本日の内容 sirnaの基礎 sirnaのワークフロー RNAiの原理オフターゲット効果 sirna 実験の成功の秘訣 sirnaを低濃度で使う化学修飾 sirna を使う高効率なトランスフェクションを行う複数のsiRNAを個別に使う Single sirnas vs. sirna Pools Si

(1)

はじめよう

siRNA

実験

オフ

オフターゲット

ターゲット

ターゲット効果

効果

効果を

を

を抑

を

抑

抑えた

抑

えた

The world leader in serving science

オフ

オフターゲット

ターゲット

ターゲット効果

効果

効果を

を

を抑

を

抑

抑えた

抑

えた

正確

正確な

な

な機能解析

機能解析

機能解析で

で

で、

で

、

RNAi

実験

実験を

を

を成功

成功

成功させる

させる

2014年11月14日（金）ライフテクノロジーズジャパン株式会社サーモフィッシャーサイエンティフィックグループ

(2)

本日の内容

siRNAの基礎 siRNAのワークフロー RNAiの原理オフターゲット効果 siRNA実験の成功の秘訣 siRNAを低濃度で使う化学修飾siRNAを使う化学修飾siRNAを使う高効率なトランスフェクションを行う複数のsiRNAを個別に使う

Single siRNAs vs. siRNA Pools

Silencer Select siRNA

Silencer Select siRNAの特徴 Silencer Select siRNA Library

(3)

RNAi

実験のワークフロー

siRNA

の

の設計

設計

設計・

設計

・・

・合成

合成

siRNA

の

の導入

導入

ノックダウンの

評価

評価・

・・

・解析

解析

•設計済みsiRNAを検索・合成または •アクセッション番号等をもとに設計 •最適な導入方法を検討 •Negative control •Positive control(GAPDH等) •蛍光修飾siRNA •目的のsiRNA •導入後の培養時間 •mRNAレベル：24～48時間 •タンパク質レベル：24～72時間 •mRNAの解析(qPCR等) •タンパク質解析（ウエスタンブロット等） •表現系解析（顕微鏡解析等） • 18s neg1 surv Protein Knockdown GAPDH Survivin mRNA Knockdown トランスフェクション試薬 siRNA 細胞専用Webサイトにて検索

(4)

RNAi

のメカニズム

細胞内細胞内細胞内細胞内ではではではでは内在性内在性内在性の内在性のののmiRNAととと同様と同様の同様同様ののの経路経路経路で経路で作用でで作用作用する作用するするする siRNA：：：： _{mRNAと100%の相同性を持ち、mRNAを分解することで} 標的遺伝子をノックダウンする。

RNA interference：：：： RNA干渉干渉干渉干渉

2本鎖RNA分子(dsRNA)を細胞や生体に導入し、導入したdsRNAとホモロジーを持つmRNAを特異

的に分解することで発現が抑制される現象 dsRNA 標的遺伝子をノックダウンする。 miRNA ：_{一般にmRNA配列と一部ミスマッチがあり、mRNAの分} 解ではなく翻訳を抑制することで遺伝子をノックダウンする。 siRNA miRNA

(5)

siRNAとshRNAの違い

siRNAs • 合成オリゴ • デザインの自由度が高くノックダウン効率が高い • 標的以外のノックダウンを最小限にする化学修飾が可能 shRNA(short hairpin shRNA(short hairpin RNA) • ウイルスまたはプラスミドから作られる • デザインの自由度が低い • 長期間のノックダウン • 発現量を制御できず標的以外のノックダウンが多い

(6)

siRNA

の一般的な構造

・二本鎖の核酸・19 塩基の RNA + TT (DNA) = 21 塩基・2 塩基 (TT) だけ末端が突出・アンチセンス鎖は標的 mRNA と完全に相補的

T T G C U A U U A U C U A A U C U A G G G

G C U A U U A U C U A A U C U A G G G

C G A U A A U A G A U U A G A U C C C

T T

←センス鎖 ←アンチセンス鎖

siRNA

- - - U G C G U A

G C U A U U A U C U A A U C U A G G G

C U G A U U

-標的 mRNA

T T G C U A U U A U C U A A U C U A G G G

G C U A U U A U C U A A U C U A G G G

←センス鎖

C G A U A A U A G A U U A G A U C C C

T T

←アンチセンス鎖 RISC

標的

mRNA

の分解

(7)

siRNA

オフターゲット

オフターゲット効果

効果

効果とは

とは

標的遺伝子以外の遺伝子に対して非特異的にRNAi効果を示してしまう現象オフターゲットオフターゲットオフターゲットオフターゲット効果効果効果効果目的目的目的目的ののののRNAi アンチセンスアンチセンスアンチセンスアンチセンス鎖鎖鎖鎖目的遺伝子のノックダウン siRNA導入導入による導入導入によるによるによる非特異的非特異的非特異的非特異的なななな免疫応答免疫応答免疫応答免疫応答やややや細胞毒性細胞毒性細胞毒性細胞毒性センスセンスセンスセンス鎖鎖鎖による鎖によるによる非特異的による非特異的非特異的非特異的なななな抑制抑制抑制抑制アンチセンスアンチセンスアンチセンスアンチセンス鎖鎖鎖鎖とととと相補性相補性を相補性相補性ををを有有有有するするするする遺伝子遺伝子遺伝子遺伝子をををを非特異的非特異的非特異的非特異的にににに抑制抑制抑制抑制センスセンスセンスセンス鎖鎖鎖鎖アンチセンスアンチセンスアンチセンスアンチセンス鎖鎖鎖鎖目的遺伝子のノックダウン

(8)

siRNA

実験の成功の秘訣

siRNA

を

を低濃度

を

低濃度

低濃度で

で使

で

使

使う

う

化学修飾

_siRNA

を

を使

使

使う

う

標的遺伝子

標的遺伝子のノックダウンを

のノックダウンを

のノックダウンを最大化

のノックダウンを

最大化

最大化し

し

し、

し

、

、オフターゲット

、

オフターゲット効果

オフターゲット

効果

効果を

効果

を

を最小化

を

最小化

最小化すべし

最小化

すべし

そのための実験のポイント

化学修飾

_siRNA

を

を使

使

使う

う

高効率

高効率なトランスフェクションを

なトランスフェクションを

なトランスフェクションを行

なトランスフェクションを

行

行う

行

う

二種以上

二種以上の

の

siRNA

で

で個別

個別

個別に

個別

に実験

に

実験

実験を

実験

を

を行

行

行う

う

(9)

ポイント①

_siRNA

を低濃度で使用する

siRNA

を

を低濃度

低濃度

低濃度で

低濃度

で

で用

で

用

用いることで

いることで、

いることで

、

、オフターゲット

オフターゲット

オフターゲット効果

効果を

効果

を

を抑制

抑制

(10)

センス鎖アンチセンス鎖 RISC 化学修飾化学修飾化学修飾化学修飾

ポイント② 化学修飾

_siRNA

を使用する

アンチセンス鎖標的miRNAをノックダウン RISC センス鎖標的以外のmiRNAをノックダウンオフターゲットの主要因となる RISC

センス

センス鎖

鎖

鎖を

を

を化学修飾

を

化学修飾により

化学修飾

により

により非活性化

非活性化

非活性化することで

することで、

することで

、

、センス

センス

センス鎖

鎖

鎖が

が

がRISCに

に

取

取り

り

り込

込

込まれるのを

まれるのを防

まれるのを

防

防ぐことが

防

ぐことが

ぐことが可能

可能

(11)

80% reduction

ポイント② 化学修飾

_siRNA

を使用する

化学修飾化学修飾化学修飾化学修飾によりによりによりにより、、、オフターゲットは、オフターゲットはオフターゲットは大オフターゲットは大きく大大きくきくきく減少減少減少減少するするするする。。。。 Base O O O O LNA® 2-fold changes p<0.001 化学修飾なし化学修飾あり（LNA）

LNA修飾したsiRNA（Silencer ® _Select_）と_LNA_{修飾なしの}_siRNA_{のオフターゲットの比較。}

siRNA導入後に増加もしくは減少したmRNAの数をマイクロアレイ（Affymetrix U133 2.0 Plus genechip）で解析した。

(12)

ポイント③ 高効率なトランスフェクションを行う

接着系細胞株幹細胞

初代細胞浮遊系細胞

エレクトロポレーション

Neon® _{Transfection System}

細胞に合わせた最適なトランスフェクション手法を選択する •試薬での導入が困難だった細胞に使用 •浮遊系細胞に適している siRNA専用トランスフェクション試薬 Lipofectamine® _RNAiMAX プラスミド、siRNA共通トランスフェクション試薬 Lipofectamine® ₃₀₀₀ •siRNA導入の第一選択肢としておすすめ •簡便かつ低コスト •siRNAとプラスミドのコトランスフェクションが可能

(13)

正確正確正確

正確なななな導入効率導入効率導入効率導入効率のののの確認方法確認方法確認方法確認方法

Positive control siRNA（例：GAPDH）を導入し、mRNAレベルでの抑制効果を確認する →高精度なTaqManがおすすめ 70%以上のノックダウン蛍光標識したsiRNAを導入して、導入された細胞をカウントする

ポイント③ 高効率なトランスフェクションを行う

= 80%以上の導入効率 Alexa555蛍光修飾siRNAの導入

BLOCK-iT™ Alexa Fluor® RedFluorescent Control

(14)

生存率生存率生存率

生存率のののの確認方法確認方法確認方法確認方法

• 未処理細胞

• Negative control siRNA 導入細胞

• 導入試薬のみ生存率生存率生存率生存率がが最低がが最低最低最低でもでもでもでも７０７０％７０７０％％％以上以上以上以上であるかをチェックであるかをチェックであるかをチェックであるかをチェック

ポイント③ 高効率なトランスフェクションを行う

トリパンブルー染色により生存率のチェック生存率生存率生存率生存率がが最低がが最低最低最低でもでもでもでも７０７０％７０７０％％％以上以上以上以上であるかをチェックであるかをチェックであるかをチェックであるかをチェックトリパンブルー

(15)

ポイント④ 複数の

_siRNA

で実験する

AAAAAAAAAAAAA ターゲット mRNA siRNA #1 siRNA #2 RISC RISC mRNA の異異異異なるなるなるなる位置位置位置位置ににに設定に設定された設定設定されたされたされた siRNA を用いて個別個別個別個別ににににノックダウン実験を行い、複数の siRNA で同じ結果が得られることを確認する論文では同一遺伝子に対する複数の siRNA での確認を要求されることがある。 →二つ以上の siRNA でオフターゲット効果のフェノタイプが一致する可能性は非常に低いため、複数の siRNA で同一のフェノタイプが得られた場合はターゲットのノックダウンによる効果と考えられる。

(16)

Single siRNAs vs. siRNA Pools

検証方法 mRNAレベルでの抑制結果

siRNAは1種類ずつ単独で導入(Single法) すべきか、複数のsiRNAをミックスし

た状態で導入(Pool法)すべきか

アポトーシスアッセイ

(17)

Positive phenotype:

Single siRNAs vs. siRNA Pools

アポトーシス関連の遺伝子をスクリーニングした例

Negative control siRNAを導入した場

合より- 2SD以下の値を示したもの Phenotype変化変化変化変化のののの確認確認確認確認：：：： 3種類の異なるsiRNAのうち2種類の siRNAによって同様なphenotypeの変化が誘導された場合、siRNAの導入によって誘導されたphenotypeとする

(18)

Single siRNAs vs. siRNA Pools

アポトーシスアッセイ • 同一ターゲットのsiRNAであっても異なるphenotypeの変化を誘導する場合がある • mRNAレベルでの抑制が得られても目的とするphenotypeの変化を誘導できない場合がある • Pool法を用いると正しいphenotype誘導が行われないケースが多い

オフターゲット

オフターゲット効果による影響

(19)

False positiveのリスクを最小限にするために、同一ターゲットの複数のsiRNAを単独で

使用し、同じphenotypeとなることを確認する必要がある

Single siRNAs vs. siRNA Pools

(23)

Mismatch Filter

Silencer

®

_Select

Toxicity Classifier

Natural miRNA

Silencer

®

Select siRNA

特異性を高めるためのフィルタリング

Natural miRNA

Seed Region Filter

Antiviral Response

Motif Filter

siRNA Seed

Region Ranking

Selection of hyperfunctional siRNA with improved

potency and specificity.

(24)

Multiple rounds of selection, 40+ formats evaluated

Hundreds of siRNA tested

Silencer

®

Select siRNA

最適な化学修飾パターンの探索

New Chemistry Pattern Modification Potency testing Microarray

Silencer® Select siRNA

B O O O O LN A® Potency testing Strand bias Cell assay Microarray Phenotypic assays Toxicity

(25)

Silencer® Select Library

Protease Kinases (710) Phosphotase (298) Nuclear Hormones (47) Ion Channels

通常のチューブ製品以外に、スクリーニングにはsiRNAを96 wellまたは384 wellプレートに

スポットしたプレートタイプが便利です。下の既製品以外に任意のsiRNAを選べるカスタムラ

イブラリも可能です。

Human Genome Collection (21,585) Extended Druggable Genome (10,415) Extended Druggable Genome (10,415)

Druggable Genome (9,032) Druggable Genome (9,032) GPCR (380) Protease (494) Ion Channels (338)

(26)

まとめ

siRNA

の

の設計

設計

設計・

設計

・・

・合成

合成

siRNA

の

の導入

導入

ノックダウンの

評価

評価・

・・

・解析

解析

•導入後の培養時間 •mRNAレベル：24～48時間 •タンパク質レベル：24～72時間 •mRNAの解析(qPCR等) •タンパク質解析（ウエスタンブロット等） •表現系解析（顕微鏡解析等） •最適な導入方法を検討 •Negative control •Positive control(GAPDH等) •蛍光修飾siRNA •目的のsiRNA •Single法で複数のsiRNAを使用 •設計済みsiRNAを検索・合成または •アクセッション番号等をもとに設計 •同一遺伝子に対し複数設計 • •優れたデザインアルゴリズムの化学修飾siRNA

Silencer® _{Select siRNA}

•Single法で複数のsiRNAを使用 •第一選択肢： siRNA専用トランスフェクション試薬 Lipofectamine® _RNAiMAX •第二選択肢：エレクトロポレーション

Neon® _{Transfection System}

•正確なmRNA定量