MRSA の院内伝播制御に有用な POT 法を用いた分子疫学解析
1）
島根大学医学部附属病院感染対策室，
2）同 検査部
森山 英彦
１）２）松田 親史
２）柴田 宏
２）西村 信弘
１）廣瀬 昌博
１）長井 篤
２）（平成 23 年 5 月 13 日受付）
（平成 24 年 1 月 18 日受理）
Key words : MRSA, Phage, open reading frame（ORF）typing, outbreak
要 旨
MRSA の院内伝播を防止するには，サーベイランスが重要であり，感染源の特定や感染経路の究明には 分子疫学解析法（PFGE 法）が用いられてきた．しかし本法は処理時間が長く煩雑なことから，日常業務へ の導入は困難であった．今回，短時間で再現性良く測定可能な POT 法による分子疫学解析キットが開発さ れたため，2010 年入院患者から新規に検出された MRSA 192 例について解析を行い，院内伝播制御におけ る有用性を検討した．
これまで MRSA サーベイランスに用いてきた検出タイミングによる方法では 2010 年における院内伝播を 疑う症例は 118 例であった．しかし POT 法を導入し，場所（病棟，移動情報）と時間的背景（入院日，検 体採取日）を考慮することで，院内伝播が強く疑われる患者 38 例の抽出が可能であった．この結果を臨床 現場に示すことで，感染対策室は確信を持って院内伝播の実態を示すことができた．POT 法は特殊な解析 ソフトも必要なく，泳動後のバンドの有無をもとに簡単に数値化できることから，菌株間の比較やデータ管 理に極めて有用であった．
〔感染症誌 86：115〜120，2012〕
序 文
メ チ シ リ ン 耐 性 黄 色 ブ ド ウ 球 菌（methicillin- resistant Staphylococcus aureus：MRSA）は，わが国 における医療関連感染の最も主要な病原微生物のひと つである．MRSA の院内伝播を防止するには，サー ベイランスが重要であり，当院では MRSA 新規検出 数の推移や検出タイミングによる輸入と院内伝播の別 を監視してきた．しかし，検出数の監視による院内伝 播の把握は感染源の特定や感染経路の究明には不十分 であり，分子疫学解析法の導入が望まれていた．分子 疫学解析法としては，パルスフィールドゲル電気泳動 法（PFGE 法）が用いられるが，最低 3 日の時間がか かることに加え特殊な電気泳動装置を必要とするため 細菌検査室の日常業務に導入することは困難である．
これに比し，鈴木らが開発した Phage Open Read- ing Flame（ORF）タイピング法（POT 法）は，PFGE 法と同等の菌株識別能力と再現性を有し，簡便・迅速 な方法として注目されている
１）〜５）．今回我々はキット
化された POT 法を用いて入院患者から新規に検出さ れた MRSA について分子疫学解析を行い，院内伝播 の制御における有用性を検討した．
対 象
島根大学医学部附属病院の入院患者において 2010 年 1 月〜12 月の間に MRSA が新規に検出された 192 例を対象とした．輸入あるいは院内伝播の判断は CDC のガイドラインに基づいて行った
６）．すなわち新規 MRSA が検出された患者の検出日から，入院前ある いは入院後 48 時間以内に検出された場合を輸入とし，
入院後 48 時間以降に検出された場合を院内伝播の疑 いとした．
方 法
1．DNA 抽出
保存菌株をヒツジ血液寒天培地にて 24 時間培養し，
発育した単一コロニーを採取，シカジーニアス DNA 抽出試薬（関東化学）により DNA を抽出した．
2．POT 法
シカジーニアス分子疫学解析 POT キット：黄色ブ ドウ球菌用（関東化学）を用い取扱説明書に従い測定
原 著別刷請求先：（〒693―8901）島根県出雲市塩冶町 89―1 島根大学医学部附属病院検査部 森山 英彦
Table 1 ORFs used for POT typing
POT number Amplicon size (bp) Targetted gene Reaction
mixture 1 femA 601 S.aureus positive control
POT1-1 530 mecA
POT1-2 449 mec gene complex class B
POT1-3 355 SCCmec type II a specific
POT2-1 304 Tn554
POT2-2 271 Prophage
POT2-3 228 Prophage
POT2-4 197 Prophage
POT2-5 161 Prophage
POT2-6 131 Prophage
POT2-7 104 Prophage
POT2-8 81 Genomic Island
Reaction mixture 2
femA 601 S.aureus positive control
POT1-4 477 cassette chromosome recombinase A2
POT1-5 388 Genetic background
POT1-6 320 Genetic background
POT1-7 273 mec gene complex class A
POT3-1 243 Prophage
POT3-2 197 Prophage
POT3-3 171 Prophage
POT3-4 140 Prophage
POT3-5 115 Prophage
POT3-6 95 Prophage
POT3-7 78 Prophage
した．本法は菌株識別に有効な ORF を選び，マルチ プレックス PCR を用いた 2 回のアッセイにより 22 個 の増幅産物の検出が可能である（Table 1）．検出され た増幅産物は POT 1〜3 に分類されており，割り当て られた POT 係数から，3 つの数字からなる POT 型
（POT 1-2-3）が決定される．例（sample ① POT 109- 166-103）を Fig. 1，Table 2に示す．計算手順を次に 示す．①増幅産物検出は結果 1，未検出は 0 とする．
② POT 係数と結果を掛け合わせ POT ポイントとす る．③ POT 1，2，3 のポイントを合計し，POT 型を 決定する（例：POT 1 は POT 1-1〜1-7 の合計，64＋
32＋0＋8＋4＋0＋1＝109）．異 な る 分 離 株 の POT 型 が一致すれば分子疫学的に極めて近い株という判断が 可能となる．測定は DNA 抽出を含め 4 時間で可能で ある．
成 績
192 例の内訳は輸入 74 例，院内伝播の疑い 118 例 であった．POT 型は 85 種類が検出され，単独例が 60 種類（輸入 30，院内伝播の疑い 30）であった．複数 例を認めた POT 型は 28 種類（132 症例）あり，検出 タ イ ミ ン グ の 判 断 に よ る 院 内 伝 播 の 疑 い が 94 例
（71.2％）と多くを占めた．
この内，複数の患者から同じ POT 型が検出され，
次の条件を満たした場合に院内伝播確定と判断した
（Table 3）．ただし，この条件は院内伝播を強く疑う 症例を抽出する目的で設定したものであり，条件に満
たない症例が院内伝播を否定される保証はない．
院内伝播確定の条件
1．同じ病棟の患者であること．
2．入院日あるいは MRSA が検出された検体採取日 の相違が 30 日以内であること．
特徴的事例への対応として，No 2（POT 77-138-11）
は同じ産科医院から当院に転院した新生児（臍感染）
2 名から検出されており，医療関連感染が疑われ産科 医院に注意を喚起した．その他の事例の解釈として，
No 7（POT 93-147-109）は F 病 棟 3 名，ICU 4 名 か ら検出されたが，両病棟の検出時期には 2 カ月の隔た りがあり，これらの患者の病棟間の伝播はないと考え た．No 16（POT 93-190-47）は 8 例 中 7 例 が 輸 入 で あり，2004〜2007 年に検出歴のある患者であった．
No 18（POT 93-191-103）は 18 症例と最も多く，8 つ の病棟から検出された．No 21（POT 93-217-111）の 5 例は G 病棟からの検出であった．
院内伝播確定と判断した 38 患者の詳細情報を Ta- ble 4に示す．POT 93-191-103 は B 病棟と C 病棟にて
（症例 3，4，7，8）検出され，同病棟では他の POT 型を複数例認めた（症例 5，6，9，10）．D 病棟では POT 93-155-51 が 6 例検出され，2 回の院内伝播が疑 われた（症例 13〜14，15〜18）．さらに，POT 93-129- 0 を複数例認めた（症例 11，12）．
H 病棟では POT 93-187-27 が 7 例検出され，院内伝
播が疑われた（症例 28〜34）．また，POT 98-145-125
Table 2 A calculation example of POT type (sample ① : POT109- 166-103)
POT number bp POT coefficient Result
＊POT points Reaction
mixture 1 femA 601 1
POT1-1 530 64 1 64
POT1-2 449 32 1 32
POT1-3 355 16 0 0
POT2-1 304 128 1 128
POT2-2 271 64 0 0
POT2-3 228 32 0 0
POT2-4 197 16 1 16
POT2-5 161 8 0 0
POT2-6 131 4 0 0
POT2-7 104 2 1 2
POT2-8 81 1 1 1
Reaction
mixture 2 femA 601 1
POT1-4 477 8 1 8
POT1-5 388 4 1 4
POT1-6 320 2 0 0
POT1-7 273 1 1 1
POT3-1 243 64 1 64
POT3-2 197 32 1 32
POT3-3 171 16 0 0
POT3-4 140 8 0 0
POT3-5 115 4 1 4
POT3-6 95 2 1 2
POT3-7 78 1 1 1
＊
POT points＝(POT coefficient) X (Results)
Fig. 1 Electrophoresis for determining the POT types of 3 MRSA genes sample ① and sample ② were collected from inpatients of an outbreak (POT type:
109-166-103). sample ③ was collected from imported case (POT type: 90-219-34).
を複数例認めた（症例 35〜38）．
考 察
医療関連感染による MRSA 感染症を低減させるた
めには，サーベイランスにより自施設の院内伝播の状 況を把握し，感染対策の破綻が予想された場合には，
標準予防策と接触感染予防策を基本とした感染対策を
Table 3 Overlapping cases of POT types POT type Number of
cases
Imported cases
Suspected as nosocomial transmission
Defined as nosocomial transmission
Total number of wards
1 75-137-80 4 1 3 0 3
2 77-138-11 2 2 0 0 1
3 85-182-45 2 0 2 0 2
4 93-129-0 3 1 2 2 2
5 93-136-7 2 1 1 0 2
6 93-137-103 6 4 2 0 4
7 93-147-109 8 0 8 3 3
8 93-152-127 2 0 2 0 1
9 93-155-27 3 1 2 0 3
10 93-155-51 8 1 7 6 2
11 93-155-111 5 2 3 0 4
12 93-159-121 3 0 3 0 2
13 93-183-37 3 1 2 2 2
14 93-187-27 7 0 7 7 1
15 93-187-125 4 0 4 2 2
16 93-190-47 8 7 1 0 6
17 93-191-34 2 0 2 0 2
18 93-191-103 18 7 11 4 8
19 93-201-17 5 2 3 0 5
20 93-201-111 2 0 2 0 1
21 93-217-111 10 1 9 4 5
22 93-221-127 4 1 3 2 2
23 93-251-125 2 1 1 0 2
24 98-145-117 2 0 2 0 2
25 98-145-125 4 0 4 4 1
26 98-147-69 3 0 3 2 1
27 106-9-80 5 2 3 0 3
28 106-171-34 5 3 2 0 3
Total 132 38 94 38
すみやかに実施することが重要である．
当院における MRSA サーベイランスは 1 週間ごと に提出される総検出数と新規検出数で行っていた．し かし，新規検出数では院内伝播の実態が分かりにくい ため，2008 年 11 月より検出タイミングによる輸入と 院内伝播の判断を加え，院内感染管理を行っている
７）． この方法と感染対策の徹底が効を奏し，2008 年 15.6％
で あ っ た MRSA 分 離 率 は 2009 年 12.3％，2010 年 12.5％ と低下し（JANIS 集計データ），血液培養から の MRSA 検 出 症 例 数 も 2008 年 の 25 例 か ら 2009 年 10 例，2010 年 13 例と著明な減少を示した．
しかし，JANIS が公開している MRSA 分離率の全 国平均値は 2008 年，2009 年共 10.5％ であり，当院の 分離率はこれよりも高い値であった．つまり，さらな る感染管理の充実が必要であった．MRSA 感染制御 は，継続的な予防策の徹底が必要であるが，院内伝播 の事実を説明できなければ遵守率が低下する傾向にあ る．院内伝播の事実を臨床現場に納得させる根拠とし ては，分子疫学解析法があるが，その代表である PFGE 法は経費や所要時間，煩雑さなどの問題があり，より 簡便な方法が求められていた．
鈴木らは，PFGE 法と同等の識別能力と再現性を有 し，より迅速簡便な POT 法を開発した．また最近，
本法がキット化され，より簡便となった測定試薬が発 売されたため，これを用いて 2010 年における当院の MRSA 院内伝播の実態を解析した．
同じ病棟の複数の患者から同じ POT 型が検出さ れ，入院日あるいは MRSA が検出された検体採取日 の相違が 30 日以内である場合を院内伝播確定と判断 すると，38 例の患者が抽出され，8 つの病棟に存在し ていた．その中でも 2 回以上院内伝播と判定され，同 一の診療科であった C 病棟（耳鼻科），D 病棟（消化 器外科），H 病棟（小児科）には特に注意を喚起した．
H 病棟は症例数も多いため環境調査を行ったところ，
パソコンキーボードから同じ POT 型を検出し，医療
従事者の手による伝播の可能性が強く示唆された．こ
のため，H 病棟勤務の医療従事者にはアンケートによ
る自己評価を実施し，標準予防策と接触感染予防策の
徹底と環境整備（特に，パソコンキーボードやドアノ
ブの定期的な清掃）を促した．その結果，H 病棟にお
ける 2010 年 12 月〜2011 年 3 月の新規 MRSA 検出数
は輸入 1 例と改善した．
Table 4 Profiles of the cases defined as having nosocomial infection
No. Ward Department Gender Age POT type Date of
admission
Length of stay (day)
Date of sample
collection Specimens
1 A respiratory medicine M 79 93-183-37 2010/3/7 1 2010/3/8 sputum
2 A respiratory medicine M 75 93-183-37 2010/3/17 27 2010/4/13 feces
3 B neurosurgery F 47 93-191-103 2010/6/1 10 2010/6/11 sputum
4 B cardiovascular surgery M 84 93-191-103 2010/6/13 6 2010/6/19 pharyngeal mucus
5 B gastrointestinal medicine F 79 98-147-69 2010/7/23 28 2010/8/20 sputum
6 B neurosurgery M 70 98-147-69 2010/8/4 26 2010/8/30 sputum
7 C otolaryngology F 57 93-191-103 2009/12/18 14 2010/1/1 open pus
8 C otolaryngology M 67 93-191-103 2009/6/23 194 2010/1/3 open pus
9 C otolaryngology M 65 93-187-125 2010/5/27 59 2010/7/25 feces
10 C otolaryngology M 56 93-187-125 2010/6/3 101 2010/9/12 open pus
11 D gastrointestinal surgery F 87 93-129-0 2010/5/21 41 2010/7/1 sputum
12 D gastrointestinal surgery F 58 93-129-0 2010/6/30 14 2010/7/14 sputum
13 D gastrointestinal surgery M 77 93-155-51 2010/5/6 19 2010/5/25 pharyngeal mucus
14 D gastrointestinal surgery M 75 93-155-51 2010/5/6 22 2010/5/28 feces
15 D gastrointestinal surgery M 86 93-155-51 2010/8/23 21 2010/9/13 IVH tube
16 D gastrointestinal surgery F 75 93-155-51 2010/9/22 56 2010/11/17 non-open pus
17 D gastrointestinal surgery F 80 93-155-51 2010/8/30 106 2010/12/14 sputum
18 D gastrointestinal surgery F 79 93-155-51 2010/11/29 21 2010/12/20 feces
19 E respiratory surgery M 77 93-221-127 2010/6/23 6 2010/6/29 open pus
20 E cardiovascular surgery M 87 93-221-127 2010/6/11 45 2010/7/26 blood
21 F neurology M 78 93-147-109 2009/11/28 55 2010/1/22 sputum
22 F neurology M 92 93-147-109 2009/11/6 87 2010/2/1 feces
23 F cardiovascular medicine M 71 93-147-109 2009/11/13 146 2010/4/8 open pus
24 G hematology M 65 93-217-111 2010/4/3 66 2010/6/8 feces
25 G gastrointestinal medicine M 70 93-217-111 2010/5/11 29 2010/6/9 feces
26 G oncology center M 71 93-217-111 2010/5/5 54 2010/6/28 pharyngeal mucus
27 G hematology M 60 93-217-111 2010/5/7 53 2010/6/29 feces
28 H pediatrics M 7days 93-187-27 2010/4/2 7 2010/4/9 sputum
29 H pediatrics M 6days 93-187-27 2010/4/7 6 2010/4/13 feces
30 H pediatrics F 19days 93-187-27 2010/4/9 19 2010/4/28 pharyngeal mucus
31 H pediatrics M 6days 93-187-27 2010/5/19 6 2010/5/25 feces
32 H pediatrics M 2days 93-187-27 2010/6/3 0 2010/6/3 feces
33 H pediatrics M 1day 93-187-27 2010/6/9 1 2010/6/10 feces
34 H pediatrics M 3months 93-187-27 2010/2/25 103 2010/6/8 pharyngeal mucus
35 H pediatrics M 2months 98-145-125 2010/7/11 73 2010/9/22 feces
36 H pediatrics M 10days 98-145-125 2010/9/12 10 2010/9/22 feces
37 H pediatrics F 28days 98-145-125 2010/9/7 28 2010/10/5 pharyngeal mucus
38 H pediatrics F 18days 98-145-125 2010/10/15 18 2010/11/2 feces
今回の解析で院内伝播確定とされたケースの多くは 単一の病棟に限局したものであったが，POT 93-191- 103 については 18 例と数も多く，8 つの病棟から検出 されたことから，全病院的な定着も考えられ注意を要 した．特定 POT 型の定着による血液培養からの検出 率増加も報告されているが，2010 年に血液培養から 検出された 13 株は POT 93-191-103 ではなく，各々が 異なる POT 型であった．
これまで MRSA サーベイランスに用いてきた検出 タイミングによる方法では 2010 年における院内伝播 を疑う症例は 118 例であったが，POT 法を導入し，場 所（病棟，移動情報）と時間的背景（入院日，検体採 取日）を考慮することで，院内伝播が強く疑われる患 者 38 例の抽出が可能であった
８）．
現在スタンダードな分子疫学解析法は PFGE 法で
あり，POT 法の結果が PFGE 法の結果と全て一致す る訳ではない．しかし，POT 法は簡便迅速で再現性 も良く，結果を数値化できることから，菌株間の比較 やデータ管理が容易であり，その信頼性に関する報告 も集積されつつある．今回 POT 法の解析結果を院内 伝播が疑われる病棟に示すことで，感染対策室は確信 を持って注意喚起ができ，院内伝播を減少させること が可能であった．
また，院外からの輸入症例においても新生児 2 例（臍 感染）から同一 POT 型を検出し，外部医療機関に注 意を喚起できたことは，医療関連感染対策を地域全体 で取り組む視点から，有用な事象であった．
以上の点から，POT 法は医療関連感染を制御する
ための MRSA 分子疫学解析の方法として極めて有用
であり，ICT 業務に役立つデータを提示できると考
える．
なお，本研究は島根大学医学部倫理委員会により疫学研 究として承認を受けたものである．
文 献
1
）林由美子，鈴木匡宏，多和田行男，飯村明子，福
井康代：MRSA の分子疫学解析法：POT 法によ る病院感染の迅速判定の提案．医学検査 2007；
56：1115―9.
2
）Suzuki M, Tawada Y, Kato M, Hori H, Mamiya N, Hayashi Y, et al.：Development of a rapid strain differentiation method for methicillin- resistant staphylococcus aureus isolated in Japan by detecting phage-derive open reading frames.
J Appl Microbiol 2006；101：938―47.
3
）Suzuki M, Matsumoto M, Takahashi M, Hayak- awa Y, Minagawa H：Identification of the clonal complexes of Staphylococcus aureus strains by de- termination of the conservation patterns of small genomic islets. J Appl Microbiol 2009；
107：1367―74.
4
）Nada T, Yagi T, Ohkura T, Morishita Y, Baba
H, Ohta M, et al.：Usefulness of Phage Open- Reading Frame Typing Method in an Epidemi- ological Study of an Outbreak of Methicilin- Resistant Staphylococcus aureus Infections. Jpn J Infect 2009；62：386―9.
5
）OʼSullivan Matthew VN, King Fanrong, Sin- tchenko Vitali, Gilbert Gwendolyn L：Rapid Identification of Methicillin-Resistant Staphylo- coccus aureus Transmission in Hospitals by Use of Phage-Derived Open Reading Frame Typing Enhanced by Multiplex PCR and Reverse Line Blot Assay. J Clin Microbiol 2010；48：2741―8.
6
）Garner JS, Jarvis WR, Emori TG, Horan TC, Hughes JM：CDC definition for nosocomial in- fections. Am J Infect Control 1988；16：128―
40.
7
）堀 賢：微生物別の種類別にみた施設内感染
制御 1）細菌 メチシリン耐性黄色ブドウ球菌
（MRSA）．臨床検査 2009；53：1332―6.
8
）朝野和典，橋本章司，鍋谷佳子：MRSA 病院感 染の考え方．INFECTION CONTROL 2007；
161：140―65.
Usefulness of Phage ORF Typing, a Rapid Genotyping Method as a Molecular and Epidemiological Method for Detecting Methicillin Resistant Staphylococcus aureus
Hidehiko MORIYAMA
１）２）, Chikashi MATSUDA
２）, Hiroshi SHIBATA
２）, Nobuhiro NISHIMURA
１）, Masahiro HIROSE
１）& Atsushi NAGAI
２）１）
