石原和夫*、北村美貴**、鈴木裕行*

石原和夫*、北村美貴**、鈴木裕行*

Isolation snd Identification of Oxo and Hydroxy Acids, as Flavor  Components in Shoyu (Soy Sauce)

Kazuo Ishihara*, Miki Kitamura**, Hiroyuki Suzuki*

 大豆を利用した日本古来の発酵調味料として 醤油と味噌がある。醤油は平成10年度では世界 60ヶ国に輸出され、輸出高も24億円となった。1）

さらに、1973年にはアメリカで現地生産が始ま り、その後、シンガポール（1984年）、オラン ダ（1997年）と続き、今や世界の調味料の域ま で達した。これは、醤抽を使った肉料理が TERIYAK工として定着したことからも、特1に 万入に受け入れられる醤油の香りによるものと 考えられる。

 醤油の香りは、焙焼香、花香、果実香、肉の 香りなどの多くの芳香成分を有し、きわめて複 雑である。2｝その醤油の香気成分は成因別には 次のように分類される。3｝（1）脱脂大豆や小麦な

どの原料に由来する香気成分、②Aspergillus oryzaeやAspergitlus sq／aeなどの麹菌酵素によ

る原料の分解により生成される香気成分、（3）

耐塩性酵母や耐塩性乳酸菌などの発酵微生物に より生成される香気成分、（4）原料成分の熟成 中及び火入れに伴って化学的反応により生成さ れる香気成分などである。そして、これらの過 程でつくりだされる主な香気成分はアルコール 類、エステル類、アルデヒド類、フェノール類、

アセタール類、フラノン類、揮発性有機酸など である。

 一方、著者らは、味噌の香気成分成因も上記 醤油の香気成分成因に準じることをもとに・特

に、味噌の香気付与及び矯正に耐塩性酵母の関 与が不可欠であるとの観点から、合成培地を使

用して、揮発性有機酸4｝や揮発性含硫化合物5｝

などの生成や消長に対する而｝塩性酵母の役割に ついて検討した。

 その結果、耐塩性酵母によって生成が認めら れた揮発性有機酸（以下、揮発性酸）は、acetic、

propionic、 isobutyric、 n−butyric、 2−methylbuta−・

noic、3−methylbutanoic（isovaleric｝acid、 2−oxo−3−

methylbutanoic、 2−oxo−3−methylpentanoic、2−

oxo−4−methylpentanoic、2−hydroxy−3−

methylbutanoic、2hydroxy4methylpentanoic

acid、 benzoic acid、 phenylacetic acidなどで あった。

 これら揮発性酸のうち、炭素数5、6の分岐 オキソ酸やヒドロキシ酸を除く揮発性酸は、醤 油及び味噌中の揮発性酸として既に報告されて いるのでこれら揮発性酸の生成に対する耐塩性 酵母群の関与を考察した。

 本報では、醤油の揮発性酸として、、いまだ報 告されていない炭素数5、6の分岐オキソ酸や

ヒドロキシ酸の分離、同定を試みたので、その 結果を報告する。

実験方法

L供試醤油

 醤油は原料及び製造工程上の特色から、濃口 醤油、淡口醤油、たまり醤油、再仕込み醤油、

白醤油及び生揚げの6種類に分類される。また、

醤油の製造方法による分類では、本醸造方式、

生活科学科食物栄養専攻・専攻科食物栄養専攻1、専攻科食物栄養専攻騨

新式醸造方式、酵素処理・アミノ酸混合方式に 分類される。1998年度のデー…一タによれば、品目 別では生揚げを除く、5種類のうち、83％近く

を占めるのが濃ロ醤油であり、また、生産方式 別では本醸這が約80％を占め、更に等級別では 特級、上級、標準のうち、特級が約7G％を占め ている。

 本醸造方式の濃口醤油（以下、醤油）は通常、

蒸煮大豆または脱脂大豆と妙り小麦で麹をつく り、その麹に食塩水を加えて、諸昧とし、発 酵・熱成させ製造する。

 実験には市販されている2種類の本酸造濃口 醤油め特級を用いた。その1は、全蜜規模で販 売されているキッコーマン株式会社（千葉県）

製造の「キッコーマン本醸造しょうゆ」（以下、

キッコーマン醤油）で、その2は、薪潟県内で は最大手の山崎醸造株式会社（新潟県小千谷市）

製造の「純正ゆき本醸造・こいくちしょうゆ」

（以下、山崎醤油）であった。

 なお、両醤油の原料大豆は脱脂大豆であるが、

キッコーマン醤湘には丸大豆も使用されてい

た。

2．揮発性酸の分離及び定量とそのフチルエス   テル化

 各醤油％中の揮発性成分を、Fig．1に示した 装置を用いて補集した。ただし、醤油を減圧蒸 留すると激しく起泡するため、消泡剤としてシ

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リコーンオイルを使用し、且つ、1回の蒸留量 を約工00mlずつと分割して行った。装置Aは一 5℃、BとCは一80℃に冷却し、醤油を6N塩

酸でpH2．0に調整後、ロー・タリーエバポレ・一タ

ーに接続したフラスコに入れ、10mmHg以下 で醤油が乾固するまで減圧蒸留を行った。さら に約100mlの蒸留水を加えて減圧蒸留を繰り返 した。なお、留液はほとんどAに補集され、B には少量の氷結、Cには極めてわずかな氷結が 認められた。BとCの氷結を解凍後、 Aの留液 と合わせて揮発性酸分析のための試料溶液とし

た。

 留液申の総揮発性酸量は、アルカリ滴定法で 求め、酢酸として算出した。

 揮発性酸の分画方法をFig2に示し、得られ た揮発性酸のアンモニウム塩は山下ら6）の方法 でブチルエステル化した。最終的には、揮発性 酸のブチルエステルを溶媒のヘキサンへ移行

し、さらに、ガスクロマトグラフィー用内部標 準物質としての5％ノナデカン1mlを加えた 後、ヘキサンで25mEの一定容にした。そして、

脱水のための無水炭酸ナトリウム約0．5gを添加 し、容器のふたをパラフィルムで密封してから 冷蔵庫で保管した。

3．揮発性酸ブチルエステルのガスクロマトグ   ラフィー（GC）

GCは島津GC44A（検出器：水素炎イオン化検

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出器；FID）を用いて行った。注入部と検出器 の温度は共に250℃とした。カラムはPEG20M に相当するShimadzu fused silica capillary column（CBP20−M25025、 O．2mmi．d．x25m）を 使用し、カラム温度は60℃で5分間保った後・

1分間当たり5℃の昇温で60℃から200℃まで とし、さらに200℃で7分間保った。キャリヤー ガスとしてヘリウムを用い、1分間当たり5 mlの流速で、スピリット比は1：28であった。

 試料中の揮発性酸ブチルエステルのGCは1 試料につき、2回繰り返し、定量には島津クロ マトパックC．R5Aを用いた。また、 Retention index（Kovats Index）を自動的に算出するた め、杉沢ら7）のBASICプログラムを同クロマ

トパックに組み込んだ。

 各ピークに相当する化合物の推定は標準物質 のRetention time（Rt．）とKovats Indexとの比 較、標準物質の添加試験により行った。

実験結果および考察

1．醤油中の総揮発性酸量

 アルカリ滴定による酢酸としての総揮発性酸 量は、キッコーマン醤油が1535mg／100mL山 崎醤油が17．70mg／100mlで、山崎醤油の揮発性 酸量はキッコーマン醤油の揮発性酸量の1．2倍 であった。

2．揮発性酸の同定

各醤油の揮発性酸ブチルエステルのガスクU

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マトグラムをFig．3に示した。また、揮発性酸 ブチルエステルの各ピー一クの同定結呆およびピ ーク面積の比率などをTablelにまとめた。

 ガスクロマトグラムのピークAは溶媒の hexane、ビP一クBは揮発性酸のブチルエステJk 化時に生成するdibutyl ether、ピークCはブチ ルエステル化時に使用した試薬のn−butyl

alcoholのピークであった。

 ガスクロマトグラムのピ・・一一ク総面積値の大き さは、アルカリ滴定によって求められた揮発性 酸黛の結果と一・致した。すなわち、山崎醤油の

ピーク総面秋値は、キッコーマン醤油のそれを うわまわった。

 両醤油に共通して、acetic acid、 n−butyric acid、 2−oxo−4−methylpentanokc．acid、 n−

decanoic acid、 benzeic acidの存在が認められ た。これらのほか、キッコーマン醤抽には2・

hydroxy・3・methylbutanoic acid、2−hydroxy・4・

methylpentanoic acidのヒドロキシ酸が認めら れた。これら醤油中の揮発性酸のうち、acetic

acid、 n』butyric acid、 benzoic acid iま既に醤…温1

中での存在が報告されているが細、2−oxo−4−

methylpentanoic acidN 2−hydroxy−3−

met−hyibtttanolcN 2−hydroxy・4−

methylpentanoic aeid、 n−decaneic acidはいま だその存在が報告 されていない揮発牲酸であ

る。なお、2−oxo−4−methylpentanoic acid、2・

hydroxy−3−methylbutanoic、2・hydroxy−4・

methylpentanoic acidのオキソ酸やヒドロキシ 酸に関しては、昧噌より分離された耐塩性酵母 によって生成されることを既に報告した。4〕こ のことは醤油の発酵・熟成に関与する耐塩性酵 母は、味噌の発酵・熟成に関与する耐塩性酵母 と同種であることから、上記オキソ酸やヒドロ キシ酸の醤油中での存在の可能性は示唆されて いたことではあるが、本研究によりこれらオキ ソ酸やヒドロキシ酸の醤油中での存在をはじめ て確認することが出来た。そして、これらのオ キソ酸やヒドロキシ酸は、いずれもエチルエス テルではあるが、清酒の重要な香気成分として 報告されている。 9 1°）一方、N、 Nunomuraら7｝

や横塚らs｝は、醤油の揮発性酸としてacetic

acid、 n−butyric acid、 benzoic acidのほかに、

propionic、 isobutyric、2−methylbutanoig、3−

rnethylbutanoic（isovaleric）acidなど多数の揮発 性酸を報告している。しかし、本実験ではこれ

らの揮発性酸が確認できなかったので、今後は 醤油の供試量を増やし、複数のGCカラムや質 量分析計を連結させたガスクロマトグラフ

（GC−MS）などの使用により詳細に検討したい と考えている。

 醤抽中に存在が認められた揮発性酸の大部分

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がacetic acidで、キッコーマン醤油では約93％、

山崎醤油では約95％占めた。ついで、量的に多 かったのは、キッコーマン醤油ではn−butyric acid、 benzoic acidであり、山崎醤油では benzoic acidであつた。両醤油中の揮発性酸を 比較すると、acetic acidとbenzoic acidが、キ ッコーマン醤油よりも山崎醤油にそれぞれ、

1．2倍、2、8倍多いことが認められた。逆に、キ ッコーマン醤油のn−butyric acidは山崎醤油の それの1．4tuであった。さらに、これら揮発性 酸のほか、キッコーマン醤油には2−hydroxy−3−

methylbutanoic acid、2−hydroxy−4−

methylpentanoic acidのヒドロキシi酸が認めら れたが山崎醤抽には認められなかった。これら

ヒドロキシ酸のエチルエステルは清酒の重要な 香気成分とされることから、ヒドロキシ酸の有 無が醤抽の品質にどのような影響を与えるか興 味が持たれる。

 醤油の香りにどの揮発性酸がどのような影響 を与えるのか、また、どのようにして生成され るのかは今後の課題であるが、醤油の有機酸

（揮発性酸＋不揮発性酸）はpH、酸度、緩衝能 などを決定するとともに、微生物の増殖を制御 する作用にも寄与していると言われる。例えば、

正常な発酵を経た醤油のpHは4．6−−4．8と言わ れ、本実験に使用した醤油のpHは、キッコー マン醤油がpH4．7、山崎醤油がpH4．8であり、

両者とも正常な発酵過程を経たと考えられる。

また、適量の有機酸は醤油の苦味、塩味を柔ら げ食味を増進させると言われる。全国醤油品評 会に出品された市販醤油を評価別に上・申・下 位に分け、有機酸などを分析すると・濃口醤油 の上位のものは総有機酸量（その中でもlactic acidとacetic acid）が多く、また・淡口醤油で は総有機酸量の少ないものがおだやかで、無難 な評価をうけることから、有機酸が醤油の品質 に深く関与していることが認められる。1t）

        要  約

 約L200年前に中国から朝鮮を縫て日本に伝 えられた醤は醤油となり、日本で独自の発達を とげた。その香りは様々の芳香成分を宥し・今 日ではその香りが世界各国でうけいt・られ「世 界の調味料」と呼ばれるまでになoた。

 本報では日本最大手のキッコーマン株式会社 と新潟県内最大手の山崎醸造株式会社で製造さ れた本醸造濃口醤油2種類を用い、醤油香気成 分のうち揮発性酸をガスクロマトグラフィーで 分析し、比較・検討を行った。

 アルカリ滴定による酢酸としての総揮発性酸 量は、キッコーマン醤油が15．35mg／100ml．山 崎醤滴が17．70mg／100m1でs山崎醤油の揮発性 酸量はキッコーマン醤油の揮発性酸量の1．2倍 であった。

 醤油中から分me ・同定できた揮発性酸は7種 類であった。両醤油に共通して存在した揮発性

酸諄ま、 acetic acid、 n−butyric acid、 2−oxo・4・

methylpentanoic acid、 n−decanoic acid・

benzoic acidであった。これらのほか、キッコ

・・一 一}ン醤…油には2−hydroxy−3−methylbutanoic

acid、2−hydroxy−4・methylpentanoic acidの ヒドロキシ酸が認められた。これら揮発性酸の うち、acetic acid、 n−butyric acid、 benzoic

acidは既に醤抽中での存在が報告されている が、2−oxo−4−methylpentanoic acid、2−

hydroxy−3−methylbutanoic、 2−hydroxy 4−

methylpentanoic acid、 n−decanoic acidはいま

だその存在が報告されていない揮発性酸であ り、本研究によりはじめて確認することが出来

た。

 両醤油とも揮発性酸の大部分をacetie acidが 占めており、その割合はキッコーマン醤油では 約93％s山崎醤油では約95％であった。Acetic acidとbenzoic acidは山崎醤油の方がキッコー・

マン醤油よりもそれぞれ、1．2倍、28倍多く、

逆に、キッコーマン醤油のn−butyric acidは出 崎醤油のそれの1．4倍多く含有していた。

文  献

1）しょうゆ輸出実績：大蔵省統計局資料

（1998）

2）内田一生：「醤油の科学と技術」．栃倉辰六 郎編，P．285，躰醸遡轟会，東京（lg−8s）

3）浅，毛｛呆夫，横塚  ｛呆：「1漸？｝1反醸造成葦｝一覧玉

 日本醸造協会編，P．367．日本醸造協会，東 京（1977）

4）石原和央，本間紳央，小笠原長宏：醗酵工

学， 63， 279 （1985）

5）石原和夫，本間伸夫，内山武夫：生物工学，

73， 463 （1995）

6）山下市二，田村太郎，吉川誠次，鈴木重 治：分析化学，22，1334（1973）

7）N．Nunomura， M． Sasaki， T．，Yokotsuka：

Agric． Biol． Chem．，44，339（ユ98G）

8）横塚 保，佐々木正興，布村伸武，浅尾保  夫：醸協，75，717（1980）

9） 山本i享：農イヒ， 35，619 （1961）

10）山本淳：農化，35，711（1961）

11）内田一生1「醤油の科学と技術」，栃倉辰六  郎編，p．284，日本醸造協会，東京（1988）