Nested-PCR法
に よ る イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル ス の 検 出
川崎市衛生研究所
清
水
英
明
神奈川県衛生研究所
渡
辺
寿
美
今
井
光
信
(平成9年2月12日 受付)
(平成9年3月19日 受理)
Key words : influenza, nested-PCR, serotype
要 旨 イ ン フ ル エ ンザ ウ イ ル ス の 迅 速,高 感 度 な検 査 法 と して のNested-PCR法 の検 討 を行 っ た.さ ら に, この 方 法 を 用 い て イ ン フ ル エ ンザ の 血 清 抗 体 上 昇 が 認 め られ た もの の,ウ イ ル ス 分 離 試 験 で 陰 性 の 検 体 に っ い てNested-PCR法 に よ る ウ イ ル スRNAの 検 出 を行 っ た .近 年 の ワ ク チ ン 株 と川 崎 市 衛 生 研 究 所 で 分 離 され た 株 の 感 染 細 胞 上 清 を 用 い,プ ラ イ マ ー の 特 異 性 を 先 に調 べ た 結 果 ,型 特 異 性 が 高 く,各 型 間 で の 非 特 異 反 応 は み られ な か っ た .検 討 した プ ラ イ マ ー を用 い,検 出 感 度 に つ い て ワ ク チ ン株 で 測 定 した 結 果 ・AH1型 は1stPCRで90PFU/assey,2ndPCRで0 .9PFU/assey,AH3型 は1stPCRで100PFU/ assey,2ndPCRで1 .OPFU/assey,B型 は1stPCRで180PFU/assey ,2ndPCRで1.8PFU/asseyで あ っ た.血 清 抗 体 価 の上 昇 が み られ た に もか か わ らず ,分 離 陰 性 で,AH1型 に感 染 を 受 け た もの と血 清 学 的 に診 断 され た 臨 床 検 体 で は20検 体 中17件(85 .0%),AH3型 で は19検 体 中15件(78 .9%),B型 で は7検 体 中6件(85.7%)で,合 計46検 体 中38件(82 .6%)がPCR陽 性 とな っ た .こ の こ とか ら,本 方 法 は イ ン フ ル エ ンザ の 早 期 診 断 に 用 い る こ とが で き る も の と考 え られ た .
序
文
イ ン フル エ ンザ は毎 年 冬 期 に流 行 を繰 り返 す 公
衆 衛 生 上 重 要 な ウ イ ル ス 感 染 症 で あ り,現 在 ,
AH3(香
港)型,AH1(ソ
連)型,B型
ウ イ ル ス
の3種 類 が ヒ トか ら分 離 され て い る.さ らに,高
齢 者,呼 吸 器 ・循 環 器 等 基 礎 疾 患 を持 つ ハ イ リス
ク グ ル ー プ,特
に高 齢 者 福 祉 施 設 や 病 院 の 小 児 病
棟 等 基 礎 疾 患 を持 つ 閉 鎖 集 団 で,イ
ン フル エ ン ザ
ウ イ ル ス は急 速 に拡 散 す る た め,そ
の集 団 の ほ と
ん どの 者 が感 染 す る危 険 性 が あ る1)∼4)
.重 症 例 と
して は細 菌 との 合 併 症 に よ る肺 炎 が 多 く,そ の他
に ラ イ 症 候 群 や脳 症,熱 性 痙 攣 の 報 告 も見 られ て
い る5)∼7).
イ ン フル エ ン ザ ウイ ル ス の検 査 法 と して は,一
般 的 に 発 育 鶏 卵 やMDCK細
胞 を用 い て ウ イ ル ス
を分 離 す るか,急 性 期 と回復 期 の ペ ア血 清 を用 い
た 抗 体 価 の 上 昇 で 診 断 す る 方 法 が 用 い られ て い
る.し か し,結 果 を得 るた め に長 期 間 を有 し
,治
療 に は役 立 た せ る こ とが で き な い.ま た,冬 期 の
集 団 か ぜ 患 者 に お い て,流 行 株 の イ ン フル エ ン ザ
に対 す る血 清 診 断 で 抗 体 価 の 上 昇 が 認 め ら れ て
も,ウ イ ル ス が 分 離 され な い こ と を しば し ば経 験
す る.そ
こで,迅 速,高 感 度 な イ ン フル エ ンザ ウ
イ ル ス の検 査 法 と してNested-PCR法
につ い て
,
検 出感 度 を測 定 す る と と もに,こ
の 方 法 を用 い て
ペ ア血 清 で 抗 体 上 昇 が 認 め られ た もの の
,ウ イ ル
ス 分 離 陰 性 の検 体 か らの イ ン フ ル エ ンザ ウ イ ル ス
の遺 伝 子 検 出 を試 み た.
材 料 と方 法
検 体
別 刷 請 求先:(〒210)川 崎 市川 崎 区大 島5-13-10 川崎 市 衛 生研 究 所 清 水 英 明 感 染 症 学雑 誌 第71巻 第6号用 い た ウ イ ル ス は,川 崎 市 で 分 離 さ れ たAH1型 (A/kawasaki/76/92), AH3型(A/kawasaki/ 161/94),B型(B/kawasaki/47/93)お よ び1995 年 度 の ワ ク チ ン株(A/yamagata/32/89, A/kita-kyusyu/159/93, B/mie/1/93)のMDCK感 染 細 胞 上 清 を 用 い て プ ラ イ マ ー の 特 異 性 を 調 べ た.検 体 か ら の ウ イ ル ス 検 出 に は,1992∼1994年 に 採 取 さ れ た イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル ス 分 離 陽 性 の 咽 頭 ぬ ぐ い 液23件(AH1型3件,AH3型10件,B型10件), 血 清 抗 体 価 の 上 昇 が み ら れ 分 離 陰 性 で あ っ た う が い 液46件(AH1型20件,AH3型19件,B型7件) を 用 い た.な お,検 体 の う が い 液 は 急 性 期 の 血 液 と 同 日 に 採 取 し た.ま た,ワ ク チ ン 株 に つ い て は MDCK細 胞 を 用 い た ウ イ ル ス の プ ラ ー ク 定 量 法 を 行 い,PCR法 の 検 出 感 度 を 測 定 し た. プ ラ イ マ ー プ ラ イ マ ー の 設 定 は,イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル ス HA1遺 伝 子 中 の 変 異 の 少 な い 領 域 で,す で に 報 告 さ れ て い る も の8)9),ま た 自 ら 設 定 し た も の を 用 い,1stPCRの プ ラ イ マ ー は3種 類 の 型 が 泳 動 す る 際 に 判 別 し や す い よ う に,増 幅DNAの サ イ ズ を 変 え て 作 製 し,混 合 し て 使 用 し た(Table1). PCR RNAの 抽 出 は ホ ッ ト フ ェ ノ ー ル 法10)を 用 い,-20.Cで 一 晩 静 置 後,エ タ ノ ー ル 沈 殿 を 行 い RNAを 回 収 し,そ の 沈 渣 に10μlの 減 菌 蒸 留 水 を 加 え た.RT反 応 はRNA10μlにRTBuffer(100 mMTris-HCI, 500mMKC1, 15mMMgC12, 100 mMDTT)2μl, 10mMdNTPs4μl, 20UReverse Transcriptase1μl, 40URNaselnhibitor, 20μM senseprimers各0.5μlに 蒸 留 水 を 加 え 総 量20μ1 と し て,42.C60分, 95℃5分 イ ン キ ュ ベ ー ト し cDNAを 作 製 し た. lstPCRはcDNA20μ1に PCRbuffer(100mMTris-HC1, 500mMKC1, 15mMMgC12)3μ1, 5UTaqDNAPolymerase 0.3μ1, 20μManti-senseprimers0.5μ1お よ び 蒸 留 水 を 加 え,総 量50μ1と し て,94℃1分, 55℃1 分,72.C1分 を30サ イ ク ル 行 っ た. 2ndPCRは1
stPCR product 5μ1にPCR buffer 4.5μ1, 5UTaq
DNA Polymerase 0.3μ1, 10mM dNTPs 4μ1,
20μM sense primer, antisense primer各0.5μ1お
よ び 蒸 留 水 を 加 え,総 量50μ1と し て,94℃1分, 55℃1分,72℃1分 を30サ イ ク ル 行 っ た.増 幅 DNAバ ン ド の 検 出 はlstPCR, 2ndPCR product にlordingbufferを 加 え,3%NuSieveで100V 30分 間 泳 動 し,ethidiumbromideで 染 色 後,紫 外 線 を 照 射 し 確 認 し た. 成 績 PCR法 の 特 異 性 の 検 討 1stPCR産 物 はAH1型(A/kawasaki/76/92, A/yamagata/32/89)で431bp, AH3型(A/ kawasaki/161/94, A/kitakyusyu/159/93)で578 bp, B型(B/kawasaki/47/93, B/mie/1/93)で 329bpにDNAバ ン ド が 検 出 さ れ た(Fig.1).2 ndPCR産 物 はAHI型 で197bp, AH3型 で232bp, B型 で195bpにDNAバ ン ド が 検 出 さ れ た(Fig.
Fig. 1 Detection of PCR product (lstPCR)
Fig. 2 Detection of PCR product (2ndPCR)
AH3 AH1 B AH3 AH1 B AH3 AH1 B primer
2).1stPCR,2ndPCR共 ,各 型 間 で の 交 差 反 応 は み ら れ ず プ ラ イ マ ー の 特 異 性 が 証 明 さ れ た . PCR法 の 検 出 感 度 の 検 討 PCR法 の 検 出 感 度 に つ い て プ ラ ー ク 法 を 用 い 定 量 し た ウ イ ル ス で 検 討 を 行 っ た .AH1型 はl stPCRで90PFU/assey, 2ndPCRで0 .9PFU/ assey, AH3型 は1stPCRで100PFU/assey ,2 ndPCRで1.OPFU/assey,B型 は1stPCRで180 PFU/assey, 2ndPCRで1 .8PFU/asseyで あ っ た. ウ イ ル ス 分 離 陽 性 検 体 とPCR法 と の 比 較 ウ イ ル ス 分 離 陽 性 の 咽 頭 ぬ ぐ い 液23件 は 全 て 分 離 ウ イ ル ス と 同 じ型 の プ ラ イ マ ー に の みDNAバ ン ドの 増 幅 が み ら れ た . ウ イ ル ス 分 離 陰 性 検 体 とPCR法 と の 比 較 イ ン フ ル エ ン ザ 流 行 時 に 採 取 さ れ,イ ン フ ル エ ン ザ 分 離 陰 性 で ペ ア 血 清 で 抗 体 価 の 上 昇 が み ら れ た う が い 液 で は,AH1型 は1stPCRで20検 体 中1 件(5.0%),2ndPCRで17件(85.0%)でDNAバ
Table 2 Results of antibody titer and PCR method (AH1 type)
ン ドが 検 出 さ れ た(Table 2) .AH3型 は1stPCR で19検 体 中3件(15 .8%),2ndPCRで15件 (78.9%)でDNAバ ン ド が 検 出 さ れ た(Table 3).B型 で は1stPCRで7検 体 中3件(42 .9%), 2ndPCRで6件(85.7%)でDNAバ ン ドが 検 出 さ れ た(Table 4) .合 計1stPCRで46検 体 中7件 (15.2%),2ndPCRで38件(82 .6%)がPCR陽 性 で あ っ た.ま た,PCR陽 性 検 体 に つ い て 抗 体 上 昇 が み ら れ た 型 とPCRでDNAバ ン ド が 増 幅 さ れ た 型 は 全 て 一 致 し た . PCR陽 性 は 発 病 後2∼9日 ま で に 採 取 さ れ た 血 清 で,1stPCRで 陽 性 で あ っ た7件 は す べ て 急 性 期 の 抗 体 価 が32倍 以 下 で あ っ た .ま た,急 性 期 の 抗 体 価 が32倍 以 下 か ら256倍 ま で,抗 体 価 の 比 較 的 高 い 検 体 か ら も,DNAバ ン ドが 検 出 さ れ た . 考 察 今 回,迅 速 か つ 高 感 度 の 検 査 法 と し てNested-PCR法 に よ る イ ン フ ル エ ン ザ ウ イ ル スRNAの 検 出 を ワ ク チ ン 株 を 用 い て 行 っ た と こ ろ,検 出 感 度 は 各 型 で,1stPCRで90∼180PFU/assey, 2nd PCRで0.9∼1.8PFU/asseyで あ っ た .こ の こ と 感 染 症 学 雑 誌 第71巻 第6号
Table 3 Results of antibody titer and PCR
method (AH3 type)
Table 4 Results of antibody titer and PCR method (B type)
か ら検 出感 度 は細 胞 培 養 法 に比 べ,極
め て高 い も
の と判 断 さ れ る.そ
こで 血 清 抗 体 価 の 上 昇 が み ら
れ た が 分 離 試 験 陰 性 で あ った46検 体 に つ い て
Nested-PCR法
を用 い た と こ ろ38件(82.6%)か
ら
イ ン フル エ ンザ 遺 伝 子 が検 出 さ れ た.そ
の うち7
件(18.4%)は1stPCR産
物 で もDNAバ
ン ドが検
出 され た.こ
れ ら の検 体 に共 通 す る こ とは急 性 期
の抗 体 価 が32倍 以 下 で,こ の こ とか ら感 染 初 期 に
採 取 され た もの で あ る と推 定 され る.イ
ン フ ル エ
ン ザ は感 染 初 期 に多 量 の ウイ ル スが 咽 頭 か ら採 取
さ れ る11)が,凍結 融 解 に よ って 不 活 化 され,分 離 率
が 低 下 す る こ とが あ る.今 回 用 い た検 体 は医 療 機
関 か ら凍 結 保 存 され て搬 入 され た た め,検 体 中 の
ウイ ル ス が 失活 して い た こ とが 考 え られ る.ま た,
検 体 採 取 が,発 病 後9日
目 で もPCR陽
性 の も の
が み られ た.採 取 時 期 が 遅 い場 合,ウ
イ ル ス 抗 体
複 合 物 が 形 成 され 細 胞 で の ウ イ ル ス分 離 が 陰 性 に
な る可 能 性 が あ る.PCR法
で は保 存 状 態 が 悪 く,
ウ イ ル ス が 失 活 して し ま っ た検 体,ま
た,ウ
イ ル
ス抗 体 複 合 物 が 形 成 され,ウ
イ ル ス 分 離 が 困難 な
もの で もイ ン フ ル エ ンザ ウ イ ル ス のRNAを
検 出
し,同 時 に血 清 型 別 が で き る利 点 が あ る.
近 年,ア
マ ン タ ジ ン,リ マ ンタ ジ ン等 抗 ウ イ ル
ス剤 が イ ン フル エ ンザ の 治 療 や 事 前 投 与 に よ る予
防 に有 効 で あ る と報 告 さ れ て い る12)13).今回 用 い
たNested-PCR法
で は検 体 が 搬 入 さ れ た 翌 日(約
24時 間)に
イ ン フル エ ンザ ウイ ル ス遺 伝 子 を検 出
す る こ とが で き,早 期 診 断 に利 用 す る こ とが で き
る.こ の こ とか ら イ ン フル エ ンザ ウ イ ル ス を迅 速
に検 出 す る こ との で き る本 方 法 は,早 期 診 断 に有
用 で あ る と言 え る.ま た,イ
ン フル エ ンザ 感 染 時
に お け る脳 症 患 者 の髄 液 か らPCR法
に よ る イ ン
フル エ ンザ 遺 伝 子 の 検 出 が報 告 され,イ
ン フル エ
ンザ の 全 身 感 染 に よ る 中枢 神 経 症 状 との 因 果 関 係
が解 明 され つ つ あ る14)15).本法 は イ ン フル エ ン ザ
脳 炎 時 の髄 液 や 全 身 感 染 時 に お け る各 臓 器 等,ウ
イ ル ス 量 が 少 な い検 体 か らの遺 伝 子 検 出 も可 能 で
あ り,こ の方 法 は,今 後,生 体 内 の ウ イ ル ス の 増
殖,そ
の 分 布 等 を解 明 す る う えで 有 用 な もの とな
り う る と考 え られ る.
本論文 の要 旨は第44回 日本 ウイルス学会総会(1996年10
月)に おいて発表 した.
文
献
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Nested-Polymerase
Chain Reaction
Hideaki SHIMIZU1), Sumi WATANABE
& Mitsunobu IMAI2)
Rapid Detection of Influenza Virus A (AH1, AH3) and B by
Nested-Polymerase
Chain Reaction
Hideaki SHIMIZU1,
Sumi WATANABE
& Mitsunobu IMAI2)
1)Kawasaki City Institute of Public Health2)Kanagawa Prefectural Public Health Laboratory
