尿路感染症起炎大腸菌の表現型と大腸菌諸抗原の生体に及ぼす影響

全文

(1)博士学位論文. 尿路感染症起炎大揚菌の表現裂と大腸菌諸抗原の生体に及ぼす影響. 近畿大学医学部博士医乙 1 ぷ. l. 小児科学教室. 森口直彦.

(2) 博士学位論文. 尿路感染症起炎大腸菌の表現型と大腸菌諸抗原の生体に及ぼす影響. 平成. 3年 1 2月. 近畿大学医学部小児科学教室 (指導:牧. 淳教授). 森口直彦.

(3) 尿路感染症起炎大腸菌の表現型と大腸菌諸抗原の生体に及ぼす影響. 近畿大学医学部小児科学教室森口直彦 (指導:牧. 淳教授). Antigenic phenotypes o f Escherichia c o l i i s o l a t e d i n u r i n a r yt r a c t i n f e c t i o n s and t h e e f f e c t o f t h e s e antigens against h o s t defense function. Naohiko M o r i g u c h i Department o f P巴d i a t r i c s， Kinki University School o f Medicine， Osaka， ]apan CDirector:Prof . Sunao Maki). ABSTRACT We analyzed t h e r e la t ionship b e tween t h e a n t i g e n i c phenotypes o f E .c o l i. and c l i n i c a l diagnosis， and t h e i n t e r a c t i o n between t h巴. b a c t e r i a l a n t i g e n s and h o s t defense f u n c t i o n . E .c o l i. which. possessed t h e 01 a n t igen were i s o lated more f r e q u e n t l y f rom p a t i e n t s with a c u t e and c h r o n i c p y e l o n e p h r i t i s than from t h e normal c o n t r o l s Cp(O.05).. Kl p o s i t i v e or P-fimbriae (P-f). p o s i t iv e E. c o l i were more f requent 1y found i n u r i n e from p a t i e n t s with a c u t e pyelonephritis than i nt h e normal c o n t r o l s C e i t h e r p< 0 . 0 0 5 ) .. E .c o l i which p ossessed t h e 01 antigen，. tended t oe x h i b i t P-f..

(4) Analysis o f t h e immune b a c t e r i o l y t i c a c t iv i t i e s by normal pooled s e r a showed t h a t t h e K1p o s i t iv e s t r a i n s were more r e s i s t a n t than t h e standard s t r a i n .. However， t h e r e was no r e la t ionship. i a by normal polyb e tween t h e d e g r e e o f t h e phagocyto s e d b a c t巴r morphonuclear l e u k o c y t e (PMN) and t h e k i n d o f O-or K-antigen. To compare t h e s t i m u l a t i v e a c t i v i t y o f t h e b a c t e r i a l a n t i g e n s a g a i n s t t h e PMN's c h e m i lumin e s c e n c e (C.L . ) ，. various k i n d s o f 0. antigen and K a n t i g e n were e x t r a c t e d from t h e s e E .c o l i . Antigen 044， from t h e enteropathogenic E .c o l i (EPEC) a nd 01 from t h e pyelonephritopathogenic s t r a i n stimulated normal PMN more s i g n i f i c a n t l y and showed a h i g h e r peak C .L. than t h e o t h e r kinds o f 0 antigen( p<0.05). Antigen K74 from EPEC and K1 from a p y e l o n e p h r i t o p a t h o g e n i c s t r a i n r e v e a l e d ah i g h e r stimulative e f f e c t t h a n antigen K7 from t h e standard s t r a i n (p< 0 . 01). These f i n d i n g s i n d i c a t e t h a t t h e pyelonephritopathogenic s t r a i n s h a t t h e s e s t r a i n s belong t o a small number o f c lo n e s， and t produce more s e v e r e inflamatory l e s i o n s .. n t i g e n . K1 Key words: urinary t r a c t i n f e c t i o n， P-fimbriae， 0 a o s t d e f e n s e f u n c t i o n antigen， h. 一. 2-.

(5) 緒言尿路感染症 C urinary t r a c t i n f e c t i o n :UTI)の起炎菌としてグラム陰性稗菌，なかでも大腸薗の占める割合は大きし、これらの大腸菌には， p線毛をはじめ特定の O抗原， K抗原などの表現型を示すものが多いい， 4 なかでも P線毛大腸菌は，腎尿路粘膜細胞レセプターへの接着性から，近年， UTIの原因菌として注目されており，著者等 h もその事実を確認した . しかし，大腸菌の O 抗原，. K 抗原が UTI の発症にどのように関与するかについては，. 未だ十分に解明さ. れていない. 本研究では，小児 UTI 患者の尿から分離された大腸菌の P 一線毛. o抗原，. K1抗原の検査を行い，臨床病型との関係を検討した . さらに， UTI 感染症の i及ぼす影響について研成立との関係を検討するために，これらの抗原が生体ζ 究した.. 対象と方法. 1 . 病型分類研究対象とした患者は，. 1985年 1 0月から 1989年 1 0月までの聞に近畿大学. 0例(男 1 8例，女医学部付属病院小児科で加療を受けた大腸菌性 UTI患者 5 32例，年令 : 生後 1ヶ月 - 20才，中央値 6才 ) で，対照 i とは，現症にも既往にも腎疾患を認めず，スクリーニング尿細遺培養で大腸 l 若が c ontamination として得られた 28例(男 1 4例，女 1 4例，年令 : 生後 1ヶ月 -1 6才，中央値. 4才 ) を用いた . UTI患者の臨床病型は， K a i js e r6 の分類を一部変更して以下のごとく定義した.. A) Acute p y e l o n e p h r i t i s CAPN):UTI の既往がなく，菌尿 (105 colony forming u n i t CCFU)/mt以上〕と 3 8 . 5' C 以上の発熱を伴い， ① 赤沈値 25 mm/h以上か， CRP2 . 0 m g / d t ι ι上， ② 一過性尿濃縮力の低下 (800mOsm/l. 以下) ， ③ 背部痛または腎領域の痛み，の 3項目のうち 1項目以上を伴うも. の. B) Chronic p y e l o n e p h r i t i s CCPN) 菌尿があり， ① UTI の既往，. -3-. ②尿細.

(6) 管機能障害 ( 持続性の尿濃縮力の低下または左右 15%以上の機能の差 )， ③レントゲン上の腎実質の変化，④腎生検組織に間質の細胞浸潤を伴うもの，の 4項目のうちいずれか 1項目以上を伴うもの . C) Acute c y s t it i s (AC) :菌尿があり，尿沈 j 査に白血球が 5/high per f i e l e d (HPF)以上の膿尿と排尿痛・頻尿を認め，体温 3 8 . 5' c未満，赤沈値 25mml. h未満あるいは CRP2 . 0m g / d e未満，腎尿濃縮力正常，背部痛・腎領域の痛みを伴わないもの. D) Non s p e c i f i c urinary t r a c t infection(NS-UTI) 明らかな UTIの. 臨床症状ならびに所見を認めるが， A) ， B) ， C) の基準に入らないもの . E) Asymptomatic bacteriuria (ABU). 菌尿が認められるが，膿尿がなく，. とも， A) -D) の UTIの症状，検査所見を認めないもの . 現症にも既往 i 各病型の男女比，症例数，年令を Table 1I 乙示した. Tablc 1. Profiles o f t h e patients with various urinary t r a c t infections. c l i n i c a l diagnosis. SEX. t o t a l. Age (median). 6. 12. 1M-10Y (2Y) 7M-20Y (10Y). male. female. A) APN. 6. B) CPN. 4. 1 5. 1 9. C) AC. 2. 5. 7. 3Y-l1Y (5Y). D) NS-UTI. 2. 3. 5. 7Y) 5M-12Y (. E ) ABU. 4. 3. 7. 1M-11Y (9Y). A b b r e v i a t i o n APN:a c u t ep y e l o n e p h r i t i s CPN:c h r o n i cp y e l o n e p h r i t i s AC:a c u t ec y s t i t i s N S U T I:n o ns p e c i f i cu r i n a r yt r a c ti n f e c t i o n ABU:a s y m p t o m a t i cb a c t e r i u r i a M :m o n t h so l d Y :y e a r so l d N u m b e r si n d i c a t et h en u m b e r so fp a t i e n t s. 2 . 大腸菌の分離，保存，培地乙細菌尿からの菌の検出は，清潔中間尿採取法 7 で採取した尿を 3時間以内 i 検査室で Auto Micro Biosystem(VITEK社， Missouri， USA) によって簡易定量培養を行った.. -4-.

(7) ( 1 ) 薗の保存. 乙は， L uria培地 8で 37"C. 一夜培養後，等量尿から分離した大腸薗の保存 i の滅菌グリセリン(和光純薬工業株式会社，大阪)と混合し，. -80"Cで、凍結保. uria寒天培地日で 37"C一夜培養を 2回くり返した . 大腸存した.使用時には L 菌の数日間の保存には， Casitone 半流動培地~ 1 < :菌を穿刺して 3 7"C 一夜培養後，室温に置いて保存した. ( 2 ). 使用した大腸菌. 実験には， UTI患者から分離した P-fimbriae(P-f) 陽性株 b で国立予防衛生研究所に依頼して血清型を同定した菌のうち， 01:H7:K1(ー) :F1 1: ー ) ， 02:H (一) :K1(一) :F9 : s-hemolysin( + ) ， 04:H (一) hemolysin(. :K1(一) :F7: α一. s-hemolysin( + ) ， 06:H (ー) :K1(一) :F 1 2:. hemolysin(一)， 075:H (一) :K1:F 7:hemolysin(一) (以下，それぞれ U-1， U-2， U-3， U-4， U-5と略記 ) ，さらに国立予防衛生研究所 ( 予防研 ) から分与された株 01H7K， l. 02H4K1 (以下，それぞれ Y-， l. Y-2 と. 略記) ，大阪大学微生物研究所 ( 阪大微研 ) から分与された株の 044H18K74 (腸管病原大腸菌，以下 B-1と略記)， 014H (一)K7 (標準株，以下 B-2 と略記)の 9株を使用した . Y1， Y-2 ， B1 ， B-2の. αー. ， s-h emolysinの. 有無は坂崎等の方法 10 により判定し， P-fの有無は蛍光抗体法 11 で判定した. ( T a b l e 2) .. -5-.

(8) T a b l e2. D e t a i l e dp r o p e r t i e s o f E. c o l i u sed i n t h e p r e s e n t study. み烈:. U-1. U-2. U-3. U4. U-5. Y-1. Y-2. B-1. B-2. O. 01. 02. 04. 06. 075. 01. 02. 044. 014. K1. K1. K1. K74. K7. H7. H4. H18. H(一). a(+). a(+). α(ー). a(ー). K. 司. K1(一) K1(一) K1(ー) K1(一). H. H7. H(ー). H(ー). H(一). H(ー). F. F11. F9. F7. F12. F7. α(ー). a(ー}. α(+). α(ー). a(ー). 日(ー). s(+). s(+). s(ー). (一) s(一) s(ー) s(一) s(一) s. (+). (+). (+). (+). hemolysi円 P-fimbriae. (+). (一). (ー). (+). (+). U1-U5 w e r es t r a i n s from p a t i e n t sw i t hu r i n a r yt r a c ti n f e c t i o n .a n dt h e i rp h e n o t y p e sO .K .H .F .a n d h e m o l y s i nw e r ed e t e r m i n e db yD r . T . S a k a z a k i .t h eN a t i o n a lI n s t i t u t eo fH e a l t h .D e p a r t m e n to f e r es t r a i n sp r o v i d e d B a c t e r i o l o g y . V 1 . Y-2w e r es t r a i n sp r o v i d e db yD r . T . S a k a z a k. i B 1 . B・2w b yD r . T . M i w a t a n i .D r . T . H o n d a .R e s e a r c hl n s t i t u t ef o rM i c r o b i a lD i s e a s e . Osaka U n i v e r s i t y P f i m b r i a e C P f l was i n d e n t i f i e db ya i m m u n o f l u o r e s c e n ta s s a yw i t ham o n o c l o n a la n t i b o d ya g a i n s tt h e P _ f " . T h ep h e n o t y p eo fh e m o l y s i no fY 1 .Y 2 .8 1 .B 2 was i n d e n t i f i e db ya method o fT . S a k a z a k i " .. 3 . 抗血清. 0， 1 0 2. 075の特異抗血清は，それぞれ. u， 1. U-2 . U-5の大腸菌を. K a i js e r6 の方法に従って家兎ζ i免疫して作成した.すなわち， Luria培地 8 で 2 0 ' C， 2気圧で 6 0分加熱処理し， 0.15M/l NaClで洗一夜培養した細閣を 1 . 5 . 1 .0 . 1 .5 . 2 . 0x1 09 CFUI m Rの菌浮遊液を作成し浄後， 0.15M/l NaCl で 0 . 5x1 09 CFUI m R ，た.初回は 0. 1mRを成熟雄性日本白色種兎(1 . 8 0 0 g~2.200g). ζ i静注し，以後 2週毎，菌濃度を1.0 . 1 .5 . 2 . 0x1 09 CFU/ m Rと漸増しながら lmRず、つ計 4回静注して免疫した . 最終静注後 l週で採血した.また， U-5 の大腸菌の生菌を用いて抗大腸菌 0特異抗血清と同様に家兎を免疫し，抗大腸 .c o l i 0 a n t i 菌 075Kl血清を作成した .04. 06の特異抗血清は Bacto-E. serum( D i f c o Laboratories， Michigan， USA)を使用した. Kl抗原の有無は神奈川県衛生研究所. 松崎稔先生から供与して頂いた抗 B群髄膜炎菌家兎血. 清を用いた.. -6-.

(9) 4 . 大腸菌の抗原検査尿から分離した大腸菌の各種 O 抗原の有無は，. 109 CFU/meK 調整し， 120'C， 1時間加熱後，. 0.15M/1 NaCI で大腸菌を 0.15M/ I NaClで 2回洗浄し. 2で判定し，血清 160倍以上の希釈で凝集のみられた菌液を用いて菌体凝集法1 たものを陽性とした . また K1抗原の有無は，生菌の大腸菌を使った菌体凝集法で判定し，血清 80倍以上の希釈で凝集のみられたものを陽性とした . P-f 抗原は，既報 11 のように，当科で作成したモノクローナル抗体を用いた蛍光抗体法で判定した.. 5 . 多核白血球の分融と pooled serumの作成多核白血球は，健常成人・ボランティア C1 6人，. 20~ 34才，男 1 3人，女. 3人 ) の静脈からへパリン採血し〔血液 10meK対し，. 0.05mtの / ボへパリン. (ノボ・ノルディスク A/S，デンマーク)を使吊した)， Mono-Poly. Resolving MediumCFlow Laboratories， I r v i n e， Scotland) を用いて分離し，ハンクス液(フェノールレッド不含，. 日水製薬，東京 ) に 1X1 06 または. 107! J 皿 f ，I 乙調整した.測定 i とは，多核白血球含有量が 95%以上でトリパンブルーの染色では 959 ぢ以上の v iable c e l l を有するものを実験に使用した.. pooled serumは，当院血清検査室で使用した 20~ 30人の残余血清を採血後 3時間以内に pool して，， 1500rpm. 20分遠心して上清を取り，. これを一つ. のロットとした . 1991年 2月 24日から 2月 28日の聞に計 4種のロットが得られた. pooled serumは -80'C以下で保存し. 1ヶ月以内 ζ i使吊した .. 6 . 大腸菌 i 乙対する多核白血球の倉食能と血清の溶菌反応予防研からの. ， l された B-. Y-1， Y-2，. UTI から分離された U-5，阪大微研から分与. B-2の大腸菌を . Miller ら 1 3の方法 i と従って 3H標識した . す. なわち. 3H-Lysine C37MBq/m~ ， Amersham ]apan. 東京 ) 1m eを加えた. Luria培地 250meK. BBL培地 ( 日本ベクトン・ディッキンソン，大阪 ) で. 37'C一夜培養した大腸菌を接種し . 3 7 ' C . 一夜培養した . 3H標識菌は 0 . 1 5MI NaCI で洗浄して 8X108 CFU/mel乙調整した. 一. 7-.

(10) 多核白血球の貧食指は Pet巴rson ら14 の方法 i 乙準じた. pooled serum をハ. 07/ m eの濃度 i 乙浮遊した.この浮遊ンクス液で 8%1乙希釈し，多核白血球を 1x1 乙3H標識した菌液 0 . 2m eを加え，液1.8叫 i この混合液から混和後 O分，. 1 0分，. 37' C， 3 0分間:覚伴・反応させた.. 20分，. 30分，. 45分の時間に 0 . 1m eずっ. とり，氷中の 0 . 1 5M/I NaCI 10meを加え，撹伴後1， 500rpm 10分遠心し，沈誼を 0.15M/I NaCIで 2回洗浄した . 沈 I 査に蒸溜水 0 . 5 m eを加えて 30分静置して細胞溶解し， ATOMLIGHT (DuPont， Massachusets， USA) 4meと混. cintilation Counter (Pharmacia Wal 1ac，和し， LKB1219 Liquid S Turko， Finland) で貧食された細菌の isotope を測定した . また，反応前ζ i，別i 乙菌と多核白血球の混合液から 0 . 1r n Rをとり，遠心せずに蒸溜水を 1me加え，. ATOMLIGHT 4meと混和し， i n i t i a l mixture として液体シンチレーションカウンターで測定し，貧食率を以下のように計算した. 貧食率 = (白血球沈漬の isotope の c pmlinitial mixture の cpm)x100 血清の溶菌反応に対する抵抗性は， Leying ら15の方法を応用した . 米増 16の. . 15M 1 1 NaC1 (0.15M1 1 NaC1溶液に MgCh ・6H20 記載に従って， Mg加 0 を 0.05%溶解 ) で pooled serumの 5%， 1()%， 15%， 20%， 25%， 40%，. 50%の培菌液を作成した.また， pooled serumを 56'C， 30分で非働化し，同じ濃度の非働化希釈血清を作成した. 0 . 1 5I ¥ l l / l NaCIで洗浄した 3H-Lysine 標識大腸薗を，終濃度 8X 1 08 CFU/meとなるように Mg加 0 . 1 5M!I NaCIあるいは各濃度の溶菌液か非働化希釈血清 0 . 5 m eζ 1 再浮遊し. 2時間 3 7'C加温して. 0， 000rpm 1 0分遠心し，上清 0 . 5r n Rl L : ATOMLIGHT 4 反応させた.続いて 1 M加え，上記と同様に液体シンチレーションカウンターで測定した.溶菌液ま. たは非働化希釈血清の上清のカウン卜数と， Mg加 0 . 1 5M/I NaCI浮遊液上清のカウント数の差を，溶菌により上清に放出された isotope の値とした.別に，. Mg加 0 . 1 5I ¥ 1 1 / 1 NaCIO.5mei乙浮遊した菌液 (8x108! m e )I LATOMLIGHT 4meを加えて測定した isotope のカウントを t o t a l b a c t e r i a l cpmとし，溶薗率 =(上清 i 乙放出された i s o tope の cpm!total b a c t e r i a l cpm). X. 100. とした.貧食反応，溶菌反応は，いずれも重複して実施し，その平均をとった.. -8-.

(11) 7 . 0 抗原， K 抗原の分離・精製. O 抗原の分離は， Bolanos ら17 の方法に従って. Luria培地 8 で培養して集 o l i の乾燥語体 (lOg) から粗抗原を p henol 抽出，めた E.c. 沈殿で得た.沈遣は O.15M/I. 9 9 . 5% e t h a n o l. NaCIζ I溶解し. cetavlonCSIGMA， Missouri. USA) を 2%の濃度で加えて上清から O 抗原を抽出した. K 抗原の分離は， Kasper ら 18 の方法 i 乙従った.大腸菌を Casamino a c i d 0l i t e r で培養し，遠心後，その上清を Amicon mediumCWatson19 の変法 18) 1. 10 Ultra F i l t r a tion(Amicon Corporation， Massachusetts， USA) Diaf を用い， PM-30 membrane CAmicon Corporation) を使用して 500meまで. . 3労の濃度で cetavlonを加えて沈殿物を得た . O.9M/I 濃縮した.この液に 0 CaCb loomeで溶解後. 3倍量の 9 9 . 5% e t h a n o lを加えて再沈殿し，精製抽出. した. 分離精製した O抗原. K抗原の抗原性は感作赤血球説集反応、 20 Micro一. Ouchterlony法 21 で検討した . 感作赤血球凝集反応は，羊赤血球 ( 大阪大学微 0 μ: g / m e の O 抗原または K 生物研究所，大阪)を 0.15M/l NaClで溶解した 5 抗原溶液に 2%の濃度で浮遊し，. 37'C， 1時間の感作を行った . 0.15M/l. NaClで 3回洗浄後. 2%の感作赤血球浮遊液とした . 抗血清を 50μlずつ， 0.15M/l NaClを用いてプレート U リジット(三光純薬工業株式会社，東京) で連続倍数希翫し，これに感作赤血球 50μlを滴下して撹梓し. 1時間室温静. 置後，凝集の有無を判定した . Micro-Ouchterlony法は， b a r b i t a l b u f f e r. CpH8 . 6 . ヤトロン社，東京)で 0.8% Agar Noble (Difco Laboratories) のゲ lレプレートを作成し，径 2mmの wel1を中央ζ i 作り，その周辺に w e l l間. 3mmで同じ径の w e l l を作成した.中央の w e l l1 1:は抗原液 500噌 l m eを 10μl 入れ，周辺の w e l lI とは等量の坑血清 (0 . 1 5M/I PBSで 3倍希釈)を入れた.. 8 . 0 抗原， K 抗原の蛋白量，糖質などの測定. a c t i o n V， BSA，和光純薬工業蛋白量の測定は，ウシ血清アノレブミンCfr tandard として， protein a s s a y k i t (Bio-Rad， Richmond. 株式会社)を s USA) を用いた色素法で行った. hexose の測定は，ブドウ糖 ( 和光純薬工業. -9-.

(12) 株式会社)を s tandardとしてフェノー lレ・硫酸法 22 で行い，シアル酸の測定は， N-acetylneuraminic a c i d C生化学工業株式会社，東京 ) を standard としてレゾノレシン試薬による定量法 23 を用いて行った . また，核酸の混入は，蒸. 溜水 i 乙溶解した抗原液 100μg血tを光路 l叩の石英セノレを用いて，波長 230nm，. 260nm， 280nmで吸光度を Double Beam Spectrophotometer UV-190 (島津製作所，京都)で測定した. Endotoxin活性はトキシカラーシステム (生化学工業株式会社，東京)で測定した.. 9 . 0 抗原， K 抗原を刺激物とした時の多核球ルミノール依存性 Chemiluminescence CC.L.) の測定多核球 C.L.の測定は， Pico-Lit巴 jレミノメーター CPackard， Z urich，. Switzerland) を用いて既報 24 の通りに行った . 多核白血球にトリス塩化アンモン溶血の操作を加えた後，. 1x106血 I ftに調整した . 多核球浮遊液 3 00μ1I 乙5 0μl. のl uminol CBoehring 巴r M annheim， West Germany)液を加え，反応管で. 3rc， 1 0分静置した . 続いて各濃度で 0.15M/l NaCl 1 < :溶解した O 抗原または K抗原を刺激物として 5 0 μ l加え，反応カーブの peak C. L. 値を測定し，単位は c o u n t s per minutes CCPM)で示した.反応はすべて重複して行い，幾何平均値をとった.. 1 0 . 統計学的検討とは， STAT FLEX NEC PC-9801C日本電気，東京) 統計学的有意差検定 i. ney検定などを計算した . を用いて，が検定， Mann-Whit. 結果. 1 . 実験に使用した大腸菌の抗血清の検討大腸菌の U-1から作成した抗大腸菌 01家兎血清， U-2から作成した抗大腸菌 02家兎血清， U-5から作成した抗大腸薗 075家兎血清は，いずれも該当する O抗原を持つ大腸菌 U-1， U-2， U-5の加熱死薗に対して，. 1 ， 280倍の希. 唱'A. n u.

(13) 釈血清まで凝集を示した . Difco 社製抗大腸菌 0 4，0 6家兎血清は，該当する. O抗原を持つ大腸菌. u-3， U -4 の加熱死薗 ζ i いずれも. を示した . しかし，いずれの抗血清とも 20倍以. 640倍の希釈まで凝集. kの希釈では，他の O 抗原を. 持つ大腸菌の加熱死菌との聞に凝集を認めなかった . なお，抗 075 K 1家兎特 560倍まで凝集を示した . 異抗血清は U-5生菌に 2，. また，抗 B群髄膜炎菌血清では， K1抗原保有大腸菌である U-5 ， Y-1 ， Y-2 の生菌 ζ i 対して 320倍の希釈まで凝集を示したが，. K l抗原を持たない. U - 1， U -2， U -3， U -4， B -1， B -2 とは 20 倍以上の希釈血清では凝集を. 認めなかった CTable 3). Table 3. Bacterial. agglutination titers of the. antisera used in the present study Anti-O s e r a ' s t r a l n s antlserum. U.2. U 1. U-3. U・4. U・5. X20↓. X20↓. X20↓. X1 ，2 80 X20↓. Y-1. Y-2. B 1. B 2. X20↓. X20↓. E . c o l i 01 antiserum. 8 0 x20↓ x1，2. E . c o l i 02 antiserum. X20↓. X1 ，2 80 X20↓. X20↓. X20↓. X20↓. X1 ，2 80 x20↓. X20↓. E . c o l i 04 antiserum (Oifco) E . c o l i 06 antiserum (Oifco) E . c o li075 antiserum. X20↓. X20↓. X640. X20↓. X20↓. X20↓. X20↓. X20↓. X20↓. X20↓. X20↓. X20↓. X640. X20↓. X20↓. X20↓. X20↓. X20↓. X20↓. X20↓. X20↓. X20↓. X1 ，2 80 X20↓. X20↓. X20↓. X20↓. ・. B a c t e r i a ls u s p e n s i o n s( 1 0 CFU/m l )w e r eh e a t e dt o1 2 0C f o r 1h o u r 'a n dw e r em i x e dw i t hs e r i a l l yd i l u t e da n t i s e r a 0. Anti-K1 serum' U-2. U-3. U-4. U-5. Y-1. Y-2. B 1. B 2. X20↓. X20↓. X20↓. X320. X320. X320. X20↓. X20↓. U-1 N e i s s e r l am e n i n g i t i s group B antiserum. l×20↓. ・. L iv i n gb a c t e r i a ls u s p e n s i o n s( 1 0 CFU/ml) werem i x e dw i t hs e r i a l l yd i l u t e da n t i s e r a. • N u m b e r si n d i c a t et h ed i l u t i o nt i t e r so fa n t i s e r a. 2 . 尿分離大腸菌の抗原型尿から分離した大腸菌 78株のうち，. 120'C加熱により自己凝集した rough. 株は A B Uの 7株中 l株， control の 28株中 2株の計 3株に認められた . 0抗 -b 唱E.

(14) 原型はこれら rough株を除いた 7 5株について， K1抗原， P-f 抗原は 78株全株について検討した.. 01，02，04，06，075の 5種の抗原のうち， 01は APNで 3 /12株， CPN で5 /19株と， c o n t r o l (1/26株)に比べて有意に多く検出された(し、ずれも. p<0 . 0 5 ) . K 1抗原は APNで 5 /12株と c o n t r o l の 1128 株 i 乙比べて有意に多. /12株と， c o n t r o l の 4/28 く認められた (p<0.005). P-f 抗原は APNで 7 株よりも多くみられた (p<0.005) .これら 5種の O 抗原のうち一つを保有している大腸菌の中で P-f 抗原を同時に保有している大腸菌は， APNで 4 /12 株と， c o n t r o lの 2 /26株 i 乙比べて有意に高頻度であった ( p<0 . 0 5 ). また，. K1抗原を同時 i と保有している大腸閣は， APNで 3 /12株と， c o n t r o lの0 /26 株i 乙比べて多く認められた ( p<0 . 0 1 ) (Table 4) . o l i o btained from Table 4 Numbers o f s e r o t y p e s o f E. c t h e p a t i e n t s w i t h UTr and normal c o n t r o l 0 1. 02. 04 2. A) APN. 06. 。. a s e s ) ( 1 2c. 3. B ) CPN. ( 1 9c a s e s ). C ) AC ( 7c a s e s ) D) NS-UTI ( 5c a s e s ) E ) ABU ( 7c a s e s ) F )c o n t r o l ( 2 8c a s e s ). 本* 1. 。。。. l : J。 *1P<O.05. 2. *2P<O.Ol. 2. 3. K 1 0 7 5. rough. P f a n t l g e n. 。。。。。。 2. o n eo ff i v e oantigens w i t hP f. o n eo ff i v e oantigens 1 w i t hK. P f w i t hK 1. 2. 2 *3. 求. 3. *1. キ2. 2. *3P<O.005. A b b r e v i e t i o n U T I:u r i n a r yt r a c ti n f e c t i o n APN: a c u t ep y e l o n e p h r i t i s CPN:c h r o n i cp y e l o n e p h r i t i s AC:e c u t ec y s t i t i s N S U T I:n o ns p 田 i f i cu r i n a r yt r a c ti n f e c t i o n ABU:a s y m p t o m a t i cb a c t e r i u r i a P f:P f i m b r i a e. 尿から検出された大腸望の表現型について. 5種の O 抗原， K 1抗原， P-f. 抗原の 3種の抗原相互の関係を見ると， 01抗原と P-f抗原 i と有意の相闘が見とは有意な相られたが (p<0.05) ， 0 抗原と K1抗原， K1抗原と P-f 抗原 i 関は認められなかった (Table 5) .. 。。。. EA. 唱. 円ノハ︼.

(15) Table 5 Correlation between various antigens o fE .c o l z. ， : l. P f (n). K1 (n) 01 (n=9) 02 (n=4). O. 司. K1 (+) (n=12). 5. 7. K1 (一) (n=66). 2 1. 45. *. *. 04 (n=6). 豆. P f ( n ( ) +) P f (ー) (n). 06 (n=10) 075 (n=5). 2. rough (n=3). o. other (n=41 ). 7. *P く0 . 0 5 P f:P f i m b r i a e. 2. 。 12. T h ed a t aa r ec o m p a r e db e t w e e ne a c h0 a n t i g e n a n dK 1， a n db e t w e e ne a c l i0 a n t i g e na n dP f ， a n db e t w e e nK 1a n dP f .. n:n u m b e r s. 3 . 大腸菌の標識率 Y-1 ， Y-2， U-5， B-1 . B-2の 5株の大腸閣の 3H-Lysine 標識率は， 5. それぞれ 2 . 4x10- cpm/CFU， 1 .4x10-5cpm/CFU， 1 .2x10-5cpm/CFU， 0 . 9 5. x10- cpm/CFU， 1 .9x10-5cpm/CFUであった CTable 6) . Table 6 3H-labeling indexes o f various E .c o l i s t r a l n. Serotype. L a b e l i n gi n d e x (cpm/CFU). Y1. Y-2. 01:H7:K1. 1 02:H4 K. . 4X 1 0 .5 2. 0 .5 1 ι X1. U-5. 8 1. 8 2. 0 7 5 :H (ー):K 1 044:H18:1 く7 4 0 1 4 :H(一):K7 I P f (+) P f (一) P f (一) P f (十) P f (+) ロ. h e m o l y s i n( +) ローh e m o l y s i n (+) h e m o l y s i n (一) h e m o l y s i n (一) h e m o l y s i n (一) ・. 1 . 2X 1 0 .5. 0 . 9X 1 0 .5. 1 . 9X 1 0 .5. A ni n n o c u l u mo fE . c o l i a n d3 7MBqo f' H L y s i n ew e r em i x e di n t o2 5 0m lL u r i ab r o t hm e d i u ma n di n c u b a t e da t 3rc o v c r n i g h t T h eb a c t e r i a ls e d i m e n tw a so b t a i n e db yc e n t r i f u g a t i o na t1 0，0 0 0r p mf o r1 0m i n u t e s A f t e rw a s h i n gt h r e et i m e sw i t hs t e r i l e0 . 1 5M/ 1 トJ a C ，I t h eo r g a n i s mw a sf i n a l l ys u s p e n d e di n3 0m lo fs t e r i l e 0 . 1 5M/ 1N a C I (8X1 0 'CFU/m l ) .. qd.

(16) 4 . 大暢歯の貧食率. B-2株の健康成人 1例からの多核白血球による経時的貧食をみると，白血球 i 乙貧食された菌の cpmは時間とともに増加し，. 30分で最大の cpm(318cpm). を示し，貧食率は 1 7 . 3$ぢであった ( F i g .1) . y-1 . Y-2， U-5， B-1 . B-. cpm. 400. 300. 200. 1 0 0. 。. 1 0. 2 0. 30. 4 5 Time (minutes). F i g .1 Kin e t i c so f human PMNengulfment o f 3H-E.c o l i B-2[014:H (ー) :K7:P-f (+) :hemolysin( 一 )J The mixture o f PMNand 3H-b a c t e r i a l suspension i n 8%pooled serum was incubated a t 37' Cf o r 0， 10， 20，30，o r 45 minutes. 3H incorporated i n t o t h el e u k o c y t e was counted by a l i q u i ds c i n t i la t i o n counter. A 品‘.

(17) 2の，健康成人 6例からの多核白血球による 30分での貧食率は， Y-l株と B 2株は，それぞれ 16.3土 2.0%， 1 6 . 9土 2.8%と，. u-5の 34.3士 4.2%， Y-2の. 28.5士 4 . 5% ， B-1の 30.0: t6.0%I 乙比べて有意に低い貧食率を示した (p< 0 . 01 ) (Table 7) • The percent phagocytosed E .c o l i. Table 7. by normal. 予約 polymorphonuclear leukocyte (. l i l o c ¥ r fg P s n M t r N a 、 ¥n、¥. 8-2 Y-1 U-5 8-1 Y-2 く1 ):K7 8:K74 014:H(一 01:H7:I 02:H4:K1 075:H( ー ):K1044:H1 P-f(十) P-f(+) P-f(+) P-f(ー) P-f( ←) h e m o l y s i n( ) α h e m o l y s i n(+) ah e m o l y s i n( ー ) h e m o l y s i n(+) h e m o l y s i n(一). 28 Y m. 1 4 . 2. 2 2 . 6. 3 7 . 2. 2 1 . 0. 1 9 . 2. 26 Y m. 1 3 . 5. 3 3 . 5. 3 3 . 0. 3 1 . 0. 2 0 . 5. 23 Y f. 1 7 . 2. 2 4 . 0. 3 8 . 1. NE. 1 4 . 8. 33 Y m. 1 7 . 0. 3 2 . 5. 3 5 . 5. 2 7 . 3. 1 4 . 0. 2 5Y m. 17. 4. 30. 4. 2 7 . 6. 3 5 . 2. 1 4 . 5. 28 Y m. 1 8 . 6. 2 8 . 2. NE. 3 5 . 3. 1 8 . 1. mean. : tSD. 1 6 . 3. : t2.0. 3 4 . 3. .5 28. : t4.5. 3 0 . 0. 1 6 . 9. : t2.8. : t4.2. : t6.0. L. 」一一一*一一→. トー*一寸c *P<O.Ol. 一一牢. A b b r e v i a t i o n PMN p o l y m o r p h o n u c l e a rl e u k o c y t e， m:m a l e， f: f e m a l e， Y :y e a r so l d， NE n o te x a m i n e d， SD s t a n d a r dd e v i a t i o n T h ep e r c e n tp h a g o c y t o s e dE. c o t ib yPMN wasc o u n t e di nd u p l i c a t ea h e r3 0m i n u t e si n c u b a t i o na t3 r c T h ec a l c u l a t i o ni sa sf o l l o w s . T h ep e r c e n to fp h a g o c y t o s i so fPMN=(meancpm i nl e u k o c y t ep e l l e t / m e a ncpmo fi n i t i a lm i x t u r e ) X l 0 0. 5 . 大腸閣の溶菌反応 B-2株を用いた pooled serumの 5， 10， 15， 20， 25， 40， 50%の各濃度. 乙における溶菌率は，血清濃度の増加にともなって増加し，血清 20%で peakI 達した . しかし，非働化希釈血清による溶菌作用は，いずれも 5 %前後と低く，血清濃度の上昇に伴う溶菌率の増加は認められなかった CFig.2). Y-1， Y2， U-5， B-1， B -2の 5株について 4種の 20% pooled serum による溶 A. phu. ・守.

(18) %o fb a c t e r i o i m m u n o l y s i s. 7 0. E. 60. 50 40. 3 0 20. 1 0 )(. 。. )(. x. 5. 1 0. 1 5. 20. 2 5. 3 0. 40 5 0 %o fp o o l e ds e r u m. Fig.2 The percent o f bacterioimmunolysis o fE .c o l i B-2 C014:H( 一) :K7:P-f ( + ) :hemolysin( 一 ) ) by t h e various concentrations o f pooled serum. The d i luted pooled serum o r heat i n a c t ivated pooled serum C56'C， 30minutes) was d i l u t e d t o ，1 0， 15， 20.25， 40， and 50%， by 0 .15M/l 5 Na C l containing Mg. poole d serum， X 一 X :heated pooled serum The percent o f bacterioimmunolysis= (mean o f cpmi n supernat巴 Imean cpmo f to t a l bacteria) X 100. ・・ :. 菌率を検討したところ， U-5が 3 . 5: t0 . 6% と最も低く，次いで B-1の 1 4 . 2: t. 1 .8%， y-2の 1 7 . 2土2 . 8労， y-1の 3 4 . 5土1.8%の順であり，いずれも B-2 株の 6 3 . 8士 2 . 8% I L比べて有意に溶菌率が低く，血清抵抗性を示した(し、ずれも. p<0.05) CTable 8).. 。円.

(19) Table 8 The percent bacterioimmunolysis by pooled sera. 話 ; ト. Y-2 8-1 Y-1 U-5 8-2 02:H4:K1 075:H(ー):I 01:H7:I く1 く1044:H1 8 :I く7 4014:H(ー ):I く7 P-f(+) P-f(ー) P-f(+) P-f(+) P-f(ー) h e m o l y s i n( + ) h h e m o l y s i n(ー) α h e m o l y s i n(+) ae m o l y s i n(ー) h e m o l y s i n(ー) 3 6 . 6. 1 9 . 2. 3 . 1. 1 2 . 2. 6 3 . 9. 2. 3 4 . 8. 1 3 . 1. 3 . 0. 1 5. 4. 6 7 . 4. 3. 3 2 . 3. 1 7 . 9. 4 . 0. 1 3 . 0. 6 0 . 6. 4. 3 4. 4. 1 8. 4. 4 . 0. 1 6 . 0. 6 3. 4. mean : tS D. 3 4 . 5 土1 . 8. 1 7 . 2 : t2 . 8. 3 . 5. 1 4 . 2. *P<0 . 0 5 s t a n d a r dd e v i a t i o n. 6 3 . 8. : t1 . 8. : tO . 6. : t2 . 8. SD. T h ep r e c e n to fb a c t e r i o i m m u n o l y s i swasc o u n t e da f t e r2h r si n c u b a t i o na t3 7C w i t h4k i n d so f20% p o o l e ds e r a T h ec a l c u l a t i o ni sa sf o l l o w s T h ep e r c e n to fb a c t e r i o i m m u n o l y s i s =( m e a nc p mo fs u p e r n a t e / m e a nc p mo ft o t a lb a c t e r i a )X 1 0 0 . 0. 6 . 分離した O 抗原 . K抗原の組成 U-1 C01:H7:K1( ー):F 11 :P-f (+) :hemolysin( 一 ) ) . U-4 C06:H. ( 一 ) :K 1( 一 ) :F12 :P-f (+) :hemolysin ( 一 )) . U -5 C075:H ( 一 ) :K 1: F7:P-f (+):h巴molysin (一)). B-1 C044:H18:K74:P-f ( + ) :hemolysin (一)). B-2 C014:H( 一) :K7:P-f (+) :hemolysin( 一 )) の菌株を用い. て，それぞれ 0， 1 06，075，044，014の抗原を抽出し，さらに Y-2C02: ー) :α-hemolysin(+)) • B-1 ， B-2の菌株を用いて. K， 1 H4:K1:P-f( K 74，K7の抽出を行った . Y-2 C02 :H4:K 1:P-f ( 一 ) :α-hemolysin(+))から分離した K1抗原を. 感作した赤血球は，抗 B群髄膜炎菌家兎血清で 256倍希釈血清まで凝集を示したが，抗大腸菌 02家兎血清では全く凝集を示さなかった . 一方 . U-5 C075:H ( ー ) :K1:F7:P-f (+) :hemolysin (一))から分離した 075抗原は，. 抗大腸. 菌 075家兎血清では1， 024倍まで強い凝集を示したが，抗 B群髄膜炎菌家兎血清 BA 句. 庁. i.

(20) ζ i は凝集は見られなかった . 他の O抗原 .K抗原についても，同様に感作赤血. 球凝集反応で持異抗血清との反応をみたが，同様の結果であった.. Fig.3 Immunodiffusion f i g u r e by t h e Micro-Ouchterlony a s s a y . To t h e c e n t e r w e l l was added 1 0μ l o f 075 antigen(500 匂勿.e) e x t r a c t e d f rom U-5 の75:日(一) :K1:F7:P-f (+) :hemolysin(一)). The same volume o f anti-E. c o l i U-5 r a b b i t antiserum. anti-075 r a b b i t antiserum. 0.15M/l NaCl. and a n t i-group B neisseria meningitis r a b b i t serum were put i n t o t h e w e l l s N u1 ， 2 ， 3 and 4， r e s p e c t i v e l y . The c e n t r a l antigen c r e a t e d an i d e n t i c a l p r e c i p i t a t i o nl i n e a g a i n s t t h e w e l l s N u1 and 2 . QU.

(21) 075抗原を中心の w e l l IL:入れ， U-5(075:H C 一) :K1:F7:P-f C +): hemolysinC 一 )J加熱死菌 ( 抗大腸菌 075) 血清ならびに U-5生菌免疫血清 e l l1 [ .いれた Micro-Ouchterlony法では，両 (抗大腸菌 075K1) を周辺の w w e l l との聞に共通した一本の沈降線が認められた CF i g .3) . 分離精製した O 抗原， K抗原乾燥重量 1 0 0μgを 1 n aの蒸溜水 i と溶解して，. exose，シアノレ酸，蛋白， h. 2 3 0 . 2 6 0 . 280nmの吸光度について測定した結果. を T able 9に示した . 蛋白量はいずれの O抗原， K 抗原も dry weight 100μg あたり 5μg以下であったが， h exose は 5種の O 抗原では 25~ 5 0 μg/100噌. dry weightと比較的多く含まれていた .K抗原では K74は 3 5 μ: g / 1 0 0μg dry weight と多く含まれていたが， Kl， K7は感度以下であった . シアル酸は O 抗原では検出できず， K1では 7 0噌 1100μg dry weight と多量に含まれてい. . 6 μg/100噌たが， K7では 5. dry weight と少量で， K74では感度以下であっ. た. 100μg叫の O抗原溶液の吸光度は，いずれも 260nmで peakを示し，. 0 . 2 0~ 0 . 3 8の間であった. 1 0 0 μ g / n aの K抗原溶液の吸光度は，いずれも 230nm が peakで 0 . 0 5~ 0 . 1 7の間であった .. Endotoxin活性は， 0 抗原ではいずれも 5X1 04 endotoxin u n i t CEU)/na 以上と高値であったが， K 抗原ではいずれも 64~319EU 勿t を示したに過ぎなかった C Table 9) .. Table 9 Composition o f e x t r a c t e d various 0， K antigen o f E. c o l i. oantigen 01. 06. 075. 0 . 1 4. 044. K1. K antigen K7. K74. 2. 4. 3 . 0. 4 . 0. 3 . 8. 2 . 8. ND. ND. ND. 3 8 . 0. 3 3 . 0. 4 0 . 0. 2 5 . 0. 5 0 . 0. ND. ND. 3 5 . 0. ND. ND. ND. ND. ND. 7 0 . 0. 5 . 6. ND. Al~~_ 2 3 0 n m.. 0 . 1 0 1. 0 . 1 9 4. 0 . 2 0 0. 0 . 1 3 7. 0 . 1 8 6. 0 . 0 5 7. 0 . 0 8 9. 0 . 1 6 5. A~~~ 2 6 0 n m A1cm 2 B On m. 0 . 2 0 9. 0 . 3 6 6. 0 . 3 5 7. 0 . 2 0 5. 0 . 3 7 5. 0 . 0 2 9. 0 . 0 5 6. 0 . 1 1 1. 0 . 1 1 3. 0 . 1 9 1. 0 . 1 9 1. 0 . 1 1 6. 0 . 1 9 2. 0 . 0 1 9. 0 . 0 4 2. 0 . 1 0 0. Endotoxin'2 (EU/ml). s c a l e over. s c a l e over. s c a l e over. s c a l e over. scale over. 319. 64. 1 1 0. ・ hexose・ s i a l i ca c i d・ proteln 1 1. 1. Absorbance'2. ・EU/ml 以よ s c a l eo v e r:5x1 0 *1μg/10 0~ 9d r yw e i g h t. 本. ND:n o td e t e c t a b l e 2 '100μ9d r ywieght/m ld i s t i l l e dw a t e r. -1 9-.

(22) 7 . 0 抗原， K 抗原を刺激物としたときの多核白血球ルミナーノレ依存性 C.L. 活性の測定. P e a kC .し v a l u e ( X 1 0 .cpm). 300 250 200 1 5 0 1 0 0 5 0. o. 2 0. 5 01 0 0. 5 0 01 0 0 0(阿 /ml) c o n c e n t r a t i o no f06a n t i g e n. Fig.4 The p巴ak v a lu e s o f luminol dependent chemiluminescence o f PMN stimulat巴d by various conc巴ntrations o f 06 antigen. A maximum peak C .L . value was obtained by 750t号~/me o f 06 antigen. U-4菌株から抽出した 06抗原を凪いて反応管内の O 抗原濃度 20， 50， 100， 250， 500， 750，， 10 00μg/meで C.L.活性を測定した . peak C .L . 値は O 抗 0 μg / m eから上昇し始め，原量が 5. C .L.を示し，. 7 5 0 μg / m eでは 1 6 3 . 5 (x104cpm) と最も強い. 1 ， 000μg制では 1 5 5 . 0 (x1 04cpm) と低下した (F ig .4) .U-1 ，. U-4， U-5 ， B-1 ， B-2からそれぞれ分離した O 抗原， 0， 1 06，075，044 ， 014の 250μg他tでの peak C .L .値を測定した結果は， 01抗原では 1 0 5 . 7士 1 3 . 0 (X104cpm)， 044抗原では 1 0 6 . 7: 1 :21 .4(x104cpm) と高い多核白血球円ノU. n u.

(23) C .L . 刺激性が認められ，他の抗原の場合と比べて有意な差が見られた CTable 10) . Table 10 The peak values of luminol dependent chemiluminescence of PMN stimulated by various 0 antigens. ド I h L ¥ m ¥ a nD P a M n t Ng 、e n ¥. 01. 06. 075. 044. 014. 22Y f. 4 99.. 82. 4. 3 9 . 3. 9 4 . 3. 8 2 . 3. 29Y m. 8 5 . 8. 7 0 . 3. 23. 4. 1 0 9 . 2. 7 0 . 3. 28Y m. 7 117.. 6 6 . 8. 35. 4. 1 3 3 . 1. 1 0 5 . 9. 33Y m. 1 0 6 . 2. 7 7 . 7. 1 9 . 9. 1 0 7 . 9. 6 3 . 9. 20Y f. 8 1 . 1. 6 9 . 5. 2 3 . 1. 6 9 . 5. 5 0 . 1. 27Ym. 1 1 2 . 2. 9 1 . 3. 4 1 . 1. 9 5 . 3. 7 8 . 5. 34Y m. 1 1 7 . 9. 9 2 . 3. 2 9 . 5. 1 2 1 . 6. 4 88.. 3 1Y m. 109‘1. 9 3 . 1. 2 4 . 3. 9 7 . 0. 52. 4. 28Y m. 1 1 5 . 2. 1 1 7 . 5. 6 3 . 5. 1 4 2 . 9. 1 1 9 . 1. 27Y f. 1 1 2 . 0. 5 9 . 8. 4 4 . 1. 9 5 . 9. 4 7 . 9. 34. 4 土1 3 . 3. 1 0 6 . 7 : t21. 4. 7 5 . 9 : t23.9. mean. : tSD. 1 0 5 . 7 8 2 . 1 土1 3 . 0 : t17.0. iu11. ，-------，本. *. 1. *. 1Pく0 . 0 5 2Pく0 . 0 0 1 PMN p o l y m o r p h o n u c l e a rl e u k o c y t e， SD s t a n d a r dd e v i a t i o n f e m a l e， Y:y e a r so l d m m a l e， T h ed a t ai n d i c a t e sp e a kC .L .v a l u e(x1 0 'cpm)s t i m u l a t e db y250μ9d r y weight/m l( f i n a lc o n c e n t r a t i o n )o f0 a n t i g e n .. Y-2から分離抽出した K1抗原を用いて反応管濃度 10， 25， 50， 100， 250， 500μg~ でC.. L .活性を調べた . peak C .L .値は K 抗原量が 10μg/meから軽度. の上昇傾向が見られ，. 25μg/m~ から急激に上昇し，. 250μ: g / m eで 285.2 (x104cpm). 円/日目.

(24) Peak C .L .v a l u e (x1 Q 4cpm). 300. 200. 100. 。. 20. 50 100. 500 1000 (円 /ml). c o n c e n t r a t i o no t K1a n t i g e n f luminol dependent Fig・5 The peak values o chemiluminescence o f PMN stimulated by various concentrations o f K1 antigen. A maximum peak C .L. v a lu e was obtained by 2 5 0噌 I m . eo f K1 antigen.. と最高値を示し，. 500μg/ m.eでは 2 26. 4 (x104cpm) と低下した ( F i g .5).y-. 2， B-1 ， B-2からそれぞれ分離した K 抗原， K， 1 K74 ， K7 1 0 0 μg / m . e で刺激した多核白血球 p巴a k. C . L .値は， K1抗原では 202.8士 69.7 (X104cpm)，. K74抗原では 254. 4 : t5 9 . 1( x104 cpm) と K7 抗原に比べてきわめて高い値をとった ( p<O.Ol) (Table 11).. ，白. 臼つn.

(25) Table 1 1 The peak values of luminol dependent t imulated by chemiluminescence ηf PMN s various K antigens.. ¥ a n ¥FMK Nant ¥g 、 e n h UrT. 2 6Y. 打1. 1. K7. K7 4. 1 7 8 . 0. 5 5. 4. 2 2 9 . 4. く￨. 2 1Y. f. 1 8 6 . 7. 4 5 . 6. 2 6 5 . 5. 2 9Y. 打1. 1 8 4 . 6. 3 4 . 3. 2 4 4 . 7. 26Y. 町1. 1 4 3 . 5. NE. 204. 4. 2 8Y. 打1. 3 4 2 . 2. 5 0 . 1. 3 1 7 . 2. 2 7Y. 町1. 2 4 0 . 9. 5 4 . 9. 3 4 2 . 3. 3 3Y. 町1. 1 4 3 . 6. 2 5 . 3. 1 7 7 . 5. 2 0 2 . 8 : t69.7. 4 4 . 3 : t1 2 . 1. 254. 4 +59.1. mean. +SD. L*~ し*~ 本. P < O . O l. PMN p o l y m o r p h o n u c l e a rl e u k o c y t e . NE n o te x a m i n e d m m a l e . f e m a l e. Y:y e a r so l d SD s t a n d a r dd e v i a t i o n Thed a t ai n d i c a t e sp e a kC .L .v a l u e(X 1 0 'cpm) s t i m u l a t e db y fi n a lc o n c e n t r a t i o n )o fK a n t i g e n 100μ9 d r yweight/ml (. 考案大腸菌の O抗原 .K抗原検査には赤血球凝集反応や菌体凝集反応，さらには phage typing など様々な方法が利用されている . 今回の実験に使用した抗大. 腸菌 O家兎血清は，当科で作成した血清 . Difco 社製とも加熱死薗 ζ i 対して. 640~ ， 1280倍まで凝集を示し，いずれも他の O 抗原型の加熱大腸薗とは交文反円ペU. 円ノu.

(26) 応を認めず，また，. B群髄膜炎菌家兎血清を用レた生菌の大腸菌との菌体凝集. 20倍希釈血清まで凝集を認め，他の K 抗原株と反応でも， K1抗原保有株は 3 i は大腸菌 K1抗原と免疫学的に交は交叉反応、を認めなかった. B群髄摸炎歯 ζ. 叉する抗原の存在が知られており. 18， 25. 今回の抗血清による菌体凝集反応での. O 抗原， K抗原型検査は信頼 i 乙足ると考えた. 臨床分離株の抗原型と病型の闘係を見ると，尿路感染症特異 O抗原と言われ. o，1 02，04，06，07 5の抗原のうち， 0 1抗原が APN，CPNの上部尿. る. 路感染症で多く検出され， K1抗原を保有する大腸菌はた.また，. APNで多く出現してい. P-f陽性大腸菌も APNで多く検出された .. このように特定の O抗原が上部尿路感染症で多く検出される理由としては，これらの O 抗原保有大腸菌が P-f抗原や hemolysin を多く有するためと考えられておりし 26. 0抗原はこれらの毒性因子のマーカーであると言われている 27. 今回の我々の結果でも，検討した尿路感染症特異 O抗原保有大腸菌に K1抗原または. P-f抗原を保有する頻度は APNで有意に高かった . さらに，これらの. O抗原のうち， 0 1抗原保有大腸菌に P f抗原を同時に保有する頻度が高かったことは， 0抗原がマーカーであるという説を裏づけるものではないかと考えられた. 一方， K1抗原保有大腸菌については，. APNや新生児細菌性髄膜炎の起炎薗. として認められることが多く，生体の免疫反応 i 乙抵抗する大腸菌の毒性因子の 29 ーっとして従来より報告されてきため， 28，. また， P-f 保有大腸薗は，上部. s-D-Galからなる受容体に特異的ζ i接着し 30 尿路枯膜の α-D-Gal一(1→ 4)尿路感染の初期段階 i 乙重要な因子と考えられている人これら K1抗原， P-f 抗原は p y e lo n e p h r iti s で多く検出されると数多く報告がみられ l J，28， 30，今回の結果もよく一致していた. しかし， 0 抗原や K抗原などの毒素因子が生体に及ぼす影響についてはこれまであまり検討されていない.そこで，これらの諸抗原を持った大腸菌を使っ容菌反応を検討した.さらに，抗原を抽出して多核白て多核白血球機能，血清 i i 対する刺激性を検討し， 0 抗原や K抗原の生体防御機能 i 乙対血球 C.L. 反応 ζ. する反応性を検討した. L 円. A せ.

(27) 3H-Lysine で l a b e ! した大腸菌の標識率は 0 . 9~ 2 . 4x10-5cpm/CFUで， M i l l e r ら1 3の S t a t h y l o c o c c u s a l b u s への標識率 3 . 8~ 7 . 5x10-4cpm/CFUと比べてかなり低かった.しかし，これは，一方がグラム陰性梓菌であり，他方がグラム陽性球菌と細菌の性状が大きく異なっているので，単純に標識率が悪いと判断できないと考えられる. 健常人の多核白血球の経時的貧食率では，. 3 0分後に最大の貧食率を認めた .. 乙れは， M iller ら1 3， Peterson ら1 4の報告と同様で，多核白血球の菌の摂取は短時間のうちに完了すると考えられた . 大腸菌の 30分後の貧食率を検討した結果，. y-1(01:H7:K1:P-f (一) :α-hemolysin(+)Jと B-2 (014:. H( 一 ) :K7:P-f ( + ) :hemolysin(一)Jの 2種の大腸菌が，他の U-5， Y-2， B-1に比べて，貧食率が低かった.一般に， K抗原を持つ大腸菌は，多核白血 1， 3 2 特に K1抗原保有大腸菌は貧食球の貧食に抵抗性を持っと言われており 3 に対する抵抗性が高いという報告もある 3 3. しかし，今回の結果では，必ずし. も K1抗原陽性大腸菌がすべて他の抗原を持つ大腸菌に比べて貧食率が低いとは限らなかった.一万，多核白血球の貧食 i 乙対する大腸薗の抵抗性については，. O 抗原， outer membrane も関与する 3 3 と言われている.また，貧食能は尿の浸透圧が 500mOsml 旬以上では極端に低下することも指摘されており 3 4 実際の炎症の場では K抗原以外の薗体抗原や周囲の環境因子も関与して，多核白血球による貧食率を複雑に変化させると考えられる.. Pooled serumによる大腸菌の免疫溶菌反応は，血清濃度の変化に伴って溶菌率が増加し，. 2 0~杉の濃度の血清で. plateau. ζ I達した . 非働化血清では，. pooled serumの時の 5%前後の溶菌率しか認められなかったことから，. この. hermolabile opsoninが主要な役割を血清による溶菌反応は補体活性などの t 担っていると考えられた . 20%の濃度の血清による種々の大腸菌の溶菌率は，. K1抗原保有大腸菌群が，腸管病原大腸菌の B-1 (044:H18:K74:P-f (十) :hemolysin(一)Jとともに標準株大腸菌の B-2に比べて有意に低い溶菌率を示し，血清抵抗性が認められた . しかし，同じ K1抗原保有株でも， U-5( 075. :H( 一) :Kl:F7:P-f ( 十 ) :h emolysin(一)J， Y-2(02:H4:K1:P-f(一) a-h emolysin(+)J， y-1の順で溶菌率は. 3 . 5~ 3 4 . 5% と大きな聞きがみら. Fhu. 臼つ.

(28) れた. K1 抗 j 京伝有大腸閣が血清の殺菌容菌作用ζ i対して抵抗性を示す報告は以前から知られている. lh， 3 3，めが，血清溶調反応 ζ iは. K1抗原だけでなく， smooth. 1 i popolysaccharides も重要な関与をしていると言われているお， 36.Hughes C . ら3ti は，尿路感染症起炎大腸閣の O抗原の種類と血清の免疫溶菌反応 i 乙対する抵抗性について検対し， 01，02，04 などの O抗原保有大腸薗は血清の溶菌反応ζ i対して感受性株が多いと述べており，今回の結果は，. 0抗原の種類の違い. も関'系していたと考えられる. このように，大腸菌の各抗原が生体に及ぼす影響を検討した，これまでの報告では，生菌全体を使用した実験系が多いため，他の抗原の影響を無視できない.そこで， 0 抗原， K 抗原の分離精製を行い . 0抗原 . K抗原の白血球膜に対する刺激性を検討した.分離抽出したいずれの抗原も感作赤血球凝集反応で乙反応が見られた . また . 0抗原は Micro-Ouchterlony でも特異特異抗血清 i. O血清と一本の沈降線を認めており，その組成もトキシカラーテストで 50， 000 EU/m -e以上の高い endotoxin活性を保ー有していた . K抗原はトキシカラーテストで 300EU/m -eまでであったが. 1EU/ m eは E.c o l i 0111:B4の 354pg/m e -I 乙相. . 1% 以下である . K1抗原はシアル酸含量当するので， endotoxinの混在量は 0 が多く，今回の抽出した. O抗原 .K抗原は，諸家の報告と類似した組成を示し. ており，充分精製された抗原が採取されたと考える. これらの抗原を刺激物として多核白. B球 C.L. を測定したところ， 0 抗原で. は 01抗原と 044抗原が，他の抗原型ζ i比べて有意に高い C .L .活性を示した .. O抗原は，その主成分である 1 i popolysaccharide のうち 1 i p i d Aが白血球膜を刺激し，白血球機能 i 乙影響を及ぼす本体であると考えられており 3 7 . 3 8 (j抗原の種類による白血球膜刺激性の差は l i p i d Aの含有量の違いという報告 3 8もある . 今回の結果は . 01抗原. 044抗原が，他の O 抗原 i 乙比べて多核白血球活性酸素産生刺激性が高いことを示していると考えられた . 一方 K抗原では，. K1抗原と K74抗原が標準株の K7抗原 i 乙比べて有意に高い多核白血球産生刺激性を持つことが認められた. C .L.. .K抗原の多核白血球ζ i対する刺激性につ. いては，今凪のような K抗原を分離して比較した報告は検索した範囲では認められず，大腸菌の菌体を使って活性酸素産生を測定した報告 " によると . K抗円ノU. phu.

(29) 原の種類による年:は見られなかったという結果が得られている.しかし，この報告に見られるような直接菌体を用いた結束は他の抗原の影響も考慮する必要がある . 従って，今回の結果は K抗原の種類による白血球膜刺激性に差異のあることを示す有力な所見と考えられる. 以上，臨床分離株の表現型の分析結果から，上部尿路感染症惹起性大腸菌には特定のごく限られた大腸菌クローンが存在することがうかがわれた.これら. eceptor I 乙付着し. K1抗原を持つ菌では，の菌は P-f で上部尿路粘膜細胞の r 血清による免疫溶薗反応に抵抗性が強く，特定の O抗原や Kl抗原を持つ菌でと際して強い活性酸素を産生させ，感染局所の強いは，多核白血球による貧食 i 組織障害を惹起するものと推察された.. 謝辞稿を終えるにあたり，御指導・御校閲を賜わった牧. 淳教授に深謝いたしま. 乙御指導いただいた宮田噴助教授，ならびに検体採取など種々す.また，直接 i のご協力をいただいた小児科学教室員御一同，ならびに中央臨床検査部細菌検 . c o l i の血清型同定をしていた査室の諸氏に感謝します . 本研究にあたって，E .c o l i の分与をしていただいた国立予防衛生研究所細菌第 1部だき . E. 一先生. E .. COll. 坂崎利. の分与をしていただいた国立大阪大学付属微生物研究所菌株保. 存室三輪谷俊夫先生，本田武司先生 .B群髄膜炎菌家兎血清を分与していただいた神奈川県衛生研究所. 山井志郎先生，松崎稔先生 i 乙謝意を表します.なお，. 本論文の要旨は，第 32回日本腎臓学会総会 ( 平成 1年，浜松).第 22同日本小児感染在学会 ( 平成 2年，東京).第 26回日本小児腎臓病学会 ( 平成 3年，札幌〉で発表した.. 円/臼. i 可.

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