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プレスリリース
平成
26 年 6 月 16 日
農 研 機 構
農業生物資源研究所
麻 布 大 学
世界初、ガラス化保存未成熟卵子から子ブタを生産
ポイント
・ガラス化保存
１）ブタ未成熟卵子
２）の加温温度の最適化により、加温後の
卵子の生存率が 20％向上し、胚盤胞期
３）への発生率が 1.6 倍に向上しま
す。
・この手法で、世界初のガラス化保存卵子由来の子ブタを生産しました。
・卵子による保存が可能となったことから、ブタ遺伝資源の安定的な保存
につながります。
1) 凍結防止剤とともに急速冷却する卵子の超低温保存法（詳細は 4 ページ参照） 2) 成熟前で受精する能力を持たない卵子（詳細は 4 ページ参照） 3) 受精卵の発生段階のひとつ（詳細は 4 ページ参照）概要
１．農研機構 畜産草地研究所・動物衛生研究所と農業生物資源研究所、麻布大学は、ガラ ス化保存ブタ未成熟卵子の加温温度の最適化（加温時の加温プレートの設定温度を従来 の 38 度から 42 度に高める）により、加温後の卵子の生存率が従来法に比べて 67％か ら 87％に向上することを明らかにしました（表 1）。 ２．42 度の設定温度でガラス化保存卵子を加温し、39 度の培養器内で体外成熟・受精・培 養した場合に、胚盤胞期への発生率が、加温時の設定温度が 38 度の場合に比べ 2.7％ から 4.4％へ有意に高くなり、移植４）可能な多数の胚を生産することが可能となりまし た（表１）。 ３．これまでにガラス化保存未成熟卵子からの子ブタ生産は成功していませんでしたが、 本手法で得られた胚盤胞期胚の移植により、世界初のガラス化保存卵子由来子ブタを 生産しました（図１）。 ４．これらの成果により、精子とともに卵子を細胞レベルで遺伝資源として保存すること で生体に比べはるかに効率的で省スペースかつ防疫上のリスクが少ない保存が可能と なり、より多くのブタ遺伝資源を保存でき、育種改良の上でも育種素材の選択の幅が 広がるなどの大きなメリットをもたらします。 予算：運営費交付金問い合わせ先など
研究推進責任者：農研機構畜産草地研究所 所長 土肥宏志 研究担当者：農研機構畜産草地研究所 家畜育種繁殖研究領域 主任研究員 ソムファイ タマス TEL 029-838-8637 研究担当者：農研機構動物衛生研究所 病態研究領域 上席研究員 吉岡耕治 研究担当者：農業生物資源研究所 動物科学研究領域 上級研究員 菊地和弘 研究担当者：麻布大学 獣医学部 動物繁殖学研究室 教授 柏崎直巳 広報担当者：農研機構畜産草地研究所 企画管理部 情報広報課長 新谷成正 TEL 029-838-8611 FAX 029-838-8628 本資料は筑波研究学園都市記者会、農政クラブ、農林記者会、農業技術クラブに配付しています。 ※農研機構（のうけんきこう）は、独立行政法人 農業・食品産業技術総合研究機構のコミュニケーションネーム（通称）です。 新聞、TV 等の報道でも当機構の名称としては「農研機構」のご使用をお願い申し上げます。3
研究の社会的背景
生物の遺伝的多様性を維持することは、将来農産物や医薬品、地球環境保護に活用でき る素材を確保するために重要であり、家畜についても生体あるいは細胞での遺伝資源の保 存が行われています。特に、精子、卵子、胚といった細胞レベルでの保存は、生体に比べ はるかに効率的で省スペースで防疫上もリスクの少ないことから、より多くの遺伝資源を 保存できます。また育種改良の上でも育種素材の選択の幅が広がるなどの大きなメリット をもたらします。しかし家畜では、精子・卵子及び胚の凍結あるいはガラス化による超低 温保存が可能なのはウシのみです。一方、ブタは他の家畜に比べ特に生殖細胞の超低温保 存が難しく、これまでは、凍結精子により雄の遺伝資源を保存してきました。最近になっ て、ブタ胚のガラス化による超低温保存が可能となってきていますが、ブタ卵子は低温傷 害を受けやすいため超低温保存による雌の遺伝資源の保存やガラス化保存卵子からの子ブ タの生産は成功していませんでした。研究の経緯
ガラス化保存した卵子の加温後の生存率や発生能が低く、移植可能胚の生産数が少ない こともガラス化保存卵子由来の子ブタが得られていない原因のひとつと考えられています。 未成熟の卵核胞期の卵子をガラス化保存することにより、成熟卵子をガラス化保存するよ りも正常胚への発生率が高まることをこれまでに報告しましたが、ガラス化保存した未成 熟卵子の加温後の生存率が低いという問題が残されていました(Somfai et al., 2012)。そこ で、加温後の卵子の生存性を向上させる加温条件を明らかにすることにより、多数の移植 可能胚を作製・移植することが可能となり、世界初の子ブタの生産に成功しました。研究の内容・意義
１．固体表面ガラス化法５）によりガラス化保存したブタ未成熟卵子を加温プレート上に設 置した2.5mL の加温用培養液を用いて加温します。加温プレートの設定温度を従来の 38 度から 42 度に高めることにより、培養液の温度を 35 度以上に保つことができ、従 来法に比べて67％から 87％にガラス化保存・加温後の卵子の生存率が向上します（表 １）。 ２．42 度の設定温度で加温したガラス化保存卵子を、39 度の培養器内で体外成熟・受精・ 培養した場合に、ガラス化保存卵子数に対する胚盤胞期への発生率が、加温時の設定 温度が 38 度の場合に比べ2.7%から 4.4%へ有意に高くなり、より多くの移植可能胚を 生産することが可能となります（表１）。 ３．この手法で得られた培養５日目（体外受精日を０日）の高品質な胚盤胞期胚を外科的 移植することにより、世界で初めてガラス化保存卵子由来の子ブタを生産することに 成功しました（表２, 図１）。今後の予定・期待
１. ガラス化保存未成熟卵子からの子ブタ生産が可能であることを証明したことから、ブタ 卵子による遺伝子資源保存のための有用な情報となります。２．精子・卵子などの細胞レベルで遺伝子資源を保存することにより、生体に比べはるか に効率的で省スペースかつ防疫上のリスクが少ない保存が可能となり、より多くのブ タ遺伝資源を保存できます。これにより、育種改良の上でも育種素材の選択の幅が広 がるなど、育種への貢献などの大きなメリットをもたらします。 ３．ブタ未成熟卵子のガラス化保存法は、短時間に多数の卵子（ガラス化時：300 個／90 分、加温時900 個／90 分の卵子）を操作可能です。 ４．胚盤胞期への発生率が低いことから、ガラス化保存法や培養法のさらなる改良が必要 です。
発表論文
Tamas Somfai, Koji Yoshioka, Fuminori Tanihara, Hiroyuki Kaneko, Junko
Noguchi, Naomi Kashiwazaki, Takashi Nagai and Kazuhiro Kikuchi.
Generation of live piglets from cryopreserved oocytes for the first time using
a defined system for in vitro embryo production.
PLOS ONE (DOI:10.1371/journal.pone.0097731 ).
用語の解説
１）ガラス化保存： 高濃度の凍結防御剤（エチレングリコール、プロピレングリコールなど）を含むガラス 化液を用いて、室温域から液体窒素温度域（-196 度)に急速に冷却することにより、氷晶（氷 の結晶）を形成させずに、細胞内外ともにガラス化状態（結晶化せずに液体の粘性が高く なっていき、そのまま固体となること）とする超低温保存法です。使用するときには、加 温することにより液体状態に戻します。ここでは、氷晶形成していないガラス化状態から 液体に戻すことから融解ではなく加温という表現を使用しています。 ２）未成熟卵子： 未成熟卵子は受精能を持たない成熟前の卵子です。未成熟卵子は、体外成熟培養を行う ことにより減数分裂を再開し、第 1 極体を放出し、受精能を持つ成熟卵子（減数分裂第２ 分裂中期）となります。 ３）胚盤胞 哺乳類の初期発生で、受精後に細胞分裂を繰り返し、将来こどもになる内部細胞塊細胞 と胎盤などになる栄養膜細胞に分化した胞状の胚（受精卵）をいいます。 ４）移植（胚移植あるいは受精卵移植）： 提供動物から回収した胚（受精卵）や体外受精卵を受胚動物の子宮に移植し、借り腹に より胎子を育てて、動物個体を生産する技術です。 ５）固体表面ガラス化法： 液体窒素に浮かせたアルミホイル上に卵子を含む２～３マイクロリットルのガラス化液 を滴下し、超急速冷却してガラス化する方法です。5 表１ ガラス化保存未成熟卵子の加温時の加温プレートの設定温度が培養液の温度、 成熟培養 44 時間後の卵子の生存率および胚盤胞期への発生率に及ぼす影響 処置 加温プ レート の設定 温度 加温時の培養 液の最低温度 (度) 生存率 （ガラス化保 存卵子数に対 する生存卵子 の割合%） 胚盤胞期への 発生率 （培養7 日目 での生存卵子 数に対する割 合%） 胚盤胞期への 発生率 （培養7 日目 でのガラス化 保存卵子数に 対する割 合% ） 対照区 (ガラス化無し) – – 99.7 17.9 17.8 ガラス化区 38 度 31.7 度 66.9 4.6 2.7 ガラス化区 42 度 35.1 度 87.1 5.2 4.4 体外受精日を培養０日とした 表２ ガラス化保存未成熟卵子から得た体外受精胚の移植による子ブタの生産 受胚ブタ 移植胚数 妊娠 在胎日数 （日） 産子数 （生 存産子数） 性別 生時体重（kg） #1 16 + 115 4 (4) ♂: 2 / ♀: 2 1.5 #2 27 + 114 6 (6) ♂: 3 / ♀: 3 1.52 #3 17 + 117 5 (5) ♂: 3 / ♀: 2 1.34 #4 13 + 115 3 (3) ♂: 2 / ♀: 1 1.37 計 73 18 (18) ♂: 10 / ♀: 8 図１．世界初のガラス化保存卵子由来子ブタ（生後５日目）
