・教授）

(自然科学研究科・教授）

(理学部・助教授）金森

櫻井勝（理学部・教授）

正明（理学部・講師）

学位 ^{ニムロnｏ} 文要 ^］曰

ADsZFHzcr：IpurifiedthenitratereductasefromMZgｱzeZD叩かiJ肋川川昭肥ZDZZzcZi切川 MS-1・ＴｈｅｅｎｚｙｍｅｗａｓｃｏｍｐｏｓｅｄｏｆＳ６ｋＤａ－andl7kDa-subunitsandcontained lnolybdopteringuanmedinucleotidｅａｎｄｈｅｍｅｃａｓｃｏｆ豆ctors．Ｍ〃zcZg"eZDZZzcr允皿剛 胆p1ocuswasclusteledinsevenopenreadingfiPames，アzc1pFDAＧHBC・The phylogeneticanalysesofNapA,NapBandNapCsuggestedacloserelationshipbetween M川αg"eZomcZibm川7zcZpgenesandE､coJmcZpgenes,whichisnotconsistentwithtlle lGＳＩＤＮＡｄａｔａ・nrtllennore,IinvestigatedtheeffcctsofmolyMate-deficiencyintI1e mediumonthetotalironcontentsofthemagnetosomefiPaction・Theresultsuggested thattlleperiplasmicmtrate配ductaseactivityisnotessentialfbrmagnetitebiosynthesis inM〃zcZg"eMZzcr比"〃butnecessaryfbroptimumsynthesisofmagnetite・

Secondary,ItrieddevelopingthenlethodofthetargetedgenedisruptionfbrM '７zcZg肥ZDmcZicLd川．Ｂｒoad-host-rangeplasmidsofthelncPgroupweretransfbITedby coUjugationandreplicatedinthisbacte血mStudiesareunderwaytoconstructｏｆ

"叩genesdisruptionmutantofM〃Zag"eZmZzcriCzJ〃・

Hnally,Ifbundtllattwo蔚七siderophorereceptorswerelliglllyexpressedintlle

tlｌｅ恥2+richmediumTheseresultssuggestthattllebacteriatlBnsportandutilizeFe3＋

formagnetitesynthesisevenundertheFe2+richgrowthcondition

lntmduction

MZgMDSp腕ﾉﾉ川7MgMomcZic川MS-1wasisolatedfromthesedimentsofthe freshwaterswalnp［1]、Oneofthenovel化aturesofM川cZg"α伽cZic伽isthatthis

bacteriumsynthesizesintracellularparticles，telTnedmagnetosomes，whichare envelopedsinglecrystalsofmagnetitewitlllipidbilayers・

BazylinskiandBlakemoreinvestigatedtheoptinmngrowthconditionsfbr lnagnetiteproductionbyM川Czg"α○匁αｊｃ"剛andfbundthatthebacteriumproduces morelnagnetitesUnderlnicroaerobicconditionssupplementedwithnitrate，whichis finallyreducedtoN20(Ｍ)[Z]、Theyalsoreportedthatthebacteriumcannotgrow understIictanaerobicconditionswithnitrate[Z]．Therefbre,itseelnslikelythatthe bacteriumisanncroaerobicdenitlifier：theaerobicrespirationwithO2andthe anaerobicrespirationwitllnitrateasthefinalelectronacceptorsoccursimultaneouslyin

thecelLIhlrtllennore,Yanlazakietal・havereportedthatthMii-typemtlitereductase

isllighlyexpressedi、theperiplasmofthemagneticcellsofM〃zcZg"emmcr允肋zand showsanovelFe(11):nitliteoxidoreductaseactivity[3]・Theseresultssuggestthatthe denitlificationmayberequiredfbrmagnetitesynthesisinM川cZg"e〃〃αに"川．

However,tllerearecurrentlynoreportsontllechamcterizationandfimctionofother denitrifj/ingenzymesofjM7zag"抑伽加川．

M2BteriaIMndlMetllodS

M＃c"ｗ"淫umiSmsdzMgｱＤＷＵｿbcoJm蹴り〃

Ｍ〃２８"e加伽此醐wascultivatedinachemicallydeflnedliquidmedium[1]・

TheMo-deficientcellswerepreparedbycultivationwithtlleMo-deficientmetal

mixtureunderthesamegrowtllconditionsasdescribedabove・L4mMNH4C1was addedtothemediumasNsourcefbrthegrowthoflzcZpdeletionstrain・

ＥＳＣﾉｶ〃ｊｃ/DiZzco〃XL-1B1ueMRFwasusedfbrcloningStudies・E8coZiS17-1 nwasusedfbrtlledonorofdiparentalconjugationE・coJiHB101(pRKZO1S)mdE coJim1006wereusedashelperstrainanddonorstlainoftriparentalcomu弩ation

studies,respectively6E8co〃ｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｇｒｏｗｎａｔ３７ｏＣｕｎｄeraerobicconditionsin LuriaBertani(ＬＢ)medium[S]．

P噸/５Ｍ＃のｱDTFDimzZWwJbJcZUzse./、TOM・magnetotacticmm

Ｍ〃zcZg"emjZzcZ比皿川cellswe1℃brokenbytllreepassagesthroughtlleHench pressurecell（100MPa)．Aftertlleunbrokencellsandmagnetosomeswereremoved byacentIifilgationatlO,ＯＯＯｘｇｆｂｒｌＳｍｉｎ,thesupematantwasrecoveredandfnrther celltlifilgedatlW,ＯＯＯｘｇｆｂｒｌｈＴｈｅｎｉｔｒａｔｅ１℃ductasewaspurifIedfromtlle supematantbyanlonexcllange-，cationexcllange-andhydroxylapatite‐

chromatographies・

AmdZyげUIbeJUimUUwwJbUczUz8Mc虚U'iry

Thenitratereductaseactivitｙｗａｓａｓｓａｙｅｄｂｙｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆ氏mandezetaL withslightmodifications［6]・NitIiteconcentrationwasdetenninedbytlle diazocouplingprocedureofMcholasajldNason[刀．

OMaJwJ2w-dZHjDz伽jbPMJZDo卯呵肱"0雌9℃Z地cUmpjbo剛ｅｓＣＤＥ）

-278-

One-andtwo-dimensionalelectrophoreseswerepelfblmedaccordingto methodsofLaemmli[S]ａｎｄＯ，Farrell[9],respectively6

DezごnF8jjzOzz伽〃伽"〃"z②U航Mbe伽9Ｍ℃Ｍ『WiUzc耐i､〃

Thecellswerecolnpletelydisruptedwithasomcoscimator(20kHz,100Ｗ)．

ThelysatewascentrifilgedatS,OOOxgfbrZOInin・Theresultingpelletwasusedasthe crudemagnetosomefraction・Aftertheorganlccomponentsinthefractionwere

dilutedintodistilledanddeionizedwatemTheironconcentrationofresultingsolution

MUzzimgeweFfHP0e"た

ThematingexperimentswereconductedbythemethodsofSimonetaL［11］

anddeBruijnandRossbach[12]withsomemodifications．

ResultsandDiscussion

PePiPJUzsJUDiMjZmzw巴UJi8伽sea"α川α〃e伽肋qyJ8zIbesis

IpurifIedtheperiplasmicnitratereductase,thefirstenzymeofdenitrificatio､，

fromＭ〃zcZg"emZZzctjC"脚．TheenzymeshowsabsorptionpeaksatSS1,SZ1and419 nmintllereducedfbnnandwascompoSeClof別ｋＤａ－ａｎｄｌ７１ＫＤａ－ｐｌｏｔｅｉｎｓｏｎＳＤＳ－

肌ＧＥ,althouglltllel7kDa-proteinbandwaslesslnalkedlystainedwitllCoomassie

BrilliantB1ue（Ｈｇ・リH1rther，theenzymecontainedmolybdopteringuanme

dinucleotideandhenlecascomctors・

ＴｈｅＭ〃zcZg"αomajCzu川皿p1ocuswasclusteredinsevenopenreadingframes，

"ｃｐＦＤＡＧＨＢＣ・T11eorganizalionoftheM〃zcZg"eMZzcrjC皿加’zc2Pgeneclusteris exactlytllesaｍｅａｓｔｈａｔｏｆｔｈｅｇａｎⅡnasubclassofP7qorｅｏｂａｃＺｍＺｚａｓＥ・ＣＯ魔,whicllis notconsistentwitlltllephylogeneticanalysesofthel6SrDNAsequences[13landtlle cytochromecsequences［1判．ThephylogeneticanalysesofNapA,NapBandNapC suggestedacloserelationsllipbetweenM川αg〃〃ZZza妬"川〃ｃ２ＰｇｅｎｅｓａｎｄＥ・coJmcZp genes（Ｈｇ.ｚ)．Therefbre，ｔｈｅ皿ｐｇｅｎｅｃｌｕｓｔｅｒｏｆＭ〃Zag"eZDmc飾伽mightbe transfbrredbyhorizontalgenetransferwithinthebacterialcomnunity・RIrthemore，

twobindingsitesoftheputativetranscliptionalmctors,H1randNarL/NarEwelefbund inupstreamof〃cZpFregion

ninvestigatetllepllysiologicalfimctionoftlleperiplasmicnitratereductasein

M剛cZg"eZoZZzcZiC"川,IcultivatedtllebacteliumintlleabsenceofMoandcomparedtlle

nitratereductaseactivitiesofthecell-freeextractsandtlletotalironcontentsoftlle

…………。

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Fig.１SDS-HkGEofpurifledMmcqgPueわJZzc"Czum periplasmicnitrateI巳ductaseThegelsweIestainedwith

CoomassieBrilliantBlueR-2SO．

Fig.2．PhylogenetictI巳ｅｏｆｔｈｅＮａｐＡ、ECO〃ＤＭＳＯ だ｡uctaseUnsAwasdelinedasout-gToup．

crudemagnetosomefractionspreparedfromtheMo-deficientcellswiththoseofMO-・

suppIementedcellsofM〃zcZg"e〃ねα疋伽,resPectively6AsshowninHgure3A,the mtrate１℃ductaseactivityoftheMo-defIcientcellsofM〃zcZgMDZZzα加川wasalmost undetectable,wlliletlleironcontentsintllemagnetosomefractionswasabout判％of tllecontrolexpeliment・Theseresultsshowtllatthebacterialmagnetitescouldbe synthesizedintheabsenceoftllepeliplasmicmtratereductase・Neitllerofnitratenor

nitlitemightbeessentiallyrequiredfbrbiosyntllesisofmagnetiteincontrasttotI1e previouslyresultsHowev則itshouldbenotedtI1attU1ecytochromeczjiwashigllly expressedinthemolybdate-deficientcellｓ(Fig3B)．Therefb肥,tllebacteliumlnight utilizeoxygenasaltemativeelectronacceptorfbr圧(11)oxidationbycytochlomecz1iin thｅａｂｓｅｎｃｅｏｆＭｏ,becauseMWzag"eZDZZzc此川cytochromeaj,showsMMⅣ,,Ⅳ，‐

tetrametllyLp-phenylenedianmne-O2oxidoreductaseactivity[3]・

DeveU､pEI8卿TdzUUz聯ZMg巴ｱDMZmqp伽"伽鋤ＭＪｉｌ｢Ｍ・ｍａ=netotacticum

Atfirst,IestablishedthemethodfbrplasndtransfbrbyconjugationinM

"zCZg〃われα尤皿剛．ＴｈｅｔｗｏＲＫ２ｄｅｒｉｖａｔｉｖｅｐｌａｓｍｉｄｓｐＲＫ‘llSandpKSSOOwere

tmnsferredtorecipientstrain，Ｍ〃zcZg肥ZDZZzaた"川，bydiparetalandtriparetal co11jugations,respectively6Thisisthefirstreportonplasmidtransferbyconjugation

Secondlylltriedtlletargeteddisruptionof皿ｐＦＤＡＧｇｅｎｅｓｉｎＭ '、g〃ZDZZzcriCzd肌Thegenedisruptionplaslnid,namely,pKFZOS,wasconstructedand

transferredintoM’７zcZg肥ZDZZzaたzJ"z・nfbrcerecombination，substitutionplasmid，

pKSSO7,wasfmrthertransferTedintoresultanttransconjugant[１５】・Theoccurrencesof

recolnbinationeventswereverifiedbySouthernhyblidizationanalysis,suggestingthat therecombinationeventsoccurredbetweentlledismptionplasmidandgenomcDNA

-280-

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gmumhoon範ｏｎｓ

Ｆｉｇ３． （A）Comparisonoftheironcontentandnit『atereductaseactivitybetweenMo紅eficientcelIsandMo‐

拠画Q､苧dpellM且)Th色JifIb妃npespect[aomedUCedWithNaM4]minU§[Oxjd唾｡祠、韓ｂｊ)Jら応薊‐

嶢.TiPpLspppPにdfmmMo-supplementedcelIsandMMeficieiit~c§ils・The~画面己655hdii8h-感Hisﾗ6hiHFs

a耐butedtocytochlomec`,．

Howeverbtheculturewaslnixtureofwildtypecellsandsingleanddoublecrossover recombinantcells・NowlhavetliedisolationofdoUblecrossoverhomologues recombinantstrainfromthecultureofM伽g"α伽α蜘加（pKF205,pKS807）by

dilutiomnethod・

Up2UzlteTimJzzyM・ｍａ印etotacticumFelｱｾﾞｃ姉"〃cEPZDパー

Ibidentifj/theproteinsfbrmagnetitebiomineralization,IhaVecomparedtlle proteinprofileofthenon-magneticcellswiththａｔｏｆｔｈｅｍａｇｎｅｔｉｃｃｅｌｌｓｏｆＭ 川cZg〃〃ZZzcrjb"〃byZ-DEandfbundthattworbnB-dependentoutermembranereceptor holnologueswerehighlyexpressedinmagneticcells（Ｈｇ4)．nrthennore，tlle expressionsweree血ancedinFe2+richcondition・ThelcfblC,itseemslikelythatM 川629"eZDZZzcrjCm川transportsandutilizesre3+fbrmagnetitesyntllesisfiomthecultureby

thesereceptors・

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鱈ｋＤａ ： _s Fig42-DEpattemo｢theceIl-neeextI己cts pl巴paI己dliomthemagneticcellso「Ｍ Ｐｍｇ"elDmcliCzdm・TheciIcIedpYoteinswe尼 magneticcellsspecincfelTic-sidemphoに

．、.｡ｒ_で receptorhomologUes．

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pH

IpurifiedtheperiplasmicnitratereductaseandcharacterizedtllelzcZpフlocus、

Molybdemlmstarvationexpelilnentsuggestedtllatthenitratereductaseactivityisnot

essentialfbrmagnetitebiosynthesisinM'72629"emzzza比"胴butnecessaryfbropti]【num

synthesisofmagnetite・Ｈ１】【tIhe]【more，Itlieddevelopingtl｡ｌｅｍｅ[hodoftlletargeted

genedisruptionfbrMWzcZg'zeZomcrjb"川．HnallybIcomparedtlleproteinprofileofthe non-magneticcellswiththatofthemagneticcellsandfbundthattwoTbnB-dependent outermembranereceptorhomologueswerehighlyexpressedinmagneticcells，

suggestingthatMWzcZg〃MZzajC"川transportsFe3+fbrmagnetitesynthesis．

Ｒｅｆｍｍｃｅｓ

［1]JBacteliol.(1Ｗ9)140:720-729．

［2】APPI・Envilon・Miclobiol.(1983)妬:1118-1124．

旧]Ｅｕ正JBiochem.(１９９５)233:665-671．

ｎＢｉｏ/Technology(1983)１:784-791．

nMolecularqoning,AlaboIatoWmanual(1989)．

nAnal・Biochem.(1982)120:85-90．

［刀MethodsEnzymol.(1957)３:981-984．

［8]Natule(1ＷO)227:680-685.

[,]J､Biol,Che、(ｐ75)250:4007-4021．

[10]ChemisMnalyst(1963)鬼:88-94．

[11]MethodsEnzymol.(1986)118:640-659．

[12]Methodsfbrgeneralandmolecularbacteriology

（1994)387-405．

[13]J・SystemBacteliol(1＄l)４１:324=3西．

[14]ＡＩｃｈ・MicrObioL(1995)１＄:400-406．

[1ｺPIantCenPhysiol.(2002)43:1ｓ即2-15ｓ7．

学位論文審査結果の要旨

本論文は､磁性細菌肱沈CZg"etomcrjc"”の脱窒系の開始酵素であるペリプラズム型硝酸塩還元酵素(Ｎａp）

の生化学的,性質と遺伝子塩基配列を解明するとともに、本酵素の発現制御機構および分子進化を考察するこ とにより、磁気微粒子生合成機構と脱窒経路との関わりを明らかにし、さらに磁気微粒子生合成に関与する 新規蛋白質を同定した論文である。

肱沈(Zg"cmZZzcrjc""のＮａｐを精製し、本酵素が２種類のサブユニットで構成され、補欠分子族としてモ リブデンコファクター、鉄硫黄クラスター、ヘムｃを持つ事を明らかにした。さらに、その遺伝子塩基配列 から、本酵素が〃(ZPFDAGHBCgeneclusterにコードされていること、転写因子ＦＮＲとNarL/Ｐにより発 現制御きれることを明らかにした。また、ＮａｐＡ,ＮａｐＢＮａｐＣアミノ酸配列による系統解析により、本細菌 の〃cZP遺伝子群はuproteobacteriaの〃⑰遺伝子群の水平伝搬によることを示唆した。一方、これまで同 定されていない磁気微粒子生合成に関与する蛋白質として２種類のＦｅ（、)-siderophoreレセプターを同 定し、本細菌が磁気微粒子生合成にためＦｅ（、）を積極的に取り込んでいることを示唆した。

以上、本研究により、磁性細菌肌沈cZgMomcjjc"”のマグネタイト合成に関して、多くのことを明らか にし、それらの知見は当該分野の研究発展に大いに寄与するものと考えられる。従って、審査委員会は、本 論文が博士論文として妥当であると判断した。

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