皿.実 験結果および考察

Bull. Inst. Compr. Agr. Sci. Kinki Univ. 7 : 81 —89 (1999)

キ チ ンお よび キ トサ ン分 解 性 細 菌 を利 用 した バ ラ う どん こ病 菌 の 生 物 防 除

瀧 川 義 浩 ・豊 田 秀 吉 ・松 田 克 礼 ・大 内 成 志

Biological Control of Sphaerotheca

Yoshihiro TAKIKAWA,

pannosa by Chitin- and Chitosan- Degrading Bacteria

Hideyoshi TOYODA, Yoshonori MATSUDA,

Seiji °um

Synopsis

In this study, we attempted to isolate Chitin- and Chitosan-degrading bacteria from rose phylloplane for their use in biological control of rose powdery mildew pathogen, Sphaerotheca pannosa. Rose leaves collected from rose garden were stamped on M9 medium containing colloidal chitin or colloidal chitosan for short period of time and removed. The culture plates were incubated at 26°C for 3days and colonies grew and formed a halo on the medium were isolated as candidates for chitin and/or chitosan degrading bacteria. Two isolates, KYT-001 and KYT-002 were found to extensively degrade chitin and chitosan on the basis of the size of haloes on the plates. In view of our previouse finding that commercially available chitinase degrade conidia and haustoria of the pathogen, both the isolates were tested for their enzyme activities. Prior to the assessment of their control activity of the disease, KYT- 001 and KYT-002 were inoculated on rose phylloplane, incubated at 25°C for certain period of time and isolated. These bacteria were found to be capable of surviving on rose phylloplane for a long period of time. These results indicated that chitin- and chitosan-degrading bacteria isolated in this study could be useful for biological control of powdery mildew pathogen.

1緒 言

植 物 病 害 の 多 く は 糸 状 菌 に よ っ て 引 き 起 こ さ れ る が 、 そ れ ら 糸 状 菌 の 細 胞 壁 に つ い て は 主 要 骨 格 が キ チ ンお よ び そ の 関 連 物 質 で あ る キ トサ ン か ら構 成 さ れ て い る こ と が 知 ら れ て い る5)7)12)19)23>27)。一・方 、 病 原 体 の 宿 主 と な る 高 等 植 物 は そ の 構 成 成 分 に キ チ ン関 連 物 質 を も た な い こ とか ら6)、キ チ ナ ー ゼ や キ トサ ナ ー ゼ に よ る植 物 の 菌 類 病 防 除 が 考 え ら れ る よ う に な っ た 。 こ の よ う な 背 景 か ら、キ チ ン分 解 性 微 生 物 が 注 目 さ れ 、

微 生 物 資 材 と して 植 物 病 害 防 除 に利 用 さ れ る よ う に な っ た')21)。キ チ ン 分 解 性 細 菌 は 、 土 壌 中 に 多 く分 布 し、 人 為 的 に キ チ ン を 添 加 す る こ とで 、 そ れ ら の 菌 密 度 を 顕 著 に 増 加 させ る こ と が 可 能 で あ る'5>。こ の よ う な キ チ ン 分 解 性 微 生 物 の 抗 菌 作 用 に つ い て は 、 そ の メ カ ニ ズ ム が 十 分 に 解 明 さ れ て い る と は 言 い 難 い が 、 一 般 に は,キ チ ン分 解 性 細 菌 の 生 産 す る キ チ ナ ー ゼ が 土 壌 中 に 分 泌 さ れ 、 病 原 菌 の 細 胞 壁 キ チ ン を 分 解 す る こ と に よ っ て 、 そ れ らの 増 殖 を抑 制 す る も の と 考 え ら れ て い る1)・)13)22)。筆 者 ら の 研

82 近 畿 大 学 農 学 部 総 合 研 究 所 報 告 第7号(1999)

究 室 で は 、 既 に土 壌 か ら分 離 した キ チ ン分 解 性 微 生 物 を 分 離 ・同 定 し、Streptomyces anulatusに つ い て は トマ ト24)やイ チ ゴ17>の

フザ リ ウ ム 病 防 除 に 利 用 され て い る。ま た 、 KurthiazopfilK12‑119に つ い て は キ チ ナ ー ゼ 遺 伝 子(chiSH1)を ク ロ ー ニ ン グ し 、

う ど ん こ病 防 除 に適 用 され て い る1°)。特 に 、 後 者 の う ど ん こ病 菌 に つ い て は 、 殺 菌 剤 に 対 す る 耐 性 菌 が 出 現 した こ と か ら16)、細 胞 壁 分 解 酵 素 に よ る 防 除 法 と し て 注 目 さ れ て い る 。 う ど ん こ病 菌 は 宿 主 表 皮 細 胞 に 吸 器 を 形 成 し、 そ れ を通 し て 養 分 吸 収 を行 い 、 二 次 菌 糸 を 伸 長 し て 周 辺 細 胞 へ 新 た な侵 入 を 試 み る 。 し た が っ て 、 病 原 菌 細 胞 壁 分 解 の 標 的 と し て は 、 吸 器 形 成 も し く は 、 二 次 菌 糸 を 分 解 し、 新 しい 分 生 胞 子 の 形 成 を 抑 制 す る こ とが 必 須 と な る 。

そ こ で 、 こ の よ う な 防 除 方 法 を さ ら に 発 展 さ せ る た め 、 本 研 究 で は 、 バ ラ う ど ん こ 病 の 生 物 防 除 を 目 的 と し て バ ラ 葉 面 に 生 息 して い る キ チ ンお よ び キ トサ ン 分 解 性 細 菌 の 分 離 を試 み る と と も に 、 そ れ ら 細 菌 の バ ラ 葉 面 上 で の 生 存 性 お よ び キ チ ナ ー ゼ や キ トサ ナ ー ゼ に よ る う ど ん こ 病 菌 の 分 解 活 性 に つ い て 検 討 を 加 え る こ と に した 。

n.材 料 と 方 法

1.供 試 植 物s供 試 細 菌 お よ び 病 原 菌 本 実 験 に は,バ ラ(Rosahybrida>、 栽 培 品 種 で あ る 「Doroles」 「CarlRed」 、 ノ イ バ ラ(Cosamultrflora)のC系 統 、 お よ び オ オ ム ギ(Hordeumvulgare)の 品 種 「ゴ セ シ コ ク 」 を 使 用 し た 。 供 試 細 菌 は 、 土 壌 か ら 分 離 し た キ チ ン 分 解 性 細 菌Kurthlazopfii K12‑11911)お よ び 本 学 実 験 圃 場 の ビ ニ ル ハ

ウ ス 内 で 栽 培 し た 上 記 バ ラ2品 種 か ら 分 離 し た キ チ ン 分 解 性 細 菌(KYT‑001、KYT‑

002)を 使 用 し た 。 ま た 、 接 種 う ど ん こ 病 菌 と し て は 、 バ ラ う ど ん こ 病 菌 (Sphaerothecapannosa)お よ び オ オ ム ギ う

ど ん こ 病 菌(Erysiphegraminisf.sp.hordei) を 使 用 し た 。

バ ラ 「Doroles」 は 、 既 法14>2°)に従 っ て 挿 し 芽 法 で 増 殖 し 、 栽 培 条 件 は 、25℃ 、

4,000‑6,0001uxの 連 続 照 明 と し た 。 実 験 に は 上 位 の 若 い 展 開 葉 を 用 い た 。

オ オ ム ギ は 、 流 水 中 で2日 間 催 芽 処 理 し た 後,発 芽 種 子 を 滅 菌 バ ー ミ キ ュ ラ イ トに 播 種 し 、20℃ 、4,000‑6,0001uxの 人 工 気 象 器 内 で 育 苗 し た 。 実 験 に は 、 播 種7日 間 後 の オ オ ム ギ 第 一 葉 を 用 い 、 そ の 子 葉 鞘 に う ど ん こ 病 菌 を接 種 し た 。

2.バ ラ 葉 面 生 息 性 キ チ ン分 解 性 細 菌 の分 離 バ ラ 葉 面 に 生 息 す る キ チ ン分 解 性 微 生 物 を分 離 す る た め 、 本 学 実 験 圃 場 の ビ ニ ル ハ ウス 内 で 栽 培 し た バ ラ2品 種 「Doroles」 と

「CarlRed」 お よ び ノ イ バ ラC系 統 か ら展 開 葉 を任 意 に採 取 し、 コ ロ イ ダ ル キ チ ン を 含 むM9最 少 培 地 上 に 接 着 ・除 去 し た 後 、 26℃ で3日 間 培 養 し た(ス タ ン プ 法)。 こ

の よ う な 方 法 で 培 養 して 得 ら れ た コ ロ ニ ー の う ち 、そ の 周 縁 に 明 瞭 な 透 明 帯(ハ ロ ー) を形 成 した もの を キ チ ン分 解 性 細 菌 と して 選 抜 分 離 した 。

3.分 離 細 菌 の キ トサ ン 分 解 活 性

前 項 で 分 離 し た キ チ ン 分 解 性 細 菌 の キ ト サ ン 分 解 活 性 を 検 定 す る に あ た っ て は 、 コ ロ イ ダ ル キ トサ ン 法 を 用 い た 。 コ ロ イ ダ ル キ トサ ン は 、 脱 ア セ チ ル 価 が85〜90%(ア ン ピ オ ン ク ラ ブ 社 製)の 粉 末 キ トサ ン を 用 い てYabukiら の 方 法 に よ っ て 調 整 し た26)。

す な わ ち 、10gの 粉 末 キ ト サ ン を 水1000ml の イ オ ン 交 換 水 に 懸 濁 し 、100mlの0.5N塩 酸 を 加 え て 、 室 温 で30分 間 撹 拝 し た 。 不 溶 部 を グ ラ ス フ ィ ル タ ー(G3)で 除 去 し た 後 、 ろ 液 を ワ ー リ ン グ ブ レ ン ダ ー で 10,000rpm、5分 間 磨 砕 処 理 し た 。 得 ら れ た 処 理 液 がpH9.0に な る ま で0.5Nの 水 酸 化 ナ ト リ ウ ム 溶 液 を 滴 下 し 、 析 出 し た 沈 殿 を 8,IOOrpm、10分 間 の 遠 心 分 離 で 集 め た 。 沈 殿 は 中 性 に な る ま でpH7.0の50mMの リ ン 酸 バ ッ フ ァ ー で 洗 浄 し 、 再 度 ワ ー リ ン グ ブ レ ン ダ ー で 磨 砕 処 理 し 、 均 一 な 微 粒 子 を コ ロ イ ド状 キ トサ ン を 調 製 し た 【Fig.1】。 以 上 の 方 法 で 得 ら れ た コ ロ イ ダ ル キ トサ ン をM

9最 少 培 地 に 添 加 し て 平 板 培 地 を 作 成 し 、 前 項 の キ チ ン 分 解 菌 を 穿 刺 植 菌 し た 。 生 育

Fig。1Protocolfortbepreparationofcolloidalchitasan,

した コ ロ ニ ー の 周 縁 に 明 瞭 な 透 明 帯(ハ ロ ー)が 形 成 さ れ た もの を キ トサ ン分 解 活 性 菌 と し た 。

4.バ ラ 葉 面 へ の キ チ ン お よ び キ トサ ン分 解 性 細 菌 の 噴 霧

バ ラ 葉 面 上 に お け るKI2‑1 .19お よ び 本 実 験 分 離 細 菌 の バ ラ 葉 上 に お け る 生 存 性 を 調 べ る た め 、 こ れ ら の 細 菌 の 葉 面 噴 霧 を 行 っ た 、,ま ず 、pに 用 い る 細 菌 を10mlのLB 液 体 培 地(1・ バ ク ト ト ク プ ト ン 、59 イ ー ス トエ キ ス お よ び109、NaClを14の

水 に 溶 解 し た 培 地)中 で30℃ で 一 夜 振 盗 培 養 し 得 ら れ た 細 菌 液 を 液 体M9コ ロ イ ダ ル キ チ ン 添 加 培 地 と 混 合 し 、 細 菌 密 度 を106

〜10R細 菌/mlに な る よ う に 調 整 し た。 こ の よ う に し て 調 整 し た 細 菌 懸 濁 液 を バ ラ 品 種

「Doroles」 の 上 位 展 開 葉 に 噴 霧 し た 。 噴 霧 に あ た っ て は 、 ス プ レ ー 噴 霧 口 とバ ラ 葉 と の 距 離 が 約30cmに な る よ う に 調 節 し て 、 葉 一 面 に 均 一 に な る よ う に 噴 霧 し た

。 噴 霧 葉 は,25℃ 、4,0001uxの 連 続 照 明 下 で 一 定 期 間 静 置 し 、 そ の 後 、M9コ ロ イ ダ ル キ チ ン

添 加 培 地 上 に ス タ ン プ して 処 理 菌 の 再 分 離 を行 っ た 。

5.キ チ ナ ー ゼ お よ び キ トサ ナ ー ゼ 処 理 に よ る う ど ん こ 病 菌 の 分 解

実1験 材 料 に は オ オ ム ギ と バ ラ を使 用 し た 。 オ オ ム ギ に つ い て は 、 子 葉 鞘 表 面 に 形 成 さ れ た う ど ん こ 病 菌 の 菌 叢 を 軽 く 除 去 し 、 第 一 葉 か ら 切 離 し た 子 葉 鞘 外 表 皮 を 以 下 に 述 べ る 方 法 で 固 定 し た 。 バ ラ に つ い て も 、 表 面 の 菌 叢 を 軽 く 除 去 し た 後 、 オ オ ム ギ と 同 様 の 固 定 処 理 を 施 し た 。 す な わ ち 、 試 料 を ラ ク ト フ ェ ノ ー ル ・ア ル コ ー ル 混 液(フ ェ ノ ー ル,乳 酸,グ リ セ リ ン,水 お よ び エ タ ノ ー ル の 混 液,1:1:ユ:1:8,V!V)中 で5 分 間 煮 沸 固 定 し た 後 、 リ ン 酸 バ ッ フ ァ ー

(pH7.0)で 数 回 洗 浄 し 、 酵 素 処 理 を 行 っ た 。 酵 素 は 市 販 の5艇 μomyce58廊eu5由 来 の キ チ

ナ ー ゼ(シ グ マ 社)と 、BacilluspumilusBN‑

262(和 光 純 薬)由 来 の キ トサ ナ ー ゼ を 用 い 、 1mg/mlに 調 整 し て 、 上 述 の 固 定 試 料 を 浸 漬

し た 。 処 理 温 度 は37℃ と し 、 う ど ん こ 病 菌 の 分 解 程 度 を 一 定 時 間 後 に 顕 微 鏡 観 察 し た 。

84 近 畿 大 学 農 学 部総 合 研 究 所報 告 第7号(1999)

皿.実 験結果および考察

キ チ ン 資 材 を 添 加 し た 十 壌 に お い て は 、 土 壌 病 原 菌 の 感 染 が 抑 制 さ れ る こ と は 古 く か ら 知 ら れ て い る 。 こ れ は 、 キ チ ン を 分 解 す る 微 生 物 が そ の よ う な 土 壌 で 優 先 化 さ れ 、 キ チ ン 分 解 酵 素 な ど を 土 壌 中 に 分 泌 す る も の と 考 え ら れ て き た 。 し か し な が ら 、 こ の よ う な 拮 抗 微 生 物 に は 抗 菌 性 物 質 を 生 産 す る も の も 多 く 、 そ の メ カ ニ ズ ム に つ い て は 必 ず し も 結 論 が 得 ら れ て い な い3。

Akutsuら は2、 キ チ ン 分 解 性 細 菌Serratia marcescensをBotritiscinereaの 生 物 防 除 に 適 用 し 、 さ ら にShapiraら はis1、同 菌 の キ チ ナ ー ゼ 遺 伝 子 を 導 入 し た 大 腸 菌 を モ デ ル 拮 抗 菌 と し てSclerotiumrolfsiiやRhizoctonia solaniの 生 物 防 除 に 適 用 し て 、 キ チ ナ ー ゼ の 有 効 性 を 報 告 し て い る 。 こ の よ う な キ チ ン 分 解 酵 素 の 有 効 性 に つ い て は 、 筆 者 ら の 研 究 室 に お い て も 検 討 さ れ 、Fusarium oxysporumに よ る 種 々 の 病 害 防 除 に 適 用 で

き る こ と が 明 ら か に さ れ て い る171241。以 上 の よ う な キ チ ン 分 解 性 微 生 物 を 用 い た 生 物 的 防 除 法 は 、 主 に 土 壌 病 原 菌 に 適 用 さ れ て き た が 国'1'2〕251、う ど ん こ 病 菌 の 細 胞 壁 も キ チ ン で 構 成 さ れ て い る こ と か らslへ 上 述 の 生 物 防 除 シ ス テ ム は 、 土 壌 病 害 に と ど ま ら ず 、 う ど ん こ 病 の よ う な 地 上 部 病 害 に も 適 用 で き る 普 遍 的 手 法 で あ る と 考 え ら れ る 。 こ の よ う な 観 点 か ら 、 キ チ ン 分 解 性 微 生 物 に よ る 生 物 防 除 の 生 化 学 的 、 分 子 生 物 学 的 研 究 を 開 始 す る こ と と し た 。 本 研 究 は そ の 基 礎 研 究 と し て 、 葉 面 に 生 息 す る キ チ ン分 解 性 細 菌 に 着 目 し た 。 特 定 植 物 に 高 い 親 和 性 を 示 す 細 菌 は 、 有 効 な 微 生 物 資 材 と

し て 利 用 で き る 可 能 性 が 高 い と 考 え ら れ た か ら で あ る 。 そ こ で 、 バ ラ 葉 面 に 生 息 す る キ チ ン分 解 性 細 菌 の 分 離 お よ び そ れ ら の キ トサ ン分 解 活 性 を 検 討 す る と と も に 、 キ チ ン 、 キ トサ ン 分 解 細 菌 を バ ラ 葉 へ の 噴 霧 接 種 し て そ れ ら の 自 然 状 態 に お け る 生 存 性 に つ い て 調 べ た 。 ま た 、 市 販 の キ チ ナ ー ゼ 、

キ トサ ナ ー ゼ に よ る う ど ん こ 病 菌 の 分 解 に つ い て も 調 べ た 。

1.バ ラ葉 面 生 息 性 キ チ ン分 解 性 細 菌 の分 離 う ど ん こ病 菌 の よ う な 茎 葉 病 害 を 微 生 物 資 材 を用 い て 生 物 防 除 す る場 合 、 宿 主 で あ る植 物 の 葉 圏 に 高 い 親 和 性 、 す な わ ち定 着 性 を示 す 微 生 物 が 必 要 で あ る。 そ こで 本 研 究 で は コ ロ イ ダ ル キ チ ン の み を 炭 素 源 とす るM9選 択 培 地 を 使 用 し、 本 学 実 験 圃 場 の ビ ニ ル ハ ウ ス 内 で 栽 培 し た バ ラ の2品 種

「Doroles」 と 「CarlRed」 お よ び ノ イ バ ラ C系 統 の 葉 面 に生 息 す る キ チ ン分 解 性 細 菌 の 分 離 を 試 み た 。 そ の 結 果 、 コ ロ ニ ー の 色 、 形 状 お よ び 大 き さの 異 な る 多 数 の 細 菌 が 分 離 さ れ た が 、 特 に2種 類 の キ チ ン分 解 性 細 菌 で は 、 そ の コ ロ ニ ー 周 縁 部 の コ ロ イ ダ ル キ チ ン 分 解 帯(ハ ロ ー)が 明 瞭 で あ っ た

【Fig.2Ab,c】 。 こ の こ と は 、 こ れ らの キ チ ン分 解 性 細 菌KYT‑001お よ びKYT‑002が 培

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Fig.2Haloformationbyisolatedchitin‑andchitosan‑

degradingbacteriaonchitinorchitosan containingMgmedium.

A:HaloofKYT‑001(a),KYT‑002(b) andK12‑119(c)onMgmediumcontaining colloidalchitinasacarbonsource.

B:HaloofKYT‑001(arrow)onMgmedium

containingcolloidalchitosanasacarbonsource.

地 中 に キ チ ナ ー ゼ を 分 泌 し 、 キ チ ン 分 解 産 物 を 炭 素 源 と し て 増 殖 し た こ と を 示 し て い る 。 ま た 、 こ れ ら の キ チ ン 分 解 性 細 菌 KYT‑001、KYT‑002に つ い て は 、 過 去2年 間 の 予 備 試 験 に お い て も 同 様 の 結 果 が 得 ら れ て い る こ と か ら 、 少 な く と も バ ラ 葉 面 に 高 い 定 着 性 を 保 持 す る も の と 考 え ら れ た 。 Fig.2に 示 し た 土 壌 分 離 菌K.zopfiiKI2‑119

も 大 き い ハ ロ ー を 形 成 し た が 、 コ ロ ニ ー の 生 成 は 他 分 離 菌 と 比 べ て 顕 著 に 速 や か で あ っ た 。 ハ ロ ー の 大 き さ に つ い て は 、3菌 の 間 に 大 き な 差 異 は 認 め ら れ な か っ た こ と か ら 、KI2‑ll9は キ チ ン 分 解 産 物 の 資 化 能 力 に お い て 優 れ る も の と 考 え ら れ た 。

2、 分 離 細 菌 の キ トサ ン 分 解 活 性

Fusariumな ど の 糸 状 菌 の 細 胞 壁 の 主 要 骨 格 は キ チ ン の 他 に キ トサ ン も 含 む こ と か ら71、

本 実 験 で 分 離 し た キ チ ン 分 解 性 細 菌KYT‑

001、KYT‑002が キ トサ ン 分 解 活 性 を 保 持 し て い れ ば 、 病 原 菌 の 細 胞 壁 を よ り効 果 的 に 分 解 で き る も の と 考 え た 。KYT‑001とKYT.

002を コ ロ イ ダ ル キ トサ ン を 炭 素 源 と し たM 9培 地 に 穿 刺 植 菌 し た と こ ろ 、KYT‑001の コ ロ ニ ー 周 縁 部 に は 、 コ ロ イ ダ ル キ トサ ン の 分 解 に よ る 明 瞭 な ハ ロ ー が 形 成 さ れ た 【Fig.

2B】 。 こ の こ と は 、KYT‑001が キ トサ ナ ー ゼ を 培 地 中 に 分 泌 し 、 キ トサ ン 分 解 物 を 炭 素 源 と し て 増 殖 し た こ と を 示 し て い る 。 一 方 、 KYT‑002に は コ ロ イ ダ ル キ トサ ン の 分 解 活 性 は 認 め ら れ な か っ た 。

3.キ トサ ン 分 解 性 微 生 物 の バ ラ 葉 面 で の 生 存 性

実 際 に こ れ ら の 細 菌 を う ど ん こ 病 防 除 に 適 用 す る 場 合 を 想 定 し、 バ ラ 葉 面 上 に お け るKI2‑ll9と 分 離 細 菌KYT‑001,KYT‑002の

生 存 性 に つ い て 検 討 し た 。 ま ず 、 こ れ ら の 分 離 細 菌 を 液 体M9コ ロ イ ダ ル キ チ ン 添 加 培 地 に 懸 濁 し 、 細 菌 密 度 が10̀'か ら108細 菌 /mlに な る よ う に 調 整 し て 、 葉 面 に 噴 霧 接 種 し た 。 処 理 葉 を 一 定 期 間 静 置 し た の ち 、 コ ロ イ ダ ル キ チ ン 添 加M9同 固 形 培 地 に ス

タ ン プ し た 。 そ の 結 果 、 こ れ ら キ チ ン 分 解 性 細 菌 噴 霧 葉 で は 、Fig.3に 示 す よ う に 葉

へ ︾

5︑㌔・

Fig.3CleartransparentzonesproducedonMgchitin mediumbyKYT‑001whichhadbeensprayed onroseleaves.

Theisolate‑sprayedleaveswerestampedon thesolidmediumandtheplateswasincubated at26°Cfor2days.

三7ち三')の=○の・二二(二〇u}○﹂')2霞コZ ^{S° °}

450 4° ° 350 3° ° 250 z° ° iso ioo 5°

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咀r醜 丁臥 ∵ 麺 一 「 … 二

3579

Uaysaftersprayinoculation

Fig.4Survivalofchitin‑andchitosan‑degradingbacteriaon roseleavesasassessedbycolonycounting.

Thebacterialsuspensionsadjustedat10̀'〜10"cfu/ml weresprayedonroseleavesandsprayedleaveswere incubatedforl〜9daysat25℃.Theleaveswere stampedonMgmediumcontainingcolloidalchitin andcoloniesformedonthemediumwerecounted.

A:KI2‑119,B:KYT‑001,C:KYT‑002 口:10̀',■:10'and■:1αCeHs/mlin inculumofthechitin‑andchitosan‑degrading bacteria.

86 テ丘 畿 ノく2γ:農'と}∫:音「〜糸惹・r㌃石ノi:プヒgr幸艮告 舞57レ ナ(1999)

の 全 面 か ら キ チ ン 分 解 性 細 菌 が 分 離 さ れ た 。 こ の よ う な 方 法 で 、 接 種 後 の 分 離 菌 株 の 定 着 性 を 検 討 し た 結 果 、KI2‑119、KYT‑

001お よ びKYT‑002は 少 な く と も70間 は バ ラ 葉 面 上 で 生 存 し て い る こ と が 明 ら か と な り 、KYT‑001はKl2‑119お よ びKYT‑002

よ り も 高 い 定 着 性 を 保 持 す る こ と も 明 ら か と な っ た 【Fig.4】。 こ の こ と か ら 、 う ど ん こ 病 防 除 の 微 生 物 資 材 と し て 、 キ チ ナ ー ゼ 活 性 の 高 いKI2‑119あ る い は キ チ ナ ー ゼ と キ トサ ナ ー ゼ 活 性 の 両 方 を 有 す るKYT‑001

を 混 合 噴 霧 処 理 す る こ と に よ っ て う ど ん こ 病 を 効 果 的 に 防 除 で き る 可 能 性 は 高 い も の

と 考 え た 。

4.キ チ ナ ー ゼ お よび キ トサ ナ ー ゼ 処 理 に よ る う どん こ病 菌 の分 解

分 解 細 菌 に よ る う ど ん こ病 防 除 に 先 立 ち 、 まず 、 市 販 の キ チ ナ ー ゼ や キ トサ ナ ー ゼ を 用 い て う ど ん こ病 菌 の 分 離 形 態 に つ い て 検 討 した 。 う どん こ病 菌 が 菌 叢 を形 成 し た バ ラ葉 を キ チ ナ ー ゼ 溶 液 に浸 漬 し、 各 器 官 の 分 解 過 程 を詳 細 に 調 べ た 。 そ の 結 果 、 処 理1時 間 後 か ら分 生 胞 子 、 吸 器 等 の 器 官 の 分 離 が 認 め ら れ 、3時 間 後 に は 殆 ど全 て の 器 官 が 分 解 消 失 し た 【Fig.5】。 ま た,オ オ ム ギ う ど ん こ病 菌 もバ ラ う ど ん こ病 菌 の 場 合 と 同様 に 、 キ チ ナ ー ゼ に よ っ て 完 全 に 分 解 され る こ とが 明 らか と な っ た 【Fig.6】。

次 に 、 う どん こ 病 菌 を接 種 した オ オ ム ギ 子 葉 鞘 を キ トサ ナ ー ゼ 溶 液 に浸 漬 して 各 器 官 の 分 解 過 程 を調 べ た 。 そ の 結 果 、3時 間 後 か ら う ど ん こ病 菌 の 吸 器 が 分 解 さ れ は じ め 、 処 理6時 間 後 に は 完 全 に 分 解 さ れ て い た 。 【Fig.7】。 これ らの 結 果 は 、 う どん こ 病 菌 の 細 胞 壁 に は キ チ ン の ほ か に キ トサ ンが 含 ま れ て い る こ と を 示 す も の で あ っ て 、 分 離 され たKI2‑119とKYT‑OOIは う どん こ 病 の 生 物 防 除 に 有 効 な微 生 物 資 材 と して 利 用 で きる こ と を 示 唆 す る 。 今 後 は これ らの キ チ ン、 キ トサ ン分 解 性 細 菌 を 用 い て 、 う ど ん こ 病 の 実 用 的 防 除 策 の 開 発 を 考 え て い る 。

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Fig.5Digestionofinfectionstructuresof Sphaerothecapannosabythechitinase セじ なロれ   セリ

Photographsweretakenbefore(A)andafter (B)thetreatmentwiththechitinase.

ArrowindicatestheinfectionsiteofS.pnnosa.

H:haustoriumSH:secondhyphereBar indicates10am. '

Fig.6DigestionofinfectionstructuresofE.

graminisf.sp.hordeibythechitinase treatment.

Photographsweretakenbefore(A) andafter(B)thetreatmentwiththe chitinase.

ArrowindicatestheinfectionsiteofE.

graminisf.sp.hordei.

H:haustorium SH:secondhyphae IP:infectionpeg

HR:haustorialremnantBarindicates lOμm.

88 近 畿 大 学 農学 部 総 合 研 究 所 報 告 第7号(1999)

IV.引 用 文 献

1)Alan,C.R.andHadwiger,L.D.{1979)

Thefungicidaleffectofchitosanoffungi ofvaryingcellwallcomposition.Exp.

Mycology3:285‑287.

2)Akutsu,K.,Hirata,A.,Yamamoto,M.,

Hirayae,K.,Okuyama,S.andHibi,T.

{1993).GrowthinhibitionofBotrltls spp.bySerratiamarcescensB2isolated fromtomatophylloplane.Ann.Phytopath.

Soc.Japan59:18‑25.

3)Baker,K.F.andCook,J.R.(1982}

RoleofthehostinBiologicalcontrol.In Biologicalcontrolofplantpathogebs.The AmericanPhytopathologicalSocietySt.

Paul,Minnesota.pp.217‑256.

4)Balasubramanya,R.H.andBetrabet,S.

M.(1982}.Biologicalcontroloftwo

soil‑bornefungalphytopathogensofcotton byamendingthesoilwithprawnshell

waste.Agric.Wastes3:163‑171.

5}Barra,L.R.,Schneider,E.F.,Wood,P.J., Madhosingh,C.andMiller,R.W.(1975}.

CellwallofFusaruunsulphureum.Biovhim.

Biophys.Acta.392:148‑158.

6)Fincher,G.B.andStone,B.A.(1981)

Metabolismofnon‑cellulosicpolysaccharides.

EncyclPlantPhysiol.NewSeries13B:6$‑

132.

7)FukamizoT.,SonodaK.,ToyodaH., OuchiS.andGotoS.(1990).Solid state"C‑NMRanalysisofcellwall componentsofFusariumoxysporum.

AgricBiol.them.54:2761‑2762.

S}Hajlaoui,M.R.,Benhamou,N.and Belanger,R.(1991)Cytochemical aspectsoffungalpenetration,haustorium formationandinterfacialmaterialinrose leavesinfectedbySphaerothecapannosa var.rosae.Physiol.Mol.P1.Pathol.

39:341‑355.

9)本 間 喜 久(1989).拮 抗 微 生 物(細 菌,

放 線 菌)利 用 に よ る 病 害 防 除.農 業 及

び 園 芸.4:152‑158.

10)池 田 成 志(1995).キ チ ナ ー ゼ 遺 伝 子 を 用 い た う ど ん こ 病 の 生 物 的 防 除 法 の 開 発 に 関 す る 研 究.近 畿 大 学 大 学 院 農 学 研 究 科 博 士 学 位 論 文.

11)池 本 高 子(1993).ア ル ギ ン 酸 カ ル シ ウ ム に 固 定 し た キ チ ン,キ ト サ ン 分 解 性 放 線 菌 に よ る イ チ ゴ 萎 黄 病 の 防 除.

平 成4年 度 近 畿 大 学 農 学 部 植 物 病 理 学 研 究 室 卒 業 論 文 集pp.37‑79.

12)30hnson,B.R.andChem,G.C.(1983).

Occurrenceandinhibitionofchitinincell wallsofwood‑decayfungi.Holzforschung.

37:255‑259.

13)Kendra,D.F.andHadwiger,L.A.

(1984}.Characterizationofthesrnollest chitosanoligomerthatismaximally antifungaltoFusaritrmsolaniandelicites pisatininPisiumsativum.Exp.1V.iycology 8:276‑281.

14)町 田 英 夫.(1981).さ し 木 の す べ て

誠 文 社,東 京.pp.101‑106.

15)Mitchell,R.andAlexander,M.{1962}.

Microbiologicalprocessesassociatedwith theuseofchitinforbiologicalcontrol.

SoilSci.Soc.Proc.26:SS6‑SS8.

16)Ohtsuka,N.,Sou,K.,Amano.T.,Ojima, M.,Nakazawa,Y.andYamada.(19$$) Decreasedsensitivityofcucumber powderymildew(Sphaexc)伽cafね1f819nea) toergosterolbiosynthesisinhibitors.Ann.

Phytopath.Soc.Japan54:629‑632 {1988).

17)Ouchi,S.,Toyoda,H.,Morimoto,M., Kurusu,T.,Matsuda,Y.,Goto,S.and Fukamizo,T.{1992).Intergrationof chitindegradingmicrodesintobiological controlsystemforfusariumwiltof strawberry.InBiologicalcontrolofplant diseases(eds.Tjamos,E.C.,Papavizas, G.C.,Cook,R.,J.)PlenumPressNew

YorkP.335‑340.

18)Shapira,R.,Ordentlich,A.,Chet,1.and Oppenheim,B.{1989).Controlofplant

diseasesbychitinaseexoressedfrom clonedDNAinE5c加rfchfacoli.

19)

20)

21}

22)

23)

24)

25)

26)

27)

Phytopathol.79:1246‑1249.

ShiraishiT.,OuchiS.andOkuH.

(1976).Chitincomponentinhaustorial wallofpowderymildewfungusofbarly.

Sci.Rep.Fac.Agr.OkayamaUniv.

47:21‑24.

志 佐 誠.(1956).ば ら 園 芸 一 栽 培 と

鑑 賞 一 朝 倉 書 店,東 京.pp.8‑9.

Sneh,B.,Agami,O.andBaker,R.

(1985).BiologicalcontrolofFusarium wiltincarnationwithSerratia liquefaciensandHafuniaalveiisolated fromrhizosphereofcarnation.Phytopath.

Z.113:pp.271‑276.

Stoessel,P.andLeuba,J.L.,(1984).

Effectofchitosan,chitinandsome aminosugersongrowthofvarious soilbornephytopathogenicfungi.

Phytopath.Z.111:82‑90.

Tanaka,H.,Kamiyama,S.,Miki,T.and Kominato,M.(1985).Cellwallsof regeneratingprotoplastsofPyrlcularia

oryzaePZ

Toyoda,H.,Morimoto,M.,Kakutani,K., Morikawa,M.,Fukamizo,T.,Coto,S., Tarada,H.,andOuchi,S.(1993) Binarymicrobesystemforbiological controloffusariumwiltoftomato Enhancedroot‑colonizationofan

antifungalrhizoplanebacteriumsupported byachitin‑degradingbacterium.Ann.

Phytopath.Soc.Japan.59;375‑386(1993) VanEch,W.H.(1975).Autolysisof

chlamydosporesofFusariumsolanif.sp.

cucurbitaeinchitinandlaminaran amendedsoils.Soil.Biol.Biochem.10‑

:89‑92.

Yabuki,M.,Hirano,M.,Ando,A.,Fujii,T.

andAmemiya,YIsolationand

Characterizationofachitisandegrading bacteriumandformationofchitosanase bytheisolate,Tech.Bull.Fac.Hoz‑t.

ChibaUniv.,39,23‑27(1987).

Zikakis,J.P.(1984).Novelapplications ofchitin,chitosanandtheirderivatives.

pp.57‑135andEnzymologyandgenetic engineering.pp.147‑208.In"Chitin, ChitosanandRelatedEnzymes."

AcademicPress.