Title
Hepatocyte growth factor gene transfer into the liver via the portal
vein using electroporation attenuates the rat liver cirrhosis( 内容
の要旨(Summary) )
Author(s)
松野, 幸博
Report No.(Doctoral
Degree)
博士（医学）甲 第551号
Issue Date
2003-07-16
Type
博士論文
Version
URL
http://hdl.handle.net/20.500.12099/14575
※この資料の著作権は、各資料の著者・学協会・出版社等に帰属します。
氏 名(本籍) 学位の種類 学位授与番号 学位授与日付 学位授与の要件 学位論文題目 審 査 委 員 松 野 幸 博(岐阜県) 博 士(医学) 甲第 551 号 平成15 年 7 月16 日 学位規則第4条第1項該当
Hepatocyte growth factor gene transferinto theliver via the portaI Vein uslng electroporation attenuates the rat[iver cirrhosis
(主査)教授 藤 原 久 義 (副査)教授 高 見 剛 助教授 高 木 寿 人 論文内容の要旨 背景と目的 近年,肝臓への遺伝子導入法としてウイルスベクター法あるいは非ウイルスベクター法に関してさまざまな報 告がなされているが,副作用や導入効率の問題が残されている｡本研究ではより効率的な遺伝子導入法の開発を 目的として,ラット肝に対し経門脈的DNA投与によるエレクトロボレーション法(以下,EP)を検討した｡また, これまでに肝障害の終末状態の1つである肝硬変を治療対象としてHepatocyteGroふthFactor(以下,HGF)を 用いた報告には,HGFタンパクの全身投与あるいはHVJリポソームの骨格筋内注入がなされている｡本研究で は上記方法を用いて,肝臓局所へのHGF遺伝子導入を行うことにより肝硬変の抑制が可能であるか否かを検討 した｡ 材料と方法 動物は6週齢(160-180g)のSprague-Dawley雄性ラットを用いた｡麻酔後,開腹し肝臓および門脈を露出した｡ 横隔膜下肝上部下大静脈を血管クリップで遮断後,生理食塩水に溶解し総量1mlとしたGFP遺伝子(100FLg,500 FLg)を門脈より約30秒で注入した｡コントロールとしてPBSを用いた｡注入直後に肝中葉を平板型電極(￠10mm) で挟みEPを施行した｡EP条件は,電圧40V,電流負荷時間50ms,パルス回数6回とした｡EP施行後,血管ク リップを解除し閉腹した｡この操作を加えたラットを用いて以下の検討を行った｡ 1.上記操作後3日目にラットを犠死させ肝臓を摘出し,蛍光顕微鏡下でGFP発現を観察した｡ 2.EPに伴う肝組織障害を検討するために,EP施行後1,3,7日目の肝臓を摘出し,HE染色を行った｡同時に血 清ASTおよびALTを測定した｡ 3.同方法を用いてHGF遺伝子(100pg,500FLg)を導入し,3日後の肝組織内および血清中のHGF発現量を ELISAにて測定した｡
4.ラット麻硬変モデルは,1%Dimethylnitrosamine(DMN)水溶液100mg/kgを過3回連続,4-6週間腹腔内投
与を行い作成した｡DMN投与開始から3週間後に上記同方法を用いてHGF遺伝子(500FLg)を導入した群 (Group3),無処置群(Groupl),PBS投与群(コントロール群:Group2)とし,生存率を検討した｡またDMN 投与開始から5週間後の肝臓を用いてHEおよびAzan染色による組織学的検討を行った｡Azan染色標本はNIH Imageを用い,t肝線維化率を算出した｡ 結果 1.肝臓におけるGFP発現の検討 GFP遺伝子導入3日後の蛍光顕微鏡下での発現は,GFP500FLg投与群(n=5)では100FLg投与群(n=5)に比べ高 度であった｡一方,コントロール群(PBS投与群;n=5)では発現は認められなかった｡これらの発現は,導入後 24時間から認め,3日目に最大となり21日目まで確認された｡また,EP非施行部位にも僅かな発現を認めた｡ 2.エレクトロボレーションに伴う肝組織障害の検討 EP施行後1,3日目ではEP施行部位に軽度の肝細胞障害および炎症細胞浸潤を認めたが,7日目には軽減した｡ 一方,EP非施行部位ではこれらの所見は認められなかった｡また,EP施行後1日目に血清AST(n=5;339.8± 17.9U/1)およびALT(n=5;100.2±8.7U/1)の一過性の上昇を認めたが,7日目には正常レベルまで回復した｡ 3.HGF発現量の検討 HGF遺伝子導入3日後のEP施行部位の肝組織中では,HGF500〟g投与群(n=5;1.94±1.38ng/ml)においてPBS投与群(n=5;0.06±0.02ng/ml)およびHGFlOOfLg投与群(n=5;0･11享0･02ng/ml)に比べ,有意なHGF発
現を認めた(p<0.05)｡また,血清HGFレベルは100FLgおよび500FLg投与群ともに有意な増加を認めなかった○一方,EP非施行部位の肝組織中ではHGF500FLg投与群でわずかに発現を認めた(n=5;0.13±0.04ng/ml)｡ 4.肝硬変ラットに対するHGF遺伝子導入効果に関する検討 生存率: 無処置群(Groupl;n=6)およびPBS投与群(Group2;n=5)はDMN投与開始後41日目までに全例死亡した(平均生 存期間:Groupl;36日,Group2;34日)｡一方,HGF500FLg投与群(Group3;n=6)は全例が50日以上生存し た(p<0.01)｡ 組織学的検討: DMN投与開始から5週間後では,無処置群およびPBS投与群ともに偽結節とグリソン鞘に線維性結合組織の増 生を認め,さらに単核球浸潤およびグリソン鞘と中心静脈のbridging necrosisを認めた｡一方,HGF500FLg 投与群ではこれらの所見をわずかに認めるのみであった｡肝線維化の程度は,無処置群(n=3;15.5±1.0%)およ びPBS投与群(n=3;15.2±0.5%)に比し,HGF500FLg投与群(n=3;4.7±0.6%)では有意に抑制された(p<0.05)｡ この効果はEP施行部位のみならずEP非施行部位においても認められた｡ 考察 臓器への遺伝子導入において,現時点ではウイルスベクター法は発現効率あるいは副作用の面で実用的でない｡ 一方,非ウイルスベクター法は比較的安全ではあるが,導入効率および導入遺伝子の発現効率が低いことに問題 がある｡いずれにしろ現時点において,安全性,導入効率,細胞毒性,抗原性,発現期間をすべて満足できる遺 伝子導入法はなく,既存遺伝子導入法の改良,新しい遺伝子導入法の開発が望まれている｡ 後者のうちの一つがEPである｡これまでにEPを用いた小動物の肝臓への遺伝子導入の報告がなされている｡ その手法としては肝実質へ直接DNAを注入し,その後にEPを負荷している｡この方法では,遺伝子発現がDN A注入部位に限定されるため発現効率が低く,また注射針による肝実質の損傷をもたらすため実用的ではない｡ よって,本研究では効率的な遺伝子発現および組織損傷の回避を目的としてDNAを門脈内投与し,その直後に EPを負荷する方法を用いた｡ 本法では,3日後の肝臓における遺伝子発現は投与量500JJgにおいて100FLgよりも多く認め,DNA濃度依存 的に発現効率が高まった｡血清HGFレベルの増加は認められなかったが,この結果は本法が標的とする肝臓局 所への遺伝子導入が可能であり,標的としない臓器への影響が少ないことが予測される｡組織学的検討では,門 脈内投与およびEPに伴う肝組織障害も軽度であった｡ DNAの門脈内投与による肝臓への遺伝子導入法を最初に報告したのはBudkerらであるが,彼らはDNAの門 脈内投与のみで,2日後に急激な発現レベルの低下を認めている｡本法ではEPを加えることで最長3週間までの 効率良い発現が得られた｡ HGFを用＼､て肝硬変の抑制を検討した報告には,MatsudaらのリコンビナントHGFタンパクを用いた報告, UekiらのHVJリポソーム法を用いた報告がある｡HGFタンパク投与では,血中レベルを維持するために大量の タンパク投与が必要となる｡また,HVJリポソーム法ではHGF遺伝子の複数回(2回)投与により肝硬変の抑制を 認めている｡本研究では,HGF遺伝子を門脈内投与した後にEPを単回施行するだけで肝硬変ラットの生存率の 延長および肝線維化の抑制を認めた｡この方法は開腹操作による侵襲を伴うものの,肝臓局所への効率的な遺伝 子導入が可能であり,治療効果を発揮しうる有用な方法であると考えられる｡ 結語 経門脈的DNA投与によるEPを用いた遺伝子導入法は肝臓への効率的な遺伝子導入が可能であった｡さらに, 本法を用いた肝臓局所へのHGF遺伝子導入は,肝硬変の治療に有効であった｡ 論文審査の結果の要旨 申請者 松野幸博は,経門脈的DNA投与によるEPを用いた遺伝子導入法を検討した｡本法を用いてHGF遺伝 子を導入することにより肝硬変の進行を制御できる可能性が示唆された｡ [主論文公表誌]
Hepatocyte growth factor gene transferinto theliver via the portalvein uslng electroporation
attenuates the ratliver cirrhosis Gene Therapy.10,1559-1566(2003).
